Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie die Ionenselektivität von Channelrhodopsin mit elektrophysiologischen Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen unter Verwendung von HEK293-Zellen bestimmt wird. Hier wird das experimentelle Verfahren zur Untersuchung der Chloridselektivität eines anionenselektiven Channelrhodopsins demonstriert. Das Verfahren ist jedoch auf andere Channelrhodopsine mit ausgeprägter Selektivität übertragbar.

Zusammenfassung

In den letzten zehn Jahren wurden Channelrhodopsine in der neurowissenschaftlichen Forschung unentbehrlich, wo sie als Werkzeuge zur nicht-invasiven Manipulation elektrischer Prozesse in Zielzellen verwendet werden. In diesem Zusammenhang ist die Ionenselektivität eines Kanalrhodopsins von besonderer Bedeutung. Dieser Artikel beschreibt die Untersuchung der Chloridselektivität für ein kürzlich identifiziertes anion-leitendes Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata über elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen auf HEK293-Zellen. Das experimentelle Verfahren zur Messung von lichtgesteuerten Photoströmen erfordert eine schnell umschaltbare - idealerweise monochromatische - Lichtquelle, die in das Mikroskop eines ansonsten konventionellen Patch-Clamp-Setups eingekoppelt ist. Vorbereitende Verfahren vor dem Experiment werden unter Berücksichtigung von gepufferten Lösungen, Überlegungen über Flüssigkeitsübergangspotentiale, Seeding und Transfektion von Zellen und Ziehen von Patchpipetten skizziert. Die tatsächliche Aufzeichnung der Strom-Spannungs-BeziehungS zur Bestimmung der Umkehrpotentiale für verschiedene Chloridkonzentrationen findet nach der Transfektion 24 h bis 48 h statt. Schließlich werden elektrophysiologische Daten in Bezug auf theoretische Überlegungen zur Chloridleitung analysiert.

Einleitung

Channelrhodopsine (ChR) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle, die im Augenfleck von beweglichen Grünalgen vorkommen und als primäre Photosensoren für Phototaxis und phobische Reaktionen dienen ¹ . Seit ihrer ersten Beschreibung im Jahr 2002 haben die ChRs den Weg für das entstehende Feld der Optogenetik geebnet und können in einer Vielzahl von erregbaren Zellen angewendet werden, z. B. in Skelettmuskeln, im Herzen oder im Gehirn ^{3 , 4 , 5} . Die Expression von ChRs in Zielzellen führt zu einer lichtsteuerbaren Ionenpermeabilität der jeweiligen Zelle. In einem neuronalen Kontext ermöglicht dies die Aktivierung ^{6 , 7 , 8} oder die Hemmung ^{9 , 10} des Aktionspotentials (AP), die - abhängig vom geführten Ion - mit dem räumlichen und zeitlichen abfeuertPräzision des Lichts, die hervorhebt, wie die Ionenselektivität einer ChR-Variante ihre optogenetische Anwendung bestimmt.

Die ersten entdeckten ChRs von Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri sind für Protonen durchlässig, aber auch für monovalente Kationen wie Natrium, Kalium und in geringerem Maße zu zweiwertigen Kationen wie Calcium und Magnesium ^{11 , 12 , 13} . Heute sind mehr als 70 natürliche kationenleitende Kanalrhodopsine (CCRs) ^{14 , 15 , 16 , 17} und mehrere konstruierte Varianten ^{18 , 19 , 20} mit unterschiedlichen Eigenschaften wie Photostromgröße, spektrale Empfindlichkeit, Kinetik und Kationenselektivität stehen zur Verfügung. Während in der Neurowissenschaften, CCRs aRe verwendet, um Zellen zu aktivieren und APs auszulösen, waren lichtgetriebene mikrobielle Pumpen die einzigen verfügbaren Antagonisten für die Stummschaltung von Neuronen seit Jahren. Im Jahr 2014 zeigten zwei Gruppen gleichzeitig, dass CCRs durch Veränderung der Polarität entlang der putativen Ionen leitenden Pore über molekulare Technik ^{9 , 21} in anion-leitende Kanalrhodopsine (ACRs) umgewandelt werden ^können . Anschließend wurden natürliche ACRs in mehreren Kryptophytenalgen ^{22 , 23 , 24} identifiziert. Am wichtigsten ist, dass die Lichtaktivierung von ACRs Chloridströme in erwachsenen Neuronen vermittelt, was eine Hemmung der neuronalen Aktivität bei viel geringeren Lichtintensitäten ermöglicht als mikrobielle Pumpen, die nur einzelne Ladungen pro absorbiertem Photon transportieren.

Die ChR-Aktivität kann direkt durch elektrophysiologische Patch-Clamp-Aufnahmen von lichtinduzierten Strömen in HEK293-Zellen adressiert werden. Die Patch-ClampTechnik wurde ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt und weiter verbessert von Hamill et al. , Wodurch die Aufzeichnung der Entität von Strömen aus einer kleinen Zelle (Ganzzellenmodus) mit hoher Stromauflösung und direkter Steuerung der Membranspannung ²⁶ ermöglicht wird. In der Zellkultur angewendet, bietet diese Technik eine genaue Kontrolle sowohl der ionischen als auch der elektrischen Aufzeichnungsbedingungen und ermöglicht die Untersuchung der Ionenselektivität zusammen mit dem relativen Beitrag der Ionen zum Gesamtstrom. Hier veranschaulichen wir die Untersuchung der Ionenselektivität für das anion-leitende Kanalrhodopsin von Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) ^{22 , 23} über die Aufzeichnung von Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen extrazellulären Chlorid-Konzentrationen, um eine hohe Chlorid-Leitfähigkeit zu beweisen.

Protokoll

Abbildung 1: Patch-Clamp-Setup. (1) Lichtquelle, (2) optische Faser, (3) programmierbarer Verschluss, (4) Digitalisierer, (5) Blendenautomat, (6) Verstärker, (7) Perfusionssystem, (8) Personal Computer, (9) Monitor (11) Perfusionseinlass, (13) Perfusionsauslass, (14) Aufzeichnungskammer, (15) Flüssigkeitsstandssensor, (16) Badelektrode mit Agarbrücke, (17) Pipettenhalter, (18) Kopfstufe, (19) Mikromanipulator, (20) invertiertes Mikroskop, (21) Mikroskop-Lampengehäuse, (22) mikroskopische Lampenstromversorgung, (23) wassergefüllte U-Rohr, (24) dreiseitig Ventil, (25) Antivibrationstisch, (26) CCD-Kamera. ( A ) Fotografien und ( B ) schematische Darstellung des Aufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version von t anzuzeigenSeine Figur.

1. Vor der Aufnahme aufstellen

	Intra	Extra.1	Extra.2
	Hochchlorid	Hochchlorid	Niedriges Chlorid
	C [mM]	C [mM]	C [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl & sub2 ;	2	2	2
MgCl & sub2 ;	2	2	2
Heiligt	10	10	10
EGTA	10	0	0
PH-Wert	7.2	7.2	7.2
Osmolarität	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

Tabelle 1: Ionische Zusammensetzung der gepufferten Lösungen. Zusammensetzung von intrazellulären (intra) und extrazellulären (Extra-) Puffern für Chloridselektivitätsversuche in HEK-Zellen. Verwendete Abkürzungen: Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und Aspartat (ASP). Alle Konzentrationen sind in mM.

1. Bereiten Sie die Aufzeichnungslösungen mit Ionenkonzentrationen vor, wie in Tabelle 1 angegeben.
   1. Vorbereitung von 15 ml 2 M Stammlösungen in Reinstwasser für MgCl ₂ , CaCl ₂ , KCl und CsCl.
   2. Wiegen der festen Bestandteile für 100 ml des intrazellulären und500 ml der extrazellulären gepufferten Lösungen nach Tabelle 1 in getrennte Bechergläser gegeben und danach die jeweilige Menge der vorbereiteten Stammlösungen zugegeben. Zum Beispiel für den intrazellulären Puffer verwenden Sie 0,3803 g (10 mM) EGTA, 0,2383 g (10 mM) HEPES und 0,6428 g (110 mM) NaCl und geben 100 & mgr; l der 2 M MgCl ₂ und CaCl ₂ und 50 & mgr; l der 2 M KCl- und CsCl-Stammlösungen
   3. Reinigen Sie Wasser und pflegen Sie den pH-Wert sorgfältig mit Säuren und Basen, die die Messung nicht beeinträchtigen, dh nicht von der ChR durchgeführt werden, wie z. B. Zitronensäure und N-Methyl-D-glucamin (NMG ⁺ ).
   4. Die Osmolarität auf 290 mOsm für die intrazelluläre und auf 320 mOsm für die extrazellulären Lösungen mit Glukose anpassen.
      Anmerkung: Leicht hypoosmotische intrazelluläre Lösungen erhöhen die Erfolgsquote des Patchings ²⁶ .
   5. Sterilfilter alle Lösungen durch 0,22 μm Filter. Lagern Sie Lösungen bei 4 ° C für zwei WochenS oder bei -20 ° C für Langzeitlagerung einfrieren.
2. Berechnen Sie die Flüssigkeitsübergangspotentiale und erstellen Sie Aufzeichnungsprotokolle.
   HINWEIS: Die Änderung der extrazellulären Chloridkonzentration nach der Herstellung der Ganzzellkonfiguration führt zu einem signifikanten Flüssigkeitsübergangspotential (LJP), das korrigiert werden muss ^{27 , 28} . LJPs können direkt gemessen oder berechnet werden, hier wird die letztere Option verwendet. In diesem Protokoll wird eine On-line-Korrektur verwendet, die ein Aufzeichnungsprotokoll für jeden externen Puffer erfordert. Für einen größeren Satz von externen Lösungen wird jedoch eine Nachkorrektur von LJP empfohlen, um eine falsche Korrektur zu vermeiden.
   1. Öffnen Sie den Knotenpunktrechner (JPC) ²⁷ und öffnen Sie den Dialog 'Neuer Experiment'. Wählen Sie dann "Patch-Clamp-Messungen". Wählen Sie "Ganzzellen-Messungen", "Standard Salz-Lösung Elektrode" und geben Sie eine Temperatur von25 ° C Zwischen jedem Schritt gehen Sie vorwärts, indem Sie die Auswahl durch Drücken der "nächsten" Taste annehmen.
      HINWEIS: Die Versuche werden bei einer Raumtemperatur von 25 ° C in einem klimatisierten Labor durchgeführt. Stellen Sie sicher, dass Pufferlösungen vor Beginn der Experimente Raumtemperatur haben. Um die Probentemperatur zu variieren, kann eine Inkubationsstufe oder Kammer verwendet werden. Die Badtemperatur kann häufig mit einem Thermometer gemessen werden.
   2. Fügen Sie alle individuellen Anionen- und Kationenkonzentrationen der pipettierten Lösung und des hochchloridhaltigen Puffers gemäß den in Tabelle 1 aufgeführten Konzentrationen hinzu.
      HINWEIS: Der JPC berechnet für die Startbedingungen einen LJP von -0,5 mV.
   3. Klicken Sie auf "New Bath Solution", um die anionische und kationische Zusammensetzung des Low-Chlorid-Puffers einzugeben.
      HINWEIS: Der JPC berechnet nun einen neuen LJP von +12,6 mV entsprechend der geänderten extrazellulären Aufzeichnungslösung.
   4. Vorbereitung von zwei LJP-korrigierten Protokollen für dieZwei Messbedingungen durch Subtrahieren des berechneten LJP von dem angelegten Haltepotential; -0,5 mV für die hohen und +12,6 mV für die Lösungen mit niedrigem Chloridgehalt. So beginnen die Protokolle mit -79,5 mV (hohem Chlorid) und -92,6 mV (niedriges Chlorid), um jeweils ein LJP-korrigiertes Ausgangs-Haltepotential von -80 mV in beiden Fällen zu erhalten.
      HINWEIS: Für die in der Materialliste genannte Datenerfassungssoftware gelten folgende Schritte.
   5. Öffnen Sie den Protokoll-Editor in der Erfassungssoftware. Wechseln Sie in das Menü "Mode" und wählen Sie "Episodic Stimulation" und beinhalten 7 Sweeps.
   6. Wechseln Sie in das Editor "Waveform" im Editor und beinhalten eine Periode von 200 ms mit 0 mV Haltepotential, gefolgt von einer 2 s Periode mit unterschiedlichem Haltepotential ab -79,5 mV für hochchlorid. Füge eine "Delta-Ebene" von 20 mV für die zweite Periode ein, um das Haltepotential um 20 mV in jedem Sweep zu erhöhen.
   7. Innerhalb der Spannungsschritte der Wellenform edEs wird eine 500 ms Beleuchtungsdauer mit 540 nm Licht (3,10 mW / mm²) angewendet. Um dies zu tun, ändern Sie das "digitale Bitmuster" des angeschlossenen Verschlusses, der die Lichtquelle steuert, um aktiv zu sein, um 500 ms nach der zweiten oben beschriebenen Periode (siehe 1.2.6).
      HINWEIS: Die Lichtintensität kann biophysikalische Eigenschaften von Kanalströmen wie Amplitude oder Inaktivierung beeinflussen. Daher sollten immer Lichtleistungsdichten gemeldet werden. Um die Lichtleistung nach Durchlaufen aller Optiken und des Deckglases zu messen, verwenden Sie ein kalibriertes Optometer. Um die Leistungsdichte zu berechnen, bestimmen Sie das beleuchtete Feld des Objektivs durch einen Objektmikrometer und teilen die gemessene Lichtleistung durch das ermittelte beleuchtete Feld auf.
   8. Speichern Sie das Protokoll für die extrachloruläre Lösung mit hohem Chloridgehalt. Ändern Sie das Protokoll und ersetzen Sie das Potential der ersten Stufe durch -92,6 mV (niedriges externes Chlorid). Speichern Sie dieses zweite Protokoll, um den extrazellulären Zustand mit niedrigem Chlorid zu messen.
3. Lysinbeschichtung von Glasabdeckungen nach angepasstem Protokoll ²⁹ .
   1. Legen Sie mehrere 100 Deckgläser in eine Glas-Petrischale und geben Sie 250 ml HCl (1 N).
   2. Legen Sie die Petrischale mit dem Deckel auf einen linearen Schüttler und schütteln Sie bei 120 U / min für 72 h, um die Deckgläser zu reinigen und anschließend mit hochreinem Wasser abzuspülen, um den pH-Wert zu neutralisieren.
   3. Einweichen in einem kleinen Volumen von 95% Ethanol zur weiteren Reinigung.
      HINWEIS: Saubere Deckgläser können in 70% Ethanol gelagert werden, bevor sie fortfahren. Arbeiten Sie unter laminarer Strömungshaube für die folgenden Schritte.
   4. Mit einem Bunsenbrenner und Pinzette, flammt jeder Deckel und überträgt ihn in eine neue Petrischale.
   5. Inkubieren Sie die Glasdeckel mit einer sterilen 50 μg / ml Poly-D-Lysinlösung für mindestens 1 h (oder über Nacht) bei Raumtemperatur unter Schütteln mit einem linearen Shaker bei 150 U / min.
   6. Waschen Sie die Deckgläser mit Reinstwasser, um überschüssiges Poly-D-lysin zu entfernen.
   7. Die Deckgläser auf sterilem Papier auftragen, um 10 min zu trocknen und sie UV-Licht für die Sterilisation (mindestens 20 min) auszusetzen.
   8. Sammeln Sie die Deckgläser in eine sterile Petrischale, die in Aluminiumfolie bis zum Gebrauch bedeckt ist.
4. Vorbereitung der DNA des Ps ACR1-Gens, das mit mCherry unter Verwendung von Standard-Molekularbiologie-Techniken fusioniert ist.
   1. Klonieren Sie die menschliche Codon-optimierte Gensequenz, die für Ps ACR1 kodiert, in ein peGFP-C1-Plasmid (CMV-Promotor, Kanamycinresistenz) im Rahmen mit dem mCherry-Fluorophor unter Verwendung von Restriktionsenzymen oder anderen etablierten Klonierungsverfahren.
      Anmerkung: Andere Fluorophore können auch verwendet werden, aber stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter-Sets zur Verfügung stehen, um ihre Fluoreszenz unter dem Mikroskop im Setup zu beobachten.
   2. Die Plasmid-DNA in chemokompatible XL1Blue E. coli- Zellen über Hitzeschock nach Standardprotokoll umwandeln und auf Agarplatten (30 μg / ml Kanamycin) ³⁰ plattieren
   3. Am nächsten Tag wird 4 ml Lysogen-Brühe-Medium mit 30 μg / ml Kanamycin mit Zellen aus einzelnen Kolonien geimpft und über Nacht bei 37 ° C und 180 U / min in einem Inkubator inkubiert.
   4. Nach der Inkubation über Nacht die Plasmid-DNA aus den Kulturen unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (siehe Werkstofftabelle ) gemäß den Anweisungen des Herstellers reinigen.
5. Samen die Zellen
   HINWEIS: Führen Sie Schritte unter einer laminaren Strömungshaube durch.
   1. Platzieren Sie bis zu drei lysinbeschichtete Glasabdeckungen nebeneinander in einer 35-mm-Petrischale.
      HINWEIS: Drücken Sie sie vorsichtig gegen den Boden der Schale, um ein Verrutschen zu vermeiden.
   2. Samen 1,5 x 10 ⁵ HEK-Zellen in 2 mL Standard Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in jeder Schale.
   3. Ergänzung all- trans retinal beiEine Endkonzentration von 1 μM Wachsen Sie die Zellen für mindestens einen Tag, bevor Sie mit Schritt 1.6 fortfahren.
6. Die Zellen vorübergehend durch Lipofektion ³¹ transfizieren.
   1. Für jede Schale von Zellen wird eine Lösung von 2 & mgr; g Plasmid-DNA (wie in Schritt 1.4 hergestellt) in 250 & mgr; l DMEM ohne FBS und 6 & mgr; l Transfektionsreagenz hergestellt (siehe Materialtabelle ).
   2. Nach 15 min Inkubation, sanft (tropfenweise) die Lösung zu den Zellen hinzufügen.
7. Agarbrücken vorbereiten
   1. Füge 0,75 g Agarose zu 50 ml steriler Kochsalzlösung (140 mM) hinzu und löst sie durch Erhitzen in einer Mikrowelle auf.
      HINWEIS: 2 - 3 M KCl für die Agarbrückenpräparation reduziert LJP aufgrund höherer Konzentration ( z. B. konstante Diffusion von der Brücke) und gleicher Mobilität von K ^{+ -} und Cl ^- Ionen, wurde aber vermieden, um Ionen - (insbesondere Cl ^- ) - Leckagen zu minimieren In t Er Badlösung ³² .
   2. Füllen Sie 10 μl Pipettenspitzen (oder einen kleinen Durchmesser Schlauch) mit der flüssigen Agarose-Lösung mit einer Spritze.
      HINWEIS: Vermeiden Sie Luftblasen in der Brücke.
   3. Nachdem die Agarbrücken abgekühlt und verfestigt sind, lagern sie in steriler 140 mM Natriumchloridlösung.
8. Bereiten Sie Aufzeichnungs- und Badelektroden vor.
   1. Entfernen Sie die Silberdrähte des Bades und der Aufzeichnungselektrode des Patch-Clamp-Setups.
   2. Polieren Sie die Drähte mit Sandpapier, um Silberchlorid aus früheren Experimenten zu entfernen. Tauchen Sie den sauberen Silberdraht in 3 M KCl ein und verbinden Sie ihn mit dem Pluspol einer 1,5 V Batterie für die elektrolytische Beschichtung mit Silberchlorid.
      HINWEIS: Eine Laborstromversorgung kann anstelle einer Batterie verwendet werden.
9. Ziehen Sie niedrigfeste Patchpipetten (1,5-3,0 MΩ) aus Glaskapillaren mit einem Mikropipettenabzieher und feuern Sie sie wie von Brown et alLass = "xref"> 33. Pipetten für den Tag der Messung staubfrei aufbewahren.
10. Schalten Sie alle Setup-Komponenten auf, um die Arbeitstemperatur 30 min vorherige Aufnahmen aufzuheizen. Stellen Sie sicher, dass die Puffer bei Raumtemperatur sind.

2. Selektivitätsmessungen

1. Starten Sie die Aufnahmen 24 bis 48 h nach der transienten Transfektion der in 1.6 beschriebenen Zellen.
2. Legen Sie einen Deckel in die Messkammer und verschließen Sie ihn mit Silikon, um ein Austreten des externen Puffers zu vermeiden. Lagern Sie die Petrischale mit den anderen Deckgläschen in einem Inkubator für den nächsten Satz von Experimenten.
3. Füllen Sie die Kammer vorsichtig mit extrazellulärem Puffer (hoch [Cl ^- ]), um das Ablösen von Zellen zu verhindern, legen Sie sie dann unter das Mikroskop und verwenden Sie das 40X-Ziel für die Zellvisualisierung.
4. Setzen Sie eine Agarbrücke über die Badelektrode und legen Sie sie zusammen mit dem Flüssigkeitsstandssensor und dem Perfusionsauslass des Badbehandlers in die Kammer.
5. Tauschen Sie die exTrazelluläre Lösung zweimal mit 1 ml frischer externer Lösung (hoher [Cl ^- ]), um restliches Kulturmedium und abgetrennte Zellen zu entfernen.
6. Bringen Sie die Zellen in den Fokus und suchen Sie nach einer transfizierten (fluoreszierenden) Zelle, die von anderen Zellen isoliert werden muss. Verwenden Sie ein Triple-Band-Filter-Set und orangefarbenes Licht (590 nm, Bandbreite 15 nm, 100% Intensität), um mCherry anzuregen und zu visualisieren.
   ANMERKUNG: HEK-Zellen können mit ihren Nachbarn durch Spaltübergänge ³⁴ elektrisch gekoppelt werden, was zu einem geringen Membranwiderstand in der Ganzzellkonfiguration führt.
7. Füllen Sie eine der gezogenen Pipetten mit intrazellulärer Lösung und entfernen Sie Luftblasen, indem Sie die Pipette mehrmals umklappen.
8. Montieren Sie die Pipette auf den Pipettenhalter und wenden Sie einen positiven Druck an, um ein Verstopfen der Spitze zu verhindern.
9. Finden Sie die Spitze der Patchpipette unter dem Mikroskop und navigieren Sie es in der Nähe der Zelle mit dem Mikromanipulator.
   HINWEIS: Die folgenden Schritte gelten für die aMplifier, Datenerfassungs- und Auswertesoftware, die in der Materialliste erwähnt wird.
10. Starten Sie den "Membrantest" in der Datenerfassungssoftware und setzen Sie einen Spannungsschritt (Testimpuls, zB 5 mV für 10 ms, Grundlinie bei 0 mV), manuell oder automatisch über spezifizierte Software mit "Badbetrieb" bei laufendem "Membrantest" In der Datenerfassungssoftware.
11. Prüfen Sie, ob der Pipettenwiderstand im gewünschten Bereich liegt (1,5-3,0 MΩ).
12. Zero Offset-Ströme durch Einstellen des Pipettenpotentials durch Drehen des Pipetten-Offset-Reglers am Verstärker während der Arbeit im "Bad-Modus" des "Membran-Tests".
13. Festlegen eines Patches in der Ganzzellenkonfiguration ²⁶ .
    HINWEIS: Die folgenden Schritte erfordern die Anwendung von positivem und negativem Druck, der an den Seitenanschluss des verwendeten Pipettenhalters geliefert wird. Dies geschieht durch die Verwendung einer Spritze, über ein Mundstück oder eine elektronisch kon-Trolled Druckregler. In diesem Protokoll werden positiver und negativer Druck über ein Mundstück angelegt.
    1. Langsam nähern sich die Zelle mit der Patchpipette von oben und entlasten den positiven Druck direkt vor dem Berühren.
       HINWEIS: Wenn die Spitze in der Nähe der Zelle liegt, wird der Widerstand leicht ansteigen; Dies wird durch eine reduzierte Größe des Testimpulses angezeigt.
    2. Ändern Sie den "Membrantest" vom "Bad-Modus" in den "Patch-Modus" und damit das Haltepotential auf das erwartete Ruhepotential der Zellen (-30 bis -40 mV).
    3. In einigen Fällen bildet sich die zellengebundene Konfiguration nach Freigabe des positiven Drucks (2.13.1), wenn nicht, sanft einen Unterdruck anwenden, um die Gigasealbildung zu unterstützen.
       HINWEIS: Die mit der Zelle verbundene Konfiguration wird hergestellt, wenn der Testimpuls zu zwei kleinen kapazitiven Peaks am Anfang und am Ende des Pulses reduziert wird und der Membranwiderstand im GΩ-Bereich liegt; Negative Spannungen bis zu -60 mV mDie gigaseale Bildung erleichtern
    4. Kompensieren Sie die Pipettenkapazität, indem Sie die "Pipettenkapazitätskompensations" -Regler drehen, um eine flache Antwort des Testimpulses zu erhalten.
    5. Bringen Sie den Patch ohne Zerstörung der Dichtung, indem Sie kurze Impulse von Unterdruck oder Unterdruck mit zunehmender Festigkeit anwenden, um eine Ganzzellkonformation zu erhalten.
       HINWEIS: Der erfolgreiche Übergang von der Zelle-zu-Ganz-Zelle-Konfiguration wird durch eine Erhöhung der kapazitiven Peaks angezeigt.
    6. Die Widerstandskompensation durch die Einstellung von Ganzzellenparametern und Kompensationsanpassungen des verwendeten Verstärkers zur genauen Klemmung des Membranpotentials auf die gewünschte Haltespannung anwenden.
       1. Schalten Sie den "Membrantest" in den "Ganzzellen" -Modus, in der "Serie Widerstandskompensation" -Panel schalten Sie "Vorhersage" und "Korrektur" bis zu 90% Vermeidung von Überschreitungen und Oszillation der kapazitiven Antwort, drehen Sie die ganze ZelleKompensation einschalten und ganze Zellenparameter mit den entsprechenden Fronttastenknöpfen ("Ganzzellenkapazität" und "Serienwiderstand") des Verstärkers auf iterative Weise einstellen, um eine ideal flache Testversiegelungsreaktion zu erhalten.
          HINWEIS: Für detaillierte Beschreibung der Serienwiderstandskompensation und -korrektur wird auf das Handbuch des Verstärkers oder der Richtlinie verwiesen, da dieses Verfahren bei verschiedenen Herstellern variiert.
    7. Nach der Festlegung der Ganzzellkonfiguration mindestens 2 Minuten vor der Aufnahme warten, um einen ausreichenden Austausch der intrazellulären Lösung durch die Patchpipette 35 zu gewährleisten.
14. Notieren Sie lichtinduzierte Ströme bei unterschiedlichen Haltepotentialen, indem Sie die zuvor eingestellten Protokolle (in 1.2) verwenden.
15. Tauschen Sie den extrazellulären Puffer in der Kammer mindestens fünfmal aus, um den Patch zu zerstören und eine neue Stromspannungsbeziehung ( vgl. Schritt 1.2) bei t aufzuzeichnenEr neue Chloridkonzentration.
    HINWEIS: Ein Perfusionssystem für automatisierten Pufferaustausch erleichtert diesen Prozess, ist aber nicht notwendig.
16. Wiederholung 2.15. Für jeden zu testenden Ionenzustand, aber wiederholt die Qualität des Pflasters zwischen den Messungen durch einen oben beschriebenen "Membrantest" zu überprüfen.
    HINWEIS: Um eine genaue Membranspannung und eine stabile intrazelluläre Ionenzusammensetzung zu gewährleisten, sollte der Membranwiderstand über 500 MΩ liegen, während der Zugriffswiderstand 10 MΩ nicht übersteigen sollte . 2.12.6). Vergessen Sie nicht, die Ganzzellenparameterkompensation für den Membrantest auszuschalten.
17. Wiederholung 2.2. Auf 2,15. Für mehrere Zellen, aber nehmen Sie einen neuen Deckzettel für jede Testreihe, um die Gesundheit der Zellen zu gewährleisten.

3. Datenauswertung

1. Passen Sie die Grundlinie jeder aktuellen Spur an, indem Sie den mittleren Strom vor der Beleuchtung subtrahieren.
2. Berechnen Sie den mittleren stationären Photostrom I _s ( HINWEIS: Analysieren Sie Peak-Photoströme oder variieren Sie die Länge der Mittelung, um den stationären Photostrom in Abhängigkeit von dem Protokoll oder der wissenschaftlichen Frage zu bestimmen.
3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1) und 3.2) für alle getesteten Bedingungen und verschiedene Zellen.
4. Zeichnen Sie die ermittelten Photoströme gegenüber dem jeweiligen Haltepotential ab.
   HINWEIS: Wenn mehrere Messungen gemittelt werden, können einzelne Aufnahmen auf eine bestimmte Bedingung oder die Kapazität der Zelle normiert werden.
5. Der Schnittpunkt der Strom-Spannungs-Relation mit der Spannungsachse stellt das Umkehrpotential dar (Nettostrom ist Null). Bestimmen Sie es durch lineare Interpolation zwischen den beiden benachbarten Datenpunkten.
   HINWEIS: Wenn es keine Polaritätsinversion von Photoströmen gibt, extrapolieren Sie linear von den letzten zwei Punkten nahe Null, um eine Annäherung des Schnittpunktes zu erhalten.
6. Durchschnittlich die ermittelten rEverspotentiale für die gleichen Bedingungen und zeichnen sie gegen die Chloridkonzentration der externen Pufferlösungen ( siehe Abbildung 2B ).

Ergebnisse

Fig. 2 zeigt repräsentative Ergebnisse, die aus Messungen nach dem beschriebenen Protokoll erhalten wurden. Bei der Beleuchtung mit grünem Licht weist der Ps ACR1 einen schnellen Übergangsstrom auf, der schnell auf einen stationären Strompegel abfällt. Nach dem Ausschalten des Lichtes zerfallen die Photoströme innerhalb von Millisekunden auf Null (Abbildung 2A ). Der Austausch der extrazellulären Chloridkonzentration bewirkt eine Verschiebung de...

Diskussion

Die Bestimmung von Umkehrpotentialen bei definierten ionischen und elektrischen Bedingungen liefert Informationen über die nach der Lichtaktivierung von ChRs transportierten Ionenspezies. Wenn nur eine Ionenspezies in einem komplexen physiologischen Medium variiert wird und die erhaltenen Umkehrpotentialverschiebungen nach dem theoretischen Nernstpotential sind, ist diese Ionensorte die einzige transportierte.

Für ChRs sind jedoch Umkehrpotentialverschiebungen in der Regel weniger ausgeprägt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEK293-Zellen	Sigma Aldrich	85120602	Menschliche embryonale Nierenzellen
Retinal	Sigma Aldrich	R2500	all-trans retinal
FuGENE HD	Promega	E2312	Transfektionsreagenz
DMEM	Biochrom	FG 0445	Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose	Roth	3810	Agarbrücken
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA		Roth 3054
FBS	Biochrome	S0615	Zellkultur
Glucose	Roth	HN06	D(+)-Glucose
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-Methyl-D-glukamin
Na-Aspartat	Sigma Aldrich	A6683	L-Asparaginsäure Natriumsalzmonohydrat
Zitronensäure	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	Restriktionsenzym
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	Restriktionsenzym
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	Restriktionsenzym
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Chemocompetent E. coli
Kanamycin	Roth	T832
Lysogeny Bouillon Medium	Roth	X964
Agar-Agar	Agar Platten
Plasmid-Aufreinigungskit	Marchery-Nagel	740727.25
Penicilin/Streptomycin	Biochrom	A 2213	Zellkultur
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma Aldrich	P6407-5MG	Deckglasbeschichtung
Microforge	Sonderanfertigung		Feuerpolitur
Serologische Pipetten	TPP		Verschiedene Größen
Reinbank	Kojair	Biowizard SL130
Rührer	IKA	RCT klassisch
Silberdraht	Science Products	AG-T25; AG-T10	Elektroden, 0,64 mm (Bad); 0,25 mm (Elektrode)
pH-Meter	Knick	765 Kalimetrisches
Osmometer	Vogel	OM 815
Mikroskop	Carl Zeiss	ID03	Feuerpolier
CO2 Inkubator	Binder	CB150
Zellkulturschalen	TPP	93040	34 mm intern Durchmesser
Deckgläser	Roth	P232	mit 15 mm Durchmesser
	Rö ssel Messtechnik	MTM12
Beamsplitter	Chroma	21011	90/10 Übertragung
Pipettenhalter	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
Kopftisch	Molekulare Bauelemente	CV203BU
Verstärker	Molekulare Bauelemente	AxoPatch200B
Digitalisierer	Molekulare Bauelemente	DigiData1400	Digitaler Analogwandler
Lichtquelle	TILL Photonics	Polychrome V	Set auf 540 nm volle Intensität
Mikroskop	Carl Zeiss	Axiovert 100
Shutter	Vincent Associates	VS25
Shuttertreiber	Vincent Associates	VCM-D1
Glaskapillaren	Warner Instruments	G150F-3	Borsilikatkapillaren mit feuerpolierten Enden OD 1,5 mm ID  0,86 mm
Mikropipettenabzieher	Sutter Instruments	P1000
Badhandler	Lorenz Messgerä tebau	MPCU
Tripleband Filterset	Chroma	69008	Fluoreszenzfilter  ECFP/EYFP/mCherry
CCD-Kamera	Watec	Wat-221SCCD
Optometer	Gigahertz Optik	P9710	Messung von Lichtintensitäten
Objektiv	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0
DIC Mikromanipulator	Scientifica	PatchStar
Aufnahmekammer	Sonderanfertigung
Netzteil	Manson	HCS-3202	Vermeidet elektrisches Rauschen durch das Mikroskop Eingebautes Netzteil
Vibrationsisolierter Tisch	Newport	M-VW-3636-OPT-01
Faradayscher Käfig	Sonderanfertigung oder jeder handelsübliche passende Tisch
Schläuche	Alle kommerziellen; z. B. Roth		Verschiedene Größen und Materialien für die Badhandhabung und die Anwendung von Pipettendruck; Agarbrücken
Linear Shaker	Sunlab Instruments	SU 1000
Flüssigsperrschicht-Potentialrechner	Molecular Devices oder direkt von Peter H. Barry		Das Programm ist in der Clampex-Erfassungssoftware enthalten oder kann von p.barry@unsw.edu.au bezogen werden
Datenerfassungssoftware	Molecular Devices	Clampex 10.X
Datenauswertungssoftware	Molecular Devices	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank oder Addgene	KF992074.1 oder Addgene Plasmid #85465	Genkodierung für PsACR1
Amplifier guide	Molecular Devices	Der Axon Guide