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Methodenartikel

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

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DOI:

10.3791/55456

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22. März 2017

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Zusammenfassung

Die direkte Reprogrammierung eines Zelltyps in einen anderen hat sich in letzter Zeit als mächtiges Paradigma für die regenerative Medizin, die Modellierung von Krankheiten und die Spezifizierung von Abstammungslinien erwiesen. Insbesondere die Umwandlung von Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten-ähnliche Myozyten (iCLMs) durch Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5 (GHMT) stellt einen wichtigen Weg zur Generierung von de novo kardialen Myozyten in vitro und in vivo dar. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass GHMT eine größere Vielfalt an kardialen Subtypen hervorruft als bisher angenommen, was die Notwendigkeit eines systematischen Ansatzes für die Durchführung zusätzlicher Studien unterstreicht. Bevor jedoch die direkte Reprogrammierung als therapeutische Strategie eingesetzt werden kann, müssen die mechanistischen Grundlagen der Abstammungskonversion im Detail verstanden werden, um spezifische kardiale Subtypen zu erzeugen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von iCLMs durch GHMT-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vor.

Wir skizzieren Methoden zur MEF-Isolierung, retroviralen Produktion und MEF-Infektion, um eine effiziente Reprogrammierung zu erreichen. Um die Subtyp-Identität von reprogrammierten Zellen zu bestimmen, beschreiben wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Durchführung der Immunzytochemie an iCLMs unter Verwendung eines definierten Satzes kompatibler Antikörper. Methoden zur konfokalen Mikroskopie, Identifizierung und Quantifizierung von iCLMs und individuellen atrialen (iAM), ventrikulären (iVM) und Schrittmacher-Subtypen (iPM) werden ebenfalls vorgestellt. Schließlich diskutieren wir repräsentative Ergebnisse prototypischer Experimente zur direkten Reprogrammierung und beleuchten wichtige technische Aspekte unseres Protokolls, um eine effiziente Linienkonvertierung zu gewährleisten. Zusammenfassend sollte unser optimiertes Protokoll einen schrittweisen Ansatz für Forscher bieten, um aussagekräftige kardiale Reprogrammierungsexperimente durchzuführen, die die Identifizierung einzelner CM-Subtypen erfordern.

Einleitung

Das Herz ist das erste funktionelle Organ im Embryo 1, 2 zu entwickeln. In Verbindung mit dem Kreislaufsystem, liefert sie Sauerstoff, Nährstoffe und einen Entsorgungsmechanismus bei der Entwicklung. Drei Wochen nach der Befruchtung, schlägt das menschliche Herz zum ersten Mal und seine angemessene Regelung wird gepflegt von Kardiomyozyten (CMs). Der irreversible Verlust dieser spezialisierten Zellen ist daher die grundlegende Frage progressive Herzinsuffizienz zugrunde liegen. Während einige Organismen wie Zebrafisch und Xenopus das Potential für kardiale Regeneration haben, ist der erwachsenen Säugetier - Herzen begrenzteren 3, 5, 6. Somit ist die kritische Funktion des Herzens gegeben, ist es nicht erstaunlich , dass Herzkrankheit die häufigste Todesursache in der Welt ist, für 600.000 Todesfälle in den Staaten 7 allein Vereinigten Buchhaltung. Dasrefore, zellbasierte Therapien effizient zu reparieren oder den verletzten Myokard sind von großem klinischem Interesse zu ersetzen.

Die bahnbrechenden Studie von Yamanaka und Kollegen 8 zeigte , dass erzwungene Expression von vier Transkriptionsfaktoren ausreichend ist vollständig differenzierten Fibroblasten - Zellen zu pluripotenten Stammzellen zu konvertieren. Allerdings hat die tumorigenen Kapazität aller pluripotenten Stammzellen Strategien war ein kritisches Problem bei der Verwendung für therapeutische Zwecke. Dies motivierte die wissenschaftlichen Bereich für alternative Methoden zu suchen, Zellen zu transdifferentiate während eine pluripotente Stadium vermieden werden. Kürzlich haben mehrere Gruppen die Durchführbarkeit dieser Strategie dargestellt durch direkte Umwandlung von Maus-Fibroblasten induzierten Kardiomyozyten-ähnliche Zellen (iCLMs) mit der ektopischen Expression des Transkriptionsanzeigefaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5, und später, Hand2 (GMT und GHMT bezeichnet) 9, 10. Furthermore kann dieselbe Strategie in vivo durchgeführt werden und in menschlichen Geweben 9, 11, 12. Jüngste Studien haben zusätzliche Faktoren oder Signalwege aufgezeigt , die weiter moduliert werden kann , um Herz Umprogrammierung Effizienz 13, 14, 15 zu verbessern. Zusammengenommen zeigen diese Studien das Potenzial gerichtet transdifferentiation für regenerative Therapien. Allerdings bleiben die geringe Effizienz der CM Umprogrammierung, die unbekannten molekularen Mechanismen, inkonsistente Reproduzierbarkeit aufgrund methodischer Unterschiede 16 und die Heterogenität der iCLMs unadressierte.

Um icLm Heterogenität direkt zu bewerten, haben wir eine diskrete und robuste Single-Cell-Test für die Identifizierung von Sarkomers Entwicklung und Herz-Linie specification-zwei notwendigen Eigenschaften von funktionellen Kardiomyozyten. Es gibt mindestens drei Haupttypen von CM im Herzen , wie durch ihre Lage und einzigartige elektrische Eigenschaften definiert: atrial (AM), ventrikuläre (VM) und Schrittmacher (PM) 17, 18, 19, 20. In einer konzertierten Kombination ermöglichen sie die richtige Pumpen von Blut. Während Herzverletzung, eine oder alle Subtypen betroffen sein könnten, und die Art der Zelltherapie müssten auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Derzeit konzentrieren sich die meisten Strategien auf die gesamte Generation von Kardiomyozyten, während wenig Arbeit, die molekularen Mechanismen zu studieren getan wird, um die Subtyp Spezifikation regelt.

Die folgende Studie beschreibt, wie man richtig gut organisierten Sarkomere zu quantifizieren und eine vielfältige Reihe von Kardiomyozyten Subtypen identifizieren. Mit Hilfe eines Schrittmachers (PM) -spezifische Reporter Maus, wir sind in der Lage ein i anwendenmmunocytochemical Ansatz zur Unterscheidung induzierte atriale artigen Myozyten (IAM), induzierte ventrikuläre artigen Myozyten (iVM) und induzierte PM-wie Myozyten (IPMS) 21. Basierend auf unseren Beobachtungen nur Zellen, die Sarkomers Organisation zeigen in der Lage sind spontan zu schlagen. Diese einzigartige Umprogrammierung Plattform ermöglicht es, die Rolle für die Beurteilung der bestimmter Parameter in Sarkomers Organisation, Subtyp-Spezifikation, und die Effizienz der CM Neuprogrammierung bei Einzelzellauflösung.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren Tier Praktiken beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am UT Southwestern Medical Center genehmigt.

1. Isolierung von HCN4-GFP E12,5 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)

  1. Richten Sie zeitlich Paarungen zwischen homozygot HCN4-GFP Männchen und CD-1-Weibchen.
  2. Sacrifice schwangere Frau bei E12,5 von Kohlendioxid Euthanasie und anschließende Zervikaldislokation.
    1. Entfernen Sie Gebärmutterhörner mit Pinzette als 22 zuvor beschrieben, 23, und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ohne Ca 2+ oder Mg 2+.
  3. Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in der Gewebekultur Haube steril Technik.
    1. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter und Fruchtblase Schere und Pinzette. Halten Sie die Plazenta für eine bessere Handhabung angebracht. pregnant CD-1 Weibchen normalerweise Geburt zwischen 10 und 14 Welpen geben.
    2. Mit einer Pinzette zu sezieren, nehmen die isolierten Embryonen und sie schnell zweimal in 70% spülen (v / v) EtOH.
      HINWEIS: Die Wäschen sollte schnell sein Zelltod zu minimieren.
    3. Entfernen Sie den Kopf, Gliedmaßen, Schwanz und innere Organe, darunter das Herz aus den isolierten Embryonen.
    4. Legen Sie das verbleibende Gewebe in einem 10-cm - Schale mit 1 ml 1x PBS und fein zerkleinern und eine sterile Rasierklinge auf etwa 1 mm 3 in der Größe verwendet wird .
    5. Übertragen zerkleinerte Gewebe in ein 50 ml konisches Röhrchen mit PBS.
    6. Spin bei 300 g für 3 min. aspirieren vorsichtig überschüssige PBS.
    7. 1 mL steriler 0,25% Trypsin-EDTA pro Embryo. Inkubiere Zellen in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig mischen das Rohr alle 4 Minuten. Über Verdauung des Gewebes wird die Ausbeute deutlich niedriger.
    8. Vortex Zellmischung bei maximaler Geschwindigkeit (3200 rpm) für 4 s.
    9. In 2 ml Fibroblasten-Medien pro Embryo und mischen. Filter turch einen 100 um Zellsieb mit einer Pipette die Zellen durch das Sieb zu unterstützen. Siehe Tabelle 1 für die Formulierung alle nachfolgenden Medien.
    10. Spin bei 300 g für 4 min. Sorgfältig absaugen Überstand.
    11. In 10 ml frischem Fibroblasten-Medien pro 3 Embryonen und verreiben 6-10 mal.
    12. Platte, die die Zellen in 1 15 cm Gewebekulturschale für alle 3 Embryonen hergestellt. Kultur über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator.
    13. Nach der Inkubation über Nacht ersetzen Sie die Medien mit frischen 30 ml Medium pro Platte. Legen Zellen wieder in den Inkubator über Nacht.
      HINWEIS: Überprüfen Sie für HCN4-GFP + Zellkontamination unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die Kultur sollte GFP sein - und nur werden GFP + auf Neuprogrammierung.
    14. Am nächsten Tag Ernte Zellen mit 3 ml frischem vorgewärmten 0,25% Trypsin-EDTA. Graf und Gefrierzellen. Typischerweise gefrier Zellen bei 3 x 10 6 Zellen pro mL. Die erwartete yield sollte 3 x 10 6 Zellen pro Embryo sein.

2. Retrovirus Produktion und Reprogrammierung

Achtung: Das folgende Protokoll erfordert die Herstellung und Handhabung von infektiösen Retroviren. Führen Sie die folgenden Schritte in einem Biosafety Level 2 Schrank unter BSL-2-Richtlinien und sterile Technik. Verwenden Sie 10% Bleiche aller Materialien zu entsorgen ausgesetzt Retroviren.

  1. Retrovirus - Produktion und MEF Vorbereitung
    HINWEIS: Das folgende Protokoll ist für die retrovirale Produktion in 6-Well-Platten und MEF-Infektion in 24-Well-Platten. Für andere Formate finden Sie in Tabelle 2. MEFs sind an Tag -1 überzogen, so dass das Timing abgestimmt für jedes Experiment in geeigneter Weise werden müssen (siehe Abschnitt 2.3 und Abbildung 2).
    1. Pflegen Plat-E (PE) Zellen gemäß den Empfehlungen des Herstellers. In Kürze, Kultur PE-Zellen in DMEM mit 10% FBS ergänzt, 1 & mgr; g / mL puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, Penicillin und Streptomycin. Passage Zellen 1: 4 alle zwei Tage, wenn die Kultur 70-90% Konfluenz erreicht.
    2. Tag -2: Am Tag vor der Transfektion Samen Plat-E - Zellen bei 1 × 10 6 Zellen / Vertiefung auf einer 6-Well - Platte in Transfektionsmedien. Zellen sollten 70-80% konfluent zum Zeitpunkt der Transfektion werden.
  2. Transfektion Kommerzielle Transfektionsagens verwenden.
    HINWEIS: Die kommerziellen Reagenzien bei Raumtemperatur (RT) vor der Transfektion sein sollte. Für die DNA - Transfektion, für jede retrovirale Plasmid - DNA einzeln (G, H, M und T) 9 einen GHMT Cocktail zu bilden.
    1. Tag -1: In einem 15 ml konischen Polystyrolröhrchen, mischen 60 ul reduziert Serum - Medien mit 6 ul Transfektionsreagenz pro Reaktion für eine 6-Well - Plattenformat. Inkubieren der Mischung für 5 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Da das Transfektionsreagenz hier bindet an Kunststoffen, eindirekt mit dem reduzierten Serummedien dd jede Abnahme der Transfektionseffizienz zu vermeiden.
    2. In insgesamt 2 ug GHMT Cocktail pro Reaktion und klopfen Sie leicht zu mischen. Nicht mit dem Vortex. Inkubieren der Reaktion für 15 min bei RT.
    3. In der Mischung aus Schritt 2.2.3 an die PE-Zellen in einer tropfenweise Art und Weise.
    4. Inkubieren der transfizierten Plat-E - Zellen über Nacht in einem 37 ° C, 5% CO 2 -Inkubator. Notieren Sie sich die Zeit der Transfektion.
  3. Seeding von HCN4-GFP embryonalen Maus - Fibroblasten.
    1. 1 h vor MEFs Plattierung, eine 24-Well-Platte für Immunzytochemie vorzubereiten.
      1. Fügen Sie eine 12 mm Fibronektin Deckglas pro Vertiefung.
      2. Coat Vertiefungen mit 300 & mgr; l Rinderkollagenlösung (zB surecoat) und Inkubation in einem 37 ° C Inkubator für 1 h.
      3. Absaugen Beschichtungslösung unmittelbar vor der MEF-Beschichtung.
    2. Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen HCN4-GFP MEFs und waschen x1 mit vorgewärmten fibroblast Medien bei 500 xg für 5 min.
    3. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen Trypanblau-Ausschluss oder ähnliche Farbstoffe verwendet. Berechne die Anzahl der lebensfähigen Zellen pro ml Kultur mit der folgenden Formel:
      % Lebenden Zellen = [1,00 - (Anzahl der blauen Zellen / Anzahl der gesamten Zellen)] x 100
      1. Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung der folgenden Formel:
        Lebensfähige Zellen =% lebende Zellen x Verdünnungsfaktor x 10.000 x Gesamtvolumen der Zellsuspension
    4. Seed 3 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf eine Platte mit 24 Vertiefungen mit zuvor hergestellten Rinder - Kollagen - Lösung-Fibronektin Deckglas.
  4. Transduction und Reprogrammierung von MEFs
    HINWEIS: Nach den Notizen des Herstellers richtig gepflegt Plat-E - Zellen produzieren einen durchschnittlichen Titer von 1 x 10 7 Infektion Einheiten / ml. Obwohl die Titer nicht direkt für jedes Experiment gemessen wird, wird ein GFP Steuerung immer als Surrogat für Infektionseffizienz enthalten.Hohe GFP - Expression und Intensität (GFP +> 95%) korreliert typischerweise mit erfolgreichen GHMT-vermittelte Erzeugung von iCLMs.
    1. Tag 0: 24 h nach der Transfektion, filtern das PE Medium retroviralen durch einen 0,45 & mgr; m Porengröße Tensid freie Celluloseacetat - Filter und in ein 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen Polybren bis zu einer Endkonzentration von 8 & mgr; g / mL. Sorgfältig Zellen mit 2 ml frischem Transfektionsmediums aufzufüllen.
      Hinweis: Zellen leicht von der Platte lösen, wenn Medien zu schnell geändert wird.
    2. Saugen Sie das Medium der kultivierten MEFs und fügen Sie den frisch retroviralen Medium gesammelt; es sollte 1,7 ml Medium pro Well einer 6-Well-Platte ergeben. In ~ 800 & mgr; l pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Zurück MEF Platte in den Inkubator und über Nacht inkubiert.
    3. Tag 1: Wiederholen Sie die Schritte 2.4.1 und 2.4.2. Entsorgen Sie Zellen nach der 2. Virussammlung. Zurück infizierten MEFs in den Inkubator und lassen Sie sie über Nacht ruhen.
    4. Tag 2: 48 h nach der Induktion, aspirieren die Zelle konditionierten Medien und Wasch x1 mit 1x PBS. In 500 ul vorgewärmt icLm Medien pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.
    5. Ersetzen icLm Medien alle 2 - 3 Tage. Prozessplatte 14 Tage nach der viralen Induktion für Immunzytochemie (ICC) Analyse der kardialen Neuprogrammierung.

3. Immunfärbung von Reprogrammed MEFs

  1. 14-Tage nach der Induktion, aspirieren sorgfältig die Medien.
  2. Spülen Sie jede Vertiefung mit 300 & mgr; l eiskaltem 1x PBS. Absaugen überschüssige Lösung.
  3. Fix-Zellen mit 250 & mgr; l von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung pro Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubiere 15 Minuten bei RT.
    HINWEIS: - 2 Wochen vor Anfärbung Fixierte Zellen können 1 in PBS bei 4 ° C gelagert werden.
  4. Permeabilisierung Zellen durch Waschen Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBS-Triton X 100 (PBST). Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen.
  5. Block 10min bei RT mit 1x Universal-Block-Puffer bei 300 & mgr; l / Vertiefung.
  6. Bereiten Sie (ICC) Färbepuffers: 1: 1 von 1x PBS und 1x Universal-Blocking-Puffer. Verdünnen primäre Antikörper in ICC Färbepuffers und Inkubation Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen.
    1. Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen NPPA für iPM und iAM Identifikation.
    2. Stain ein Schienenpaar mit Maus α-Actinin, Huhn αGFP und Kaninchen Myl2 für iPM und iVM Identifikation.
  7. Am folgenden Tag waschen Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. überschüssige Lösung nach dem letzten Wasch absaugen.
  8. Bereiten Sie die sekundären Antikörper-Verdünnungen in ICC Färbepuffers. Weitere Informationen sind dem Abschnitt empfohlenen Verdünnungen. Inkubieren Sekundärantikörper 1 h bei RT, vor Licht geschützt.
    1. Stain alle Folien mit den folgenden sekundären antibodies: Maus Alexa-555, Huhn Alexa-488, und Kaninchen Alexa-647.
  9. Waschen Sie Brunnen x3 mit 300 & mgr; l 0,1% PBST. Inkubieren 5 min bei RT zwischen Wäschen. Vor Licht schützen.
  10. Fügen 2,4 ul Eindeckmedien enthaltend 1,5 & mgr; g / ml 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in ein Glasobjektträger. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas aus dem Brunnen der 24-Well-Platte, entfernen Sie überschüssige Lösung und Transfer zum Glasträger mit Montage Medien. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas überschüssiges Volumen und Luft zu entfernen.
  11. Seal Folien mit bevorzugten Nagellack oder Kunststoff Versiegelung. Shop gerahmte Dias bei 4 ° C vor Licht geschützt.

4. Identifizierung von Cardiac-Formationsglieder mittels konfokaler Mikroskopie

HINWEIS: Für die Bildgebung, ein konfokales Mikroskop mit mindestens zwei Fluoreszenzdetektoren der Lage spektralen Detektion bei 405, 488, 555 und 639 nm Wellenlängen erforderlich ist, um IPMS, IAMS und IVMS zu identifizieren. Image-Zellen ein Plan-Apochromat 20x / 0,75 Ziel oder besser verwenden. Mit Hilfe der Bildanalyse-Software des Herstellers, Scannen Zoom-Bilder 40X-Ölkapselung Bildqualität erreichen können.

  1. Bildarchiv: Nehmen Sie 8-Bit-Bilder mit DAPI, Alexa-488, Alexa-555 und Alexa-647-Kanäle (ch.). Pixel Verweilzeit von 6 s, 1024 Rahmengröße, Zeilen Schritt bei 2, und Mitteln von 2 reicht für hochauflösende Bilder.
  2. Für jede Folie, die von einem Rand beginnen und Scannen nach oben und unten in der roten Fluoreszenzkanal (ch.) Zur α-Actinin + Sarkomer + Zellen (Siehe 3 und 5A Beispiele Abbildung). Sarkomers Riefen sind leichter zu visuell in der 555 nm Wellenlänge zu identifizieren.
    1. Sobald ein α-Actinin + Sarkomer + Zelle identifiziert wurde, wechseln Sie in den grünen ch. und merken, wenn es positiv ist (ipm). Wechseln Sie auf dem Computer mit dem fernen Rot 647 ch zu beurteilen. (IAM oder iVM).
      HINWEIS: Die Zellen, dieα-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - als IPMS bezeichnet. GFP - Expression wird in der gesamten Zelle (4A) gesehen werden.
    2. Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), NPPA (Kaninchen-Alexa647) und DAPI. Zellen , die α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP sind - / NPPA + sind iAM. NPPA Färbung erscheint perinukleäre und punctata (4B).
    3. Stain Dias mit α-Actinin (Maus-Alexa555), HCN4-GFP (Huhn-Alexa488), Myl2 (Kaninchen-Alexa647). Zellen , die positiv für α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + sind IVMS. Myl2 Färbung wird ein gestreiftes Form entlang der Sarkomers Filament aufweisen. Aufgrund von Schwankungen in der Qualität der Färbung und der Z-Ebene, Streifungen nicht immer leicht sichtbar (4C) liegen.

5. Quantifizierung

HINWEIS: Um die tatsächliche Anzahl der potenziell umprogrammiert MEFs, 2 Vertiefungen einer 24-Well-Platte zu bewerten sind parallel zu den experimentellen Vertiefungen ausgesät und 1 Tag geerntet nach der Plattierung. Die Gesamtzahl der plattierten Zellen wird dann durch Mittelung der zwei Vertiefungen bestimmt. Dies wird die tatsächliche Gesamt Zellen plattiert (Ages).

  1. Sarkomers +
    1. Sichtprüfung jede Zelle auf einem Deckglas für die richtige α-Actinin + / Sarkomer + (rechte Felder Abbildung 3) und Aufzeichnung (5B-i).
    2. Tabellieren die Gesamtzahl der α-Actinin + / + Sarkomer auf jedem Deckglas und dividieren durch die tatsächliche Gesamt Zellen ausplattiert (ATOTAL) (5B-iii). Wenn beispielsweise ATOTAL = 12.500 Zellen und 100 - Zellen wurden a-Actinin + / + Sarkomer dann 0,8% der plattierten MEFs wurden umprogrammiert. Ein Durchschnittreprograming Experiment Ausbeute 1% α-Actinin + / Sarkomer + Zellen (5C).
  2. Subtype +
    HINWEIS: Für die folgenden Schritte siehe 5B / C für eine repräsentative icLm Quantifizierung Workflow - Abbildung. Kurz gesagt, für jede Sarkomers + Zelle, tabellarisch , wenn es für beide Subtyp (5B-i) ist einzigartig. Berechnen% Subtype (5B-iii) , indem die Anzahl der Subtyp + Zellen über die durchschnittliche Sarkomers Dividieren + Zellen x 100 (5B-i). Um die absolute% Subtyps Wirkungsgrad (5B-iv) zu berechnen, unterteilen den Subtyp + Zellzahl von 5B-i durch die Gesamtzahl von Zellen ausgesät x 100 (5B-ii).
    1. Für jede der α-Actinin + / Sarkomer + Zellen, zu bewerten , ob sie GFP + sind, NPPA + oder Myl2 +.
    2. Tabellieren Gesamtanzahl von α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / NPPA + und α-Actinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + Zellen (5B-i).
    3. Um den Prozentsatz von jedem Subtyp berechnen, teilen die Anzahl der Subtype + Zellen durch die Gesamtzahl von α-Actinin + / Sarkomer + -Zellen in das gut und multiplizieren mit 100. GHMT erzeugt IPMS, IAMS und IVMS in etwa gleichen Verhältnissen (Fig 5B-iii).
    4. Um die absolute Anzahl von Subtyp + Zellen zu berechnen, unterteilen die Gesamtzahl der Subtyp + Zellen für die experimentellen Bedingungen durch ATOTAL und multipliziere mit 100 (5B-ii). Im Durchschnitt IPMS 0,3% der gesamten infizierten Zellpopulation darstellen, Iams 0,3% undIVMS 0,25% (5B-iv).

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Ergebnisse

Unter Ausnutzung der PM-spezifischen Reporter - Maus, entwickelten wir eine multiplex Immunofärbung Strategie diverse endogene Myozyten zu identifizieren , wie in Abbildung 1 dargestellt. Im Anschluss können die Umprogrammierung Schritte in 2 gezeigt ist , die Induktion von Subtyp-spezifischen CMs so früh wie Tag nachgewiesen werden 4 21, wenn auch mit niedriger Rate. Bis zum Tag 14 kann das Experiment gestoppt und für Sarkomers O...

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Diskussion

Die vorliegende Studie bietet einen Direkt Umprogrammierung Strategie zur Umwandlung von MEF in eine vielfältige Reihe von Herz-Subtypen durch Retrovirus-vermittelte Expression des kardialen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5 und Hand2 (GHMT). Unter Verwendung eines Multiplex-Immunfärbung Ansatz in Kombination mit einem PM-spezifischen Reporter Maus, sind wir in der Lage iAM zu identifizieren, IVMS und IPMS auf Einzelzellauflösung. Ein solcher Test ermöglicht eine experimentelle in vitro System in der La...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

A.F.-P. wurde unterstützt durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship unter der Fördernummer 2015165336. N.V.M wurde durch Zuschüsse des NIH (HL094699), des Burroughs Wellcome Fund (1009838) und des March of Dimes (#5-FY14-203) unterstützt. Wir danken Young-Jae Nam, Christina Lubczyk und Minoti Bhakta für ihre wichtigen Beiträge zur Protokollentwicklung und Datenanalyse. Wir danken auch John Shelton für wertvollen technischen Input und den Mitgliedern des Munshi-Labors für die wissenschaftliche Diskussion.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEMSigmaD5796Bestandteil von iCLM-Medien, Plat-E-Medien, Fibroblasten und Transfektionsmedien
Medium 199Thermo Fisher Scientific11150059Bestandteil von iCLM-Medien
Fötales Rinderserrum (FBS)SigmaF2442Bestandteil von iCLM-Medien, Plat-E-Medien, Fibroblasten und Transfektionsmedien
Insulin-Transferrin-Selen GThermo Fisher Scientific41400-045Bestandteil von iCLM media
MEM VitaminlösungThermo Fisher Scientific11120-052Bestandteil von iCLM media
MEM AminosäurenThermo Fisher Scientific1601149Bestandteil von iCLM media
Nicht-essentielle AminosäurenThermo Fisher Scientific11140-050Bestandteil von iCLM media
Antibiotikum-AntimykotikaThermo Fisher ScientificBestandteil des iCLM-Mediums
B-27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044Bestandteil des iCLM-Mediums
Hitzeinaktiviertes PferdeserumThermo Fisher Scientific26050-088Bestandteil des iCLM-Mediums
NaPyruvatThermo Fisher Scientific11360-70Bestandteil des iCLM-Mediums
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514022Bestandteil von Plat-E-Medien und Fibroblastenmedien
PuromycinThermo FisherScientific A11139-03Komponente des Plat-E Mediums
Blasticidin   Gemini Bio-Products400-128PBestandteil des Plat-E-Mediums
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Bestandteil des Fibroblastenmediums
Konfokales Laserscanning LSM700ZeissFür die konfokale Analyse
FuGENE 6 TransfektionsreagenzPromegaE2692Transfektionsreagenz 
Opti-MEM Reduziertes Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070Transfektionsreagenz 
PolybreneMilliporeTR-1003-GInduktionsreagenz. Bei einer Endkonzentration von 8 μm; M/mL
Platinium-E (PE) Retrovirale Packagin-Zelllinie, EcotropicCellBiolabsRV-101Retrovirale Pacaking-Zelllinie
Trypsin 0,25 % EDTAThermo Fisher ScientificFür MEFs und Plat-E-Dissoziation
Maus anti & alpha;-Actinin (Klon EA-53)SigmaA7811Antikörper für die konfokale Analyse. Verwenden Sie bei 1:200
Huhn Anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:200
Rabbit Pab Anti-NPPA AbgentAP8534AAntikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG ProteinTech10906-1-APAntikörper für die konfokale Analyse. Verwendung im Verhältnis 1:200
Vectashield Lösung mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)Vector LabsH-1500Farbstoff für die konfokale Analyse
Superfrost Plus ObjektträgerThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1,0 mm
BioCoat Fibronektin 12 mm DeckgläserNeuVitro CorpGG-12-1,5Deckgläser für die konfokale Analyse
100 μ m ZellensiebThermo Fisher Scientific08-771-19
0,45 μ m Spritzen Filter SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Für die Virenfiltration
6 mL SpritzenCovidien8881516937Für die
Virenfiltration Ziege Anti-Huhn IgY (H& L) A488AbcamAB150169Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400
Esel Anti-Kaninchen A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Bei 1:400 verwenden
Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400
Triton X-100Sigma93443-100mlFür die Zellpermeabilisierung 
Dulbecco's PBS ohne CaCl2 und MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Universal BlockingReagenzThermo Fisher ScientificNC9495720Verdünnen auf 1x in H2O
16%ige wässrige Paraformaldehyd-Lösung (PFA)Elektromikroskopie 15710Anwendung bei 4 % verdünnt in dH2Ø
6 cm Platten Olympus25-260
6-Well-PlattenGenesee Scientific25-105
24-Well-PlattenGenesee Scientific25-107
10 cm GewebekulturschalenCorning4239
15 cm  GewebekulturschalenThermo Fisher Scientific5442
15 mL Konische RöhrchenCorning4308
50 mL Konische RöhrchenCorning4249
0,4 % Trypanblau-LösungSigmaT8154Für die Lebensfähigkeit
Ethylalkohol 200 proofThermo Fisher Scientific7005
BleichmittelThermo Fisher Wissenschaftlich6009
15240062

Referenzen

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Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten
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