Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.
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Methodenartikel
Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Amyloidogene Peptide, wie das an der Alzheimer-Krankheit beteiligte Amyloid beta (Aβ), können eine erhebliche Herausforderung darstellen, wenn versucht wird, hochreines Material zu erhalten. Hier stellen wir ein maßgeschneidertes HPLC-Aufreinigungsprotokoll zur Herstellung von hochreinen Amyloid-Beta-42- (Aβ42) und Amyloid-Beta-40-Peptiden (Aβ40) vor. Wir haben festgestellt, dass die Kombination von kommerziell erhältlichem hydrophobem stationären Poly(styrol/Divinylbenzol)-Polymer Labor Umkehrphase - Styroldivinylbenzol (PLRP-S) unter hohen pH-Bedingungen das Erreichen einer hohen Reinheit (>95%) Aβ42 in einem einzigen chromatographischen Lauf ermöglicht. Die Reinigung ist hochgradig reproduzierbar und kann je nach der zu reinigenden Materialmenge sowohl auf semipräparative als auch auf analytische Bedingungen umgestellt werden. Das Protokoll kann auch mit identischem Erfolg und ohne Änderung der Methode auf das Aβ40-Peptid angewendet werden.
Einleitung
Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die Auswirkungen über 35 Millionen Menschen weltweit. 1 stark bei der Entstehung und Entwicklung der Krankheit in Verbindung gebracht, ist die hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid Amyloid beta (Aß). 2 Aß im Bereich von 36 bis 43 Aminosäuren in der Länge, aber es wird angenommen , daß die 42-Aminosäurevariante Amyloid beta 42 (Aß42), ist die toxische Form des Proteins. 3 Dies ist zum größten Teil auf die Fähigkeit von Aß42 zu leicht diffusionsfähig, oligomere Spezies bilden , die vermutlich besonders neurotoxischen Einheiten sein. <....
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Protokoll
1. Präparative HPLC-Reinigung des Aβ40 oder Aß42-Peptid
- Bereiten Sie die folgenden Puffer für die HPLC - Reinigung.
- Bereiten Puffer A (20 mM NH 4 OH) durch Zugabe von 1,3 ml NH 4 OH (28% ige Lösung) auf 1000 ml Reinstwasser.
- Bereiten Puffer B (80% Acetonitril mit 20 mM NH 4 OH) durch Zugabe von 1,3 ml NH 4 OH (28% ige Lösung) zu einer Lösung von 800 ml HPLC-reines Acetonitril und 200 ml Reinstwasser.
- Präparieren Probenlösungspuffer (0,1% NH 4 OH) durch Zugabe von 100 & mgr; l NH 4 OH (28% ige Lösung) zu 100 ml Re....
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Ergebnisse
Die Reinigung des Aß42 Peptid , das eine Kombination aus der PLRP-S stationäre Phase und ein hoher pH - Wert der mobilen Phase führt zur Bildung eines scharfen, aufgelöst Peak für das Aß - Peptid bei einer Retentionszeit zwischen 72 und 74 min (2C) verwendet wird . Bestätigung der Identität der Peaks wird durch direkte Injektion Massenspektrometrie des gesammelten Eluenten erfolgen. Der Eluent kann für bis zu 12 h bei -20 ° C in Lösung gelagert werden. Längere Lagerzeite.......
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Diskussion
Die HPLC-Aufreinigung des Aβ-Peptids hängt stark von der Wahl sowohl der stationären Phase ab, die bei der Aufreinigung verwendet wird, als auch der mobilen Phase, die zur Eluierung des Peptids gewählt wird. Der niedrige isoelektrische Punkt des Peptids und die hohe Aggregationsneigung machen traditionelle chromatographische Bedingungen für die Trennung von hydrophoben Proteinen (stationäre C4- oder C8-Phase gekoppelt mit einem sauren mobilen Eluenten) schwierig, wobei das Aβ-Peptid als verlängerter breiter, unaufgelöste.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Agilent für ihre technische Unterstützung. Kate Markham und Rafael Palomino wird für ihre anfängliche Hilfe bei der Synthese und Reinigung des Aβ-Peptids gedankt, und Dr. Hsiau-Wei Lee wird für seine Hilfe bei der Erstellung von Abbildung 1 des Manuskripts gedankt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agilent 1260 Infinity II Einviertelpumpe | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dualer Detektor mit variabler Wellenlänge | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manueller Injektor mit 10 mL Probenschleife aus Edelstahl | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manueller Injektor mit 20 & Mikro; L Edelstahl-Probenschleife | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ringständer-Montagehalterung | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 &Mikro; m 4,6 x 250 mm (analytisch) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 oder Aβ 40 Peptide | Synthetisiert im eigenen Haus mit einem automatisierten Peptidsynthesizer von CEM liberty. | ||
| Ammoniumhydroxid (NH4OH, 28%ige Lösung) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitril | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Wasser in HPLC-Qualität | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 mL konisches Zentrifugenröhrchen | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting Einteilig fingerfest, Packung à 5 | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc sterile Spritze | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS | Nadel Rheodyne | 3725-086 |
Referenzen
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease....
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Nachdrucke und Genehmigungen
