Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Generierung und Quantifizierung verschiedener reprogrammierter kardialer Subtypen unter Verwendung einer Retrovirus-vermittelten Verabreichung von Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5.

Zusammenfassung

Die direkte Reprogrammierung eines Zelltyps in einen anderen hat sich in letzter Zeit als mächtiges Paradigma für die regenerative Medizin, die Modellierung von Krankheiten und die Spezifizierung von Abstammungslinien erwiesen. Insbesondere die Umwandlung von Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten-ähnliche Myozyten (iCLMs) durch Gata4, Hand2, Mef2c und Tbx5 (GHMT) stellt einen wichtigen Weg zur Generierung von de novo kardialen Myozyten in vitro und in vivo dar. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass GHMT eine größere Vielfalt an kardialen Subtypen hervorruft als bisher angenommen, was die Notwendigkeit eines systematischen Ansatzes für die Durchführung zusätzlicher Studien unterstreicht. Bevor jedoch die direkte Reprogrammierung als therapeutische Strategie eingesetzt werden kann, müssen die mechanistischen Grundlagen der Abstammungskonversion im Detail verstanden werden, um spezifische kardiale Subtypen zu erzeugen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Generierung von iCLMs durch GHMT-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vor.

Wir skizzieren Methoden zur MEF-Isolierung, retroviralen Produktion und MEF-Infektion, um eine effiziente Reprogrammierung zu erreichen. Um die Subtyp-Identität von reprogrammierten Zellen zu bestimmen, beschreiben wir einen Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Durchführung der Immunzytochemie an iCLMs unter Verwendung eines definierten Satzes kompatibler Antikörper. Methoden zur konfokalen Mikroskopie, Identifizierung und Quantifizierung von iCLMs und individuellen atrialen (iAM), ventrikulären (iVM) und Schrittmacher-Subtypen (iPM) werden ebenfalls vorgestellt. Schließlich diskutieren wir repräsentative Ergebnisse prototypischer Experimente zur direkten Reprogrammierung und beleuchten wichtige technische Aspekte unseres Protokolls, um eine effiziente Linienkonvertierung zu gewährleisten. Zusammenfassend sollte unser optimiertes Protokoll einen schrittweisen Ansatz für Forscher bieten, um aussagekräftige kardiale Reprogrammierungsexperimente durchzuführen, die die Identifizierung einzelner CM-Subtypen erfordern.

Einleitung

Das Herz ist das erste funktionelle Organ im Embryo ^{1, 2} zu entwickeln. In Verbindung mit dem Kreislaufsystem, liefert sie Sauerstoff, Nährstoffe und einen Entsorgungsmechanismus bei der Entwicklung. Drei Wochen nach der Befruchtung, schlägt das menschliche Herz zum ersten Mal und seine angemessene Regelung wird gepflegt von Kardiomyozyten (CMs). Der irreversible Verlust dieser spezialisierten Zellen ist daher die grundlegende Frage progressive Herzinsuffizienz zugrunde liegen. Während einige Organismen wie Zebrafisch und Xenopus das Potential für kardiale Regeneration haben, ist der erwachsenen Säugetier - H....

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren Tier Praktiken beteiligt sind, wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee am UT Southwestern Medical Center genehmigt.

1. Isolierung von HCN4-GFP E12,5 embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)

1. Richten Sie zeitlich Paarungen zwischen homozygot HCN4-GFP Männchen und CD-1-Weibchen.
2. Sacrifice schwangere Frau bei E12,5 von Kohlendioxid Euthanasie und anschließende Zervikaldislokation.
   1. Entfernen Sie Gebärmutterhörner mit Pinzette als ²² zuvor ^{beschrieben, 23,} und legen Sie sie in eine Petrischale auf Eis mit 1x phos....

Ergebnisse

Unter Ausnutzung der PM-spezifischen Reporter - Maus, entwickelten wir eine multiplex Immunofärbung Strategie diverse endogene Myozyten zu identifizieren , wie in Abbildung 1 dargestellt. Im Anschluss können die Umprogrammierung Schritte in 2 gezeigt ist , die Induktion von Subtyp-spezifischen CMs so früh wie Tag nachgewiesen werden 4 ^21, wenn auch mit niedriger Rate. Bis zum Tag 14 kann das Experiment gestoppt und für Sarkomers O.......

Diskussion

Die vorliegende Studie bietet einen Direkt Umprogrammierung Strategie zur Umwandlung von MEF in eine vielfältige Reihe von Herz-Subtypen durch Retrovirus-vermittelte Expression des kardialen Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2c, Tbx5 und Hand2 (GHMT). Unter Verwendung eines Multiplex-Immunfärbung Ansatz in Kombination mit einem PM-spezifischen Reporter Maus, sind wir in der Lage iAM zu identifizieren, IVMS und IPMS auf Einzelzellauflösung. Ein solcher Test ermöglicht eine experimentelle in vitro System in der La.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM	Sigma	D5796	Bestandteil von iCLM-Medien, Plat-E-Medien, Fibroblasten und Transfektionsmedien
Medium 199	Thermo Fisher Scientific	11150059	Bestandteil von iCLM-Medien
Fötales Rinderserrum (FBS)	Sigma	F2442	Bestandteil von iCLM-Medien, Plat-E-Medien, Fibroblasten und Transfektionsmedien
Insulin-Transferrin-Selen G	Thermo Fisher Scientific	41400-045	Bestandteil von iCLM media
MEM Vitaminlösung	Thermo Fisher Scientific	11120-052	Bestandteil von iCLM media
MEM Aminosäuren	Thermo Fisher Scientific	1601149	Bestandteil von iCLM media
Nicht-essentielle Aminosäuren	Thermo Fisher Scientific	11140-050	Bestandteil von iCLM media
Antibiotikum-Antimykotika	Thermo Fisher Scientific	Bestandteil des iCLM-Mediums
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Bestandteil des iCLM-Mediums
Hitzeinaktiviertes Pferdeserum	Thermo Fisher Scientific	26050-088	Bestandteil des iCLM-Mediums
NaPyruvat	Thermo Fisher Scientific	11360-70	Bestandteil des iCLM-Mediums
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	1514022	Bestandteil von Plat-E-Medien und Fibroblastenmedien
Puromycin	Thermo Fisher	Scientific A11139-03	Komponente des Plat-E Mediums
Blasticidin	Gemini Bio-Products	400-128P	Bestandteil des Plat-E-Mediums
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Bestandteil des Fibroblastenmediums
Konfokales Laserscanning LSM700	Zeiss		Für die konfokale Analyse
FuGENE 6 Transfektionsreagenz	Promega	E2692	Transfektionsreagenz
Opti-MEM Reduziertes Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	Transfektionsreagenz
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Induktionsreagenz. Bei einer Endkonzentration von 8 μm; M/mL
Platinium-E (PE) Retrovirale Packagin-Zelllinie, Ecotropic	CellBiolabs	RV-101	Retrovirale Pacaking-Zelllinie
Trypsin 0,25 % EDTA	Thermo Fisher Scientific		Für MEFs und Plat-E-Dissoziation
Maus anti & alpha;-Actinin (Klon EA-53)	Sigma	A7811	Antikörper für die konfokale Analyse. Verwenden Sie bei 1:200
Huhn Anti-GFP IgY	Thermo Fisher Scientific	A10262	Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:200
Rabbit Pab Anti-NPPA	Abgent	AP8534A	Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG	ProteinTech	10906-1-AP	Antikörper für die konfokale Analyse. Verwendung im Verhältnis 1:200
Vectashield Lösung mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid)	Vector Labs	H-1500	Farbstoff für die konfokale Analyse
Superfrost Plus Objektträger	Thermo Fisher Scientific	12-550-15	25 x 75 x 1,0 mm
BioCoat Fibronektin 12 mm Deckgläser	NeuVitro Corp	GG-12-1,5	Deckgläser für die konfokale Analyse
100 μ m Zellensieb	Thermo Fisher Scientific	08-771-19
0,45 μ m Spritzen Filter SFCA 25MM	Thermo Fisher Scientific	09-740-106	Für die Virenfiltration
6 mL Spritzen	Covidien	8881516937	Für die
Virenfiltration Ziege Anti-Huhn IgY (H& L) A488	Abcam	AB150169	Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400
Esel Anti-Kaninchen A647 IgG(H+L)	Thermo Fisher Scientific	A31573	Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Bei 1:400 verwenden
Ziegen-Anti-Maus-IgG(H+L) A555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Sekundärantikörper für die konfokale Analyse. Verwendung bei 1:400
Triton X-100	Sigma	93443-100ml	Für die Zellpermeabilisierung
Dulbecco's PBS ohne CaCl2 und MgCl2 (D-PBS)	Sigma	D8537
Power Block 10x Universal BlockingReagenz	Thermo Fisher Scientific	NC9495720	Verdünnen auf 1x in H2O
16%ige wässrige Paraformaldehyd-Lösung (PFA)	Elektromikroskopie	15710	Anwendung bei 4 % verdünnt in dH2Ø
6 cm	Platten Olympus	25-260
6-Well-Platten	Genesee Scientific	25-105
24-Well-Platten	Genesee Scientific	25-107
10 cm Gewebekulturschalen	Corning	4239
15 cm  Gewebekulturschalen	Thermo Fisher Scientific	5442
15 mL Konische Röhrchen	Corning	4308
50 mL Konische Röhrchen	Corning	4249
0,4 % Trypanblau-Lösung	Sigma	T8154	Für die Lebensfähigkeit
Ethylalkohol 200 proof	Thermo Fisher Scientific	7005
Bleichmittel	Thermo Fisher Wissenschaftlich	6009

15240062