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Methodenartikel

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung

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DOI:

10.3791/55453

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24. März 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Neue Modelle und Assays, die den frühen Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente der nächsten Generation verbessern würden, sind sehr wünschenswert. Hier beschreiben wir einen schnellen, kostengünstigen und BSL-2-kompatiblen Assay zur Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mycobacterium tuberculosis, der leicht für das Hochdurchsatz-Screening angepasst werden kann.

Zusammenfassung

Der frühe Prozess der Arzneimittelentwicklung für Anti-Tuberkulose-Medikamente wird durch die ineffiziente Umsetzung von Verbindungen mit In-vitro-Aktivität in die Wirksamkeit im klinischen Umfeld behindert. Dies ist wahrscheinlich auf eine mangelnde Berücksichtigung der physiologisch relevanten zellulären Penetrationsbarrieren zurückzuführen, die im infizierten Wirt vorhanden sind. Wir haben kürzlich ein alternatives Infektionsmodell etabliert, das große Makrophagen-Aggregatstrukturen erzeugt, die dicht gepackte M. tuberculosis (Mtb) im Kern enthalten und sich für Empfindlichkeitstests von Medikamenten eignen. Dieses Infektionsmodell ist kostengünstig, schnell und vor allem BSL-2-kompatibel. Hier beschreiben wir die experimentellen Verfahren zur Generierung von Mtb/Makrophagen-Aggregatstrukturen, die Makrophagen-passageiertes Mtb für Arzneimittelempfindlichkeitstests produzieren würden. Insbesondere zeigen wir, wie dieses Infektionssystem direkt an das 96-Well-Plattenformat angepasst werden könnte, was die Durchsatzfähigkeit für das Screening von Wirkstoffbibliotheken gegen Mtb zeigt. Insgesamt ist dieser Assay aufgrund seiner Einfachheit, Kosteneffizienz und Skalierbarkeit eine wertvolle Ergänzung der derzeit verfügbaren Mtb-Wirkstoffforschungs-Toolbox.

Einleitung

Tuberkulose (TB) bleibt eine ernsthafte globale Bedrohung für die Gesundheit trotz der Verfügbarkeit von Anti-TB - Chemotherapien seit über 40 Jahren ein. Dies ist zum Teil auf die Forderung nach langen Behandlungszeiten von mehr als 6 Monaten mehrere Arzneimittelkombinationen, die die Nichteinhaltung 2 zu Patient führt. Die Entstehung von arzneimittelresistenten TB in den letzten Jahren hat weitere Probleme in einem Bereich verstärkt , in der erfolgreiche Entwicklung klinisch zugelassenen Medikamente 3 praktisch nicht existent ist. Denn trotz erschöpfende Anti-TB - Medikamentenentwicklung, nur ein einziges Medikament für die klinische Anwendung FDA gewesen 4 in den letzten 40 Jahren zugelassen. So werden neue Generationen von Anti-TB-Medikamente sind dringend erforderlich, um dieses Problem zu lösen.

Ein wesentliches Problem bei der TB Drug Discovery ist der Mangel an erfolgreichen Transfer von Verbindungen mit in - vitro - Aktivität zur Wirksamkeit in der klinischen Einstellung= "Xref"> 5, 6, 7. Zunächst wurden Zielbasierte Ansätze verwendet 5 für Anti- Mtb Drogen zu screenen, die in ganze Bakterienzellen zu übersetzen ist fehlgeschlagen. Selbst wenn Mtb - Zellen verwendet werden, wird es oft durchgeführt Brühe gewachsenen Kulturen verwendet, die nicht genau Arzneimittelwirksamkeit in vivo 8, 9 vorherzusagen. Diese Probleme wurden erkannt und Wirkstoff - Screening - Assays gegen Makrophagen enthalten , Mtb oder latent Mtb wurden erfolgreich etabliert 8, 10, 11, 12. Aber auch diese erweiterte Tests geben keine ausreichende Berücksichtigung der Durchdringung Barrieren, die Drogen in den nicht-gefäßLungenLäsionen auftreten, und in der Nekrosen an der Stelle der Infektion. Tatsächlich, Auch für die First-Line - TB - Medikamente Rifampicin, suboptimale Dosierung wurde 13, 14, 15 als auch in vivo Gewebe und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) Penetration aufgrund unzureichender in Frage gestellt als Wirksamkeit gegen intrazelluläre Mtb 8 verringert, 9. Als solche neue Modelle und Tests, die Berücksichtigung dieser Parameter während der frühen Führung Entwicklungsprozess zweifellos TB Drug Discovery nehmen würde Anstrengungen verbessern würde.

Um diesem Bedarf zu begegnen, wir eine kostengünstige, schnelle und BSL-2 - kompatible Alternative Infektionsmodell für Mtb Arzneimittelwirksamkeitsprüfung 16 vor kurzem etabliert. Diese Infektionsmodell produziert dicht Mtb verpackt in großen Makrophagen Aggregatstrukturen, die physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren rekapituliert und erzeugt Makrophagen-agierten Mtb mit einem veränderten physiologischen Zustand latenten Mtb ähnelt. Mtb von dieser Infektion Modell abgeleitet wurde mit dem Resazurin Mikrotitertest (REMA) kombiniert Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten, die mit der berichteten Fähigkeit von gemeinsamen TB - Medikamente Ergebnisse im Einklang mit anderen intrazellulären Infektionsmodellen und korreliert gut produziert hohen CSF - Konzentrationen in Bezug auf Serumkonzentrationen erzielen 16.

Hier beschreiben wir ausführlich in der Erzeugung von Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen Makrophagen-agierten Mtb geeignet für die Arzneimittelempfindlichkeitstests unter Verwendung von REMA herzustellen. Insbesondere zeigen wir, wie diese Infektion System auf eine 96-Well-Format für die Kompatibilität mit Durchsatz-Screening von Kandidaten-Anti-TB-Medikamente angepasst werden könnte.

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Protokoll

HINWEIS: M. tuberculosis mc 2 6206 ist ein avirulenten Stamm 17, 18, alle Arbeiten in diesem Protokoll kann in einem Biosafety Level 2 - Anlage (BSL-2) durchgeführt werden.

1. Kulturbedingungen für Green Fluorescent Protein exprimieren M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb -GFP)

HINWEIS: Die M. tuberculosis H37Rv - auxotrophe Stamm mc 2 6206 abgeleitet (Δ panCD, Δ leuCD) , transformiert mit dem Plasmid gfp pMN437 exprimierenden 16 in diesem Protokoll verwendet wird. Es ist möglich , die Mtb -GFP Stamm mit nicht - GFP - exprimierenden Wildtyp - Stamm zu ersetzen für Forscher leichter Zugänglichkeit des Stammes zu ermöglichen. Allerdings ist die GFP - Expression wünschenswert visuelle Bestätigung der Phagozytose und die Bildung von Mtb / Makrophagen - Aggregate zu ermöglichen. Für long Zeitlagerung, Mtb -GFP wurden ergänzt mit 20% Glycerin bei -80 ° C in vollständiger 7H9 Medium (in Schritt 1.1 beschrieben) eingefroren.

  1. Bereiten vollständige Mtb -GFP Medien (7H9-C) durch Ergänzung 7H9 - Medium mit 10% OADC Middlebrook, 0,02% Tyloxapol, 24 ug / ml D-Pantothensäure, 50 ug / ml L-Leucin und 50 ug / ml Hygromycin B.
  2. Ein Fläschchen mit Mtb -GFP auftauen und in einem 30 ml quadratischem Boden PETG Kolben auf 10 ml 7H9-C hinzufügen.
  3. Bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler (50 rpm). Nehmen Sie Messungen der optischen Dichte (OD 600) alle paar Tage , bis die OD 600 erreicht 1,0 (ca. 5-8 Tage).
  4. Verdünnen und Passage Kultur nach Bedarf eine OD 600 zwischen 0,2 bis 1,0 zu halten.
  5. Zur Infektion eine etablierte Kultur der Mtb -GFP innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von 0,6-1) verwenden. Um klumpig Kulturen zu vermeiden, beschallen die Mtb Kulturflasche in einem Wasserbad (130 W, 3 x 5 s Pulse) ONCe oder zweimal pro Woche

2. Kulturbedingungen für THP-1-Zellen

  1. Bereiten vollständige THP-1-Zellmedium (RPMI-C) von RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES ergänzt.
  2. Inkubiere Zellen in einem T-75 - Kolben bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2.
  3. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder Durchflusszytometrie jeden zweiten Tag und aufrechtzuerhalten THP-1-Zellen in einer Dichte zwischen 0,1 bis 0.600.000 pro mL.

3. Infektion Protokoll zum Generieren Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen

  1. THP-1 Zellpräparation (pro 96-well - Platte)
    1. Zentrifuge 7 x 10 6 THP-1 - Zellen bei 250 xg für 5 min. Resuspendieren in 7 ml RPMI-C.
  2. Mtb -GFP Vorbereitung
    1. Zentrifuge 2,8 x 10 8 Mtb -GFP bei 3.200 xg für 5 min in einem Schwenkbecherzentrifuge ueine Umwandlung von 1,0 OD 600 = 3 x 10 8 Bakterien / ml singen.
    2. Wasche einmal mit RPMI-C und zentrifugiert wie in Schritt 3.2.1.
    3. Resuspendieren in 7 ml RPMI-C und 10 s vortexen.
  3. Infektion
    HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für eine Vorlage.
    1. Vorbereiten eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Zugabe von 200 & mgr; l sterilem Wasser in den Reihen A und H und Spalt 1 und 12 für eine Wasserverdampfung von Felgenkulturmedium zu verhindern.
    2. Füge 200 & mgr; l RPMI-C, bis Spalte 2 (B2 bis G2) für die Hintergrundkontrolle (Blank).
    3. Mtb -GFP Suspension (Stufe 3.2) zu THP-1 - Zellsuspension (Schritt 3.1) und gut mischen durch Pipettieren zu infizieren, hinzuzufügen. Die endgültige THP-1 Zelldichte beträgt 5 x 10 5 pro ml , und die entsprechende Vielzahl der Infektion ist 40.
    4. Gießen Sie die THP-1 / Mtb -GFP Suspension in einem 25 - ml - Reservoir.
    5. In 200 ul THP-1 / Mtb -GFP Suspension auf die restlichen 96 Vertiefungen (B3 bis G11) usinga Mehrkanalpipette.
      HINWEIS: Wenn mit mehreren 96-Well - Platten arbeiten, resuspendieren regelmäßig die restlichen THP-1 / Mtb Suspension in dem Vorratsbehälter eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten , zu jeder Vertiefung zugegeben.
    6. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-10 Tage.
    7. Änderungsmedien alle 2 Tage durch langsames Entfernen 100 ul verbrauchtes Medium von der Oberseite jeder Vertiefung und sanft Zugabe von 100 & mgr; l vorgewärmtes RPMI-C einen Mehrkanal-Pipette. Resuspendieren Sie nicht Brunnen und stören die Mtb / Makrophagen - Aggregate auf dem Boden der Wells.
    8. Sichtprüfung der Vertiefungen durch Fluoreszenzmikroskopie (4-10 x Objektiv) täglich, Kenntnis von der Größe von Mtb / Makrophagen - Aggregate nehmen. Am Tag 7-10, sollte Mtb / Makrophagen - Aggregate ausreichend groß sein (siehe 2 für die Bezugnahme auf Abbildung) für die Arzneimittelwirksamkeitsprüfung (Abschnitt 4) , um fortzufahren.
    9. Falls gewünscht, können die Aufnahmen der 96-Mulden eine automatisierte Cell Imaging System ausgestattetmit Hellfeld und GFP - Filter setzt Mtb / Makrophagen - Aggregatbildung zu dokumentieren.
      HINWEIS: Wenn die Benutzer keinen Zugriff auf ein automatisiertes Imaging-System haben, Bilder von repräsentativen Brunnen mit GFP und Hellfeld-Funktionen unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Mikroskop aufgenommen werden.

4. Growth Inhibition Assay zur Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mtb Beurteilen von Mtb / Makrophagen - Aggregates Abgeleitet

  1. Arzneimittelzubereitung (dreifacher Ausfertigung Bedingungen für zwei Medikamente)
    HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für Vorlage.
    1. In einem separaten 96-Well-Platte, fügen Sie 125 ul 7H9-C Medien B2 bis zu G10.
    2. Bereiten zwei Medikamente bei der doppelten höchsten gewünschte Endkonzentration in 1 ml 7H9-C für die Verdünnung zu berücksichtigen, in Schritt 4.2.4.
    3. In 250 ul jeder Droge in die Vertiefungen B11-C11-D11 und E11-F11-G11, die jeweils für drei Exemplaren Behandlungen.
    4. Verwendung einer Mehrkanalpipette, seriell dilute die Testmedikamente zweifach um 125 & mgr; l von B11-G11 in B10-G10 bewegt. Mischen durch Pipettieren 5 mal bei jedem Schritt.
    5. Weiter 125 & mgr; l von einer Spalte zu bewegen (von rechts nach links) über die Platte, und nicht mehr, nachdem Spalte 4.
    6. Nach dem Mischen Spalte 4, verwerfen 125 & mgr; l in einen Abfallbehälter. Die Spalten 2 und 3 sollten keine Medikamente enthalten, die für die Verwendung als Hintergrund (Blank) und positive Wachstumskontrollen zu ermöglichen.
      Hinweis: Alternativ folgen Vorlage in 1B zum Testen Droge Bibliotheken. Jede 96-Well-Platte 58 Medikamente in einer einzigen Konzentration aufnehmen kann. Bereiten Sie dieses Medikament Platte doppelt um die gewünschte endgültige Konzentration verwendet wird, da es in der Mitte in Schritt 4.2.4 verdünnt werden.
  2. Medikamentöse Behandlung:
    1. Rufen Sie die 96-Well - Platte der Mtb - infizierten Makrophagen (Mtb / Makrophagen - Aggregate) enthält.
    2. dekantieren sorgfältig alle relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) mit einer Mehrkanalpipette.Führen Sie diese in einem zweistufigen Weise: zunächst 150 ul entfernen, ohne die Platte kippen, und entfernen Sie dann verbleibenden Medien (~ 50 & mgr; l) durch die Platte Kippen und die Pipettenspitze an den unteren Rand des Bohrlochs eingesetzt wird. Als Mtb / Makrophagen - Aggregate an der Unterseite des Schachts adhärenten sind, sollten kein Material verloren.
    3. Fügen Sie vorsichtig 100 ul 7H9-C Medien auf alle relevanten Brunnen (B2 durch G11) der Platte die Mtb / Makrophagen - Aggregate enthält.
    4. Verwendung einer Mehrkanalpipette, dann 100 & mgr; l aus der Arzneimittel enthaltenden 96-Well-Platte (Schritt 4.1) in die entsprechenden Vertiefungen der Platte Infektion.
    5. Platz in versiegelten Beutel und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C.

5. Quantifizierung der Wirksamkeit von Medikamenten den Assay Resazurin Mikrotitter Verwendung

  1. Bereiten Resazurin Stammlösung in einer Endkonzentration von 0,8 mg / ml in H 2 O. Man filtriert durch 0,22 um Porengrße PVDF - Membran für Sterilisierung.
  2. Bereiten Resazurin - Lösung von Resazurin Arbeitsstammlösung Mischen, H 2 O und Tween-80 (20% ige Lösung in H 2 O) in einem 2: 1: 1 - Verhältnis. Endkonzentrationen 0,4 mg / ml Resazurin und 5% Tween-80.
  3. Unter Verwendung eines Plattenlesegerät, ein Setup-Programm, um die Fluoreszenz bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission alle 30 min für 24 h bei 37 ° C gelesen. Vorwärmen Plattenleser auf 37 ° C.
  4. Fügen Sie 20 & mgr; l Resazurin Arbeitslösung zu allen relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) der arzneimittelbehandelten Platte (Schritt 4.11) eine Mehrkanal-Pipette.
  5. Legen Sie die Platte auf dem Plattenleser und starten Sie das Programm einrichten in Schritt 5.3.
    ANMERKUNG: Um die Verarbeitung von großen Mengen von Assayplatten zu erleichtern, ist es ausreichend, den Test in einem 37 ° C Inkubator zu entwickeln und auszuführen einzelne Fluoreszenz all 24 h liest. Dies gilt auch für Benutzer, den Zugriff auf einen Plattenleser nicht mit kinetischen und Inkubation Fähigkeiten haben.

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Ergebnisse

Um die Robustheit der Anpassung dieser Infektionsmodell auf 96-Well - Plattenformat bestätigen, untersuchten wir hier die Wirkstoffansprechverhaltens von Mtb abgeleitet aus unserer 96-Well angepasst Infektionsmodell Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) nach der Vorlage in Abbildung 1A. Wir zeigen , dass die Erzeugung von Mtb / Makrophagen Aggregatstrukturen Schlüssel zu diesem Assay kann zuverlässig in einer 96-Well - Plattenformat (Figur 2)...

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Diskussion

Hier haben wir im Detail eine alternative Mtb - Infektionsmodell geeignet für die Arzneimittelwirksamkeitstests beschrieben. Dieses Modell berücksichtigt zwei wichtige Faktoren , die eine stärkere Berücksichtigung in der frühen TB Arzneimittelentwicklung gegeben werden sollte: das Vorhandensein von physiologisch relevanten Hindernisse für Arzneimittelpenetration und metabolischen Veränderungen von Mtb während der Infektion. Während wir früher die Vorteile unserer Infektionsmodell gezeigt haben , und sc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Frank Wolschendorf für den Zugang zum automatisierten Speicherplatten-Reader Cytation 3. Diese Arbeit wurde teilweise durch den NIH-Zuschuss R01-AI104499 an OK finanziert. Teile der Arbeit wurden in den UAB CFAR-Einrichtungen und durch den UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core durchgeführt, die vom NIH/NIAID P30 AI027767 und vom NIH 5P30 AR048311 finanziert werden.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
7H9BD Difco271310Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT876120%ige Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
D-Pantothensäure, HemicalciumsalzSigmaP5710Bereiten Sie 24 mg/ml Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
L-LeucinMP Biomedicals194694von 50 mg/ml Stammlösung in H2O; Filter Sterilisierung von
Hygromycin BEMD Millipore400051Herstellung von 200 mg/ml Stammlösung in H2O
Nalgene Square PETG MedienflascheThermo Fisher2019-0030
RPMI 1640 MediumHycloneSH30027.01
Fötales RinderserumAtlanta BiologicalsS12450H
L-GlutaminCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytation 3 Plate ReaderBiotekAustauschbar mit jedem Fluoreszenzplatten-Reader und Mikroskop
Gen5 SoftwareBiotekAufzeichnung und Analyse von Rezasurin-Coversion
Rifampicin Fisher ScientificBP2679250von 10 mg/ml Stammlösung in H2O
MoxifloxacinHydrochlorid Acros Organics457960010Herstellung von 10 mg/ml Stammlösung in H2O
Resazurin NatriumsalzSigmaR7017Zubereitung von 800 μm; g/ml Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
Tween-80Fisher ScientificT16450020%ige Stammlösung in H2O; Filter sterilisieren
Herstellung Herstellung

Referenzen

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Makrophagen AggregatstrukturenWirkstoffempfindlichkeitspr fungResazurin Assay96 Well PlattenformatTHP 1 monozyt re ZellenBSL 2 kompatibles ModellHochdurchsatz ScreeningFluoreszenzmikroskopieViabilit tsfarbstoff
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