Massenspektrometrie und luminogenes-basierte Ansätze zur Charakterisierung von Phase I Metabolic Competency von In Vitro Zellkulturen

Zusammenfassung

Metabolic Kompetenz von in vitro - Systemen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Biotransformation und Disposition von Drogen und Giften. In diesem Protokoll beschreiben wir die Anwendung von Referenzstoffwechselsonden Phase I in Zellkulturen des Stoffwechsel zu bewerten.

Zusammenfassung

Xenobiotika metabolisierenden Enzyme spielen eine Schlüsselfunktion bei der Biotransformation von Arzneimitteln und Giften durch funktionelle Gruppen hinzufügen, die Löslichkeit zu erhöhen und die Ausscheidung erleichtern. In einigen Fällen führen diese strukturellen Änderungen an der Bildung neuer toxische Produkte. Um Tierversuche zu verringern, kann unter Verwendung von chemischem Risiko metabolisch kompetente Zellen beurteilt werden. Die Expression von Stoffwechselenzymen, ist jedoch nicht über längere Zeit stabil in viele in vitro primären Kultursystemen und ist oft teilweise oder nicht vorhanden in Zelllinien. Daher soll die Studie von Arzneimitteln, Additiven und Umweltschadstoffe Stoffwechsel in vitro idealerweise in Zellsystemen durchgeführt werden , in denen die Stoffwechselaktivität gekennzeichnet ist. Wir erklären hier einen Ansatz mit der Aktivität einer Klasse von Stoffwechselenzymen zu messen (Human Phase I) in 2D-Zelllinien und Primär 3D-Kulturen unter Verwendung von chemischen Sonden und deren Stoffwechselprodukte quantifizierbare von UPLC-Massenspektrometrie undLuminometrie. Das Verfahren kann die Stoffwechselaktivität in Zelllinien und primären Zellen, die aus einer Vielzahl von Geweben zu testen abgeleitet implementiert werden.

Einleitung

Xenobiotischen Stoffwechsel ist der Prozess , durch die Chemikalien körperfremd durch die Zugabe von hydrophilen Gruppen modifiziert sind und Konjugate ihre Ausscheidung ¹ zu erleichtern. Typischerweise ist der Metabolismus von Xenobiotika ein zweistufiges Verfahren mit der Phase I mit der Zugabe von einem oder mehreren Hydroxylgruppen ^{1, 2} hauptsächlich aus einer Oxidations bestehen. In Phase II werden die Hydroxylgruppen verwendet , wie für ein hydrophiles Konjugat wie Glucuronid Akzeptoren oder eine Sulfateinheit ^{1, 2.} Wenn eine Akzeptor-Gruppe auf den Molekülen bereits vorhanden ist, kann die Konjugation Schritt unabhängig von Stoffwechsel Phase I geschehen. Jede Reaktion wird durch eine spezifische Gruppe von Enzymen durchgeführt, beispielsweise CYPs (Cytochrom P450), die die Hydroxylierung (Abbildung 1) und Dealkylierung von chemischen Substrate ³ katalysieren. Conjugation wird durch Sulfotransferasen katalysiert, UDP-Glucuronosyltransferasen (Abbildung 1), Glutathion-S-Transferasen und N-Acetyltransferasen ^4. Jedes Gewebe und Organ wird ein spezifisches metabolisches Enzym Expressionsprofil aufweisen, mit der Leber die meisten dieser Proteine ​​exprimieren.

Abbildung 1: Beispiel für Phase I und Phase II Metabolismus für Cumarin. CYP2A6 / CYP2A13 die 7-Hydroxylierung von Cumarin katalysieren. 7-Hydroxycumarin wird von Phase-II-Enzyme zu einer UGTs Glucuronidteil konjugiert mit UGT1A6 und UGT1A9 der höchsten Aktivität zeigen.

den Metabolismus von Xenobiotika zu verstehen, ist bei der Beurteilung der Arzneimittelsicherheit und Risikobewertung von Chemikalien aus zwei Gründen entscheidend: die Reaktionskinetik wird bestimmen, wie lange ein Medikament oder Chemikalie im Körper in einer aktiven oder inaktiven Form b bleibenefore Ausscheidung; und die Ausgangsverbindung kann durch metabolische Enzyme zu einer reaktiveren, instabiler und toxischen Spezies modifiziert werden. Solche Reaktionen auch als „Bioaktivierung“ bekannt sind , vor allem von der Phase I CYP - Enzym angetrieben , sondern auch von selteneren Fällen von Phase II Konjugation ^5.

Auf dieser Grundlage ist die Fähigkeit eines in - vitro - Modell , um genau das Risiko mit einem Medikament oder einer Chemikalie ist stark abhängig von der Stoffwechsel Kompetenz des Zellsystems assoziiert vorherzusagen. Zelllinien , die von erkranktem Gewebe oder aus der Transformation von normalen Zellen verlieren oft Teil , wenn nicht alle des metabolischen Enzymprofil repräsentativ für ihre Ursprungsgewebe ^6. Die Aufrechterhaltung des normalen Stoffwechselenzymprofiles erscheint besser in primären Zellkulturen (zumindest in kurzen Zeitkulturen) und wird weiter verbessert , wenn das Gewebe in einer Matrix kultiviert wird , so dass sie ihre 3D - Struktur ¹ zu halten. Daher ist die charrakterisierung der metabolischen Kompetenz eines in vitro - Zellsystem ist eine wichtige Vorstufe für die Entscheidung in Bezug auf das Führungszellenmodell geeignet ist , chemische Sicherheitsbewertungen durchzuführen.

In diesem Papier präsentieren wir ein Protokoll , um die Aktivität und Expression von Phase - I - CYP - Enzymen in vitro mit Beispielen ihrer Anwendung mit einer hepatischen Zelllinie ⁷ und 3D primären Lungenzellkulturen ⁸ zu profilieren. CYP spezifische Substrate, deren Stoffwechselprodukte und Inhibitor-Kontrollen werden zusammen mit Masse spectrometry- und luminogene basierten Quantifizierungsmethoden beschrieben. Da einige CYPs induzierbaren sind und andere sind konstitutive, Beispiele werden auch für diese beiden Szenarien gegeben werden.

Protokoll

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf für den metabolischen Aktivitätstest ist in Abbildung 2 dargestellt. Jeder Schritt dieses Workflows wird anschließend detailliert in den folgenden Abschnitten. Detaillierte Tabellen von Reagenzien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien gegeben.

Abbildung 2: Arbeitsablauf für den Metabolic Sondenassay. Die Zellen werden ausgesät und um eine ausreichende Dichte gezüchtet. Ein CYP Induktionsschritt könnte getestet in Abhängigkeit von der Enzymaktivität erforderlich. Das Sondensubstrat und Inhibitor wird zu der Zellkultur hinzugefügt. Nach einer Inkubationszeit wird das Medium für die Analyse und die Zellen gesammelt werden zur Proteinquantifizierung lysiert. Das Medium wird für die Analyse des Stoffwechselprodukt des Sondensubstrats durch Massenspektrometrie oder Luminometrie verarbeitet.ad / 55502 / 55502fig2large.jpg“target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Zellkultur

Abbildung 3: Lichtdurchlässigkeit Micrography einer Leberzelllinie Kultur. Die Zelllinie in diesem Protokoll ⁵ beschriebenen unterscheiden , typischerweise mit einer 50% Spaltung zwischen Cholangiozyten und Hepatozyten in Kultur (100x). Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

1. Leberzelllinienkultur
   HINWEIS: Eine kommerziell erhältliche hepatische Zelllinie wurde als ein Beispiel für metabolisch kompetente Zellen verwendet. Die Zelllinie wurde aus einer hepatocarcinoma abgeleitet durch virale Infektion verursacht ⁷. Bei Konfluenz, unterscheidet diese Zelllinie in cholangiocyte- und Hepatocyten-artigen Zellen (Abbildung 3) und weitere Details können in Guillouzo ^7. Die Aufnahme von 2% DMSO zum Kulturmedium unterstützt die Differenzierung dieser Zelllinie und Expression einer Vielzahl von CYPs.
   1. Entfernen Sie die Kryoröhrchen mit Zellen aus dem flüssigen Stickstoff und auf Trockeneis für den Transport. Überträgt die Kryoröhrchen in einem Wasserbad vorgewärmt auf 37 ° C für 1-2 min, und sterilisieren, die Außenseite der Phiole mit 70% Ethanol, bevor in einer laminaren Strömungshaube platziert.
   2. Während unter sterilen Bedingungen arbeiten, öffnet vorsichtig die Kryoröhrchen überschüssigen Druck abzulassen und um den Inhalt der Kryoröhrchen in ein 10-ml-Röhrchen bei 37 ° C gefüllt, mit 9 ml vorgewärmtem Williams' E Medium pipettiert.
   3. Zentrifugieren der Lösung für 10 min bei 400 xg bei Raumtemperatur, den Überstand verwerfen und die Zellen in 5 mlproprietäres Auftau-Medium bei 37 ° C, supplementiert mit Glutamin oder einem Glutamin-Zusatz (2 mM Endkonzentration) (Williams' E + Glutaminergänzung + Auftau-Ergänzungsmittel) vorgewärmt.
   4. Count lebensfähige Zellen unter Verwendung eines 500 ul-Aliquot mit einem Zellzähler oder einem anderen geeigneten Zellen Zählverfahren.
   5. Pflanzensamen , die Zellen in einer 24-Well - Kollagen-beschichteten Platte bei einer Dichte von 0,6 x 10 & ^sup6 ; lebensfähigen Zellen / Well in einem Endvolumen von 0,5 ml Auftau - Medium.
   6. Die Platte (n) in einem Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% / 95% CO ₂ / Luft und 100% relativer Luftfeuchtigkeit.
   7. 24 h nach dem Aussäen der Zellen, ersetzen, das Medium mit 0,5 ml vorgewärmter Wartungs / Stoffwechsel Arbeitsmedium (Williams' E + Glutaminergänzung + Stoffwechsel-Ergänzung (dieses Medium enthält bereits DMSO)). Ändern Sie das Medium alle zwei Tage.
   8. Nach ein paar Tagen in Kultur bilden die Zellen eine subkonfluente trabekuläre Struktur (Abbildung 3). Die optimale StoffwechselAktivität wird typischerweise zwischen Tag 7 und 10 beobachtet, und am niedrigsten ist am Tag 4.

Abbildung 4: Querschnitt von Alcianblau Stained Atemwegszellen an der Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche Grown ^8.
Ciliated, Schleim Erzeuger- und basalen Zellen sind deutlich sichtbar. Maßstabsbalken = 250 & mgr; m.

2. Differenzierte Luftwegsepithel Kulturen
   HINWEIS: Das Protokoll ist mit einem handelsüblichen ausdifferenzierten primären Atemwegsepithel an der Luft-Flüssigkeit - Grenzfläche auf einem Einsatz ⁸ (Abbildung 4) gewachsen gezeigt. Die Gewebekultur behält eine mucocilliary Phänotyp und Zellpolarität ^8. Die Zellen können von Nasen- oder bronchiale Ursprungs sein. Hier verwenden menschliche Nasen-Zellen. Die Zellen werden auf eine Kulturplatte Format geliefert mit 24Einsätze an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Zur Erleichterung des Transports und vermeidet Medium Verschütten die Einsätze mit dem basalen Abschnitt in einer Agarose-Matrix eingebettet ausgeliefert werden mit Kulturmedium vermischen.
   1. Bei der Lieferung der Zellen, sterilisieren, die Platten 24 die Einsätze mit einer 70% igen Ethanollösung, die zuvor in einem sauberen Laminarströmungshaube platzieren.
   2. Bereiten eine sterile 24-Well-Platte durch Zugabe von vorgewärmtem 700 & mgr; l Kulturmedium proprietären.
   3. Unter Verwendung einer sterilen Pinzette übertragen die Zelleinsätze in die neue Platte vorbelastet mit Medium durch vorsichtiges den Einsatz aus dem Agarose-Matrix Verdrängen.
   4. Die Platte (n) in einem Inkubator bei 37 ° C mit einer 5% / 95% CO ₂ / Luft und 100% relativer Luftfeuchtigkeit.
   5. Alle 2 Tage übertragen die Einsätze auf eine neue sterile 24-Well-Platte vorbelastet mit 700 & mgr; l warmem proprietärem Atemwegszellkulturmedium.
   6. Beurteilung der Integrität des Atemwegsgewebes unter Verwendung von Verfahren, wie beispielsweise trans-epithelialen Widerstand (TEER) oderZilien Schwebungsfrequenz (CBF) mit einem Live - Videobilderzeugungssystem ⁹ ausgestattet mit einem Mikroskop. Die Messung des TEER und CBF wird in Kuehn ¹⁰ beschrieben.

2. CYP Aktivität Quantifizierung in Zellkulturen

HINWEIS: Als allgemeine Regel gilt, Lösungsmittel wie DMSO und Methanol verwendet werden , Stammlösungen für die verschiedenen Stoffwechselsonden und Inhibitoren in diesem Papier herzustellen. Es wird jedoch empfohlen, um die End-DMSO-Konzentration in dem Kulturmedium auf ein Minimum (1% oder weniger) zu halten, da hohe Konzentrationen metabolische Enzyme hemmen können. Wenn möglich, ist es auch Phenol zu verwenden empfohlen rot freies und serumfreien Medium während der Inkubation mit metabolischer Sonde da Phenolrot mit CYPs und Phase-II-Enzymaktivität und die Serumkomponente wie Albumin stören kann, kann die Sonde Verfügbarkeit verringern. Es ist nicht immer möglich, sich strikt an diese zu halten Richtlinien. Zum Beispiel ist Atemweg Zellkulturmedium proprietär und Phenolrot enthält. Proprietary hepatische Zelllinie Metabolismus Medium ⁷ enthält bereits DMSO über 1% , wie es erforderlich ist , für die Zellen des Hepatozyten-ähnlichen Phänotyp zu adoptieren.

HINWEIS: Schließlich hier der Begriff spezifische Sonde / Inhibitor verwendet wird , aber diese Terminologie hat mit Vorsicht zu betrachten. Tatsächlich ist es sehr selten, dass ein metabolischer Sonde ein Enzym exklusiver Substrat zu sein. Die Sonden hier beschrieben, haben jedoch eine hohe Affinität für ihr Enzym Ziel und sind daher als zuverlässiger Marker der Aktivität angesehen.

1. Metabolic Sonden, Induktoren und Inhibitoren
   1. Sonden unter Verwendung von Massenspektrometrie basierte Methoden
      HINWEIS: Die Sonden und in diesem Abschnitt beschriebenen Inhibitoren geeignet sind , die Aktivität von CYP2As ^11, CYP1A2 ¹² zu ^testen,ref "> 13, CYP2B6 ^{7, 14, 15 CYP2F1, 16} und CYP2E1 ¹⁷ durch UPLC-Massenspektrometrie. Die Sonden, Inhibitoren und CYP entspricht , ist in Tabelle 1 mit entsprechenden Referenzen beschrieben ist . Tabelle 1 listet auch das Stoffwechselprodukt des CYP Aktivität, die durch Massenspektrometrie quantifiziert. alle Arbeiten Gewebekultur und Lösungen für die Verwendung in der Gewebekultur beinhalten, ist in einer sterilen Gewebekulturhaube durchgeführt werden. eine Stammlösung kann für alle Sondensubstrate in DMSO hergestellt werden.
      1. Vor dem Experiment vorbereiten zwei Reihen von Zelleinsätzen oder Brunnen, eine Serie für die Hemmung Experiment verwenden, die andere für die metabolische Sonde nur. Vorbereiten eine dritte Reihe von Zellen als Medium Blindkontrolle. Sie können mit einem Minimum von drei Replikaten auf getrennte Platten oder in den gleichen Platten sein. Ein Beispiel für eine Platte legenout ist in Abbildung 5 dargestellt.
      2. Am Tag des Experiments, das Zellkulturmedium mit 450 & mgr; l frischem Medium ersetzt.
      3. Bereiten in einer sterilen Haube einer 10-fach-Konzentration der folgenden Lösungen, das Zellkulturmedium. Mischen 10x CYP Sonde, 10x CYP-Inhibitor und 10x CYP-Inhibitor und 10x-Sonde.
         HINWEIS: Die Master - Stammlösungen von Inhibitor und Sonde können in 100% DMSO (zB 1,000x Bestände) und weiter verdünnt in Medium hergestellt werden , um eine 10 - fach - Lösung, um eine endgültige DMSO - Konzentration von mehr als 1% mit der Zellkultur zu vermeiden , zu erhalten , . Die endgültigen 1x Konzentrationen , die für die Inkubation mit den Zellen ausgerichtet sind , sind in Tabelle 1 aufgeführt.
      4. Filtern Sie die verschiedenen 10x Sondenlösung mit einer 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter.
      5. Je 50 & mgr; l Medium, das den 10-fach CYP-Inhibitor auf die Reihe von Zellen hergestellt, für die Hemmung Experiment enthält, und prä-inkubieren für 30 min.
      6. Rrsetzen das Medium der Zellen bei der Hemmung Reihe mit 450 & mgr; l frischem Medium und 50 ul Medium sowohl 10x CYP-Inhibitor und dem 10-fach Sondensubstrat enthält.
      7. In die anderen Zellen 50 & mgr; L Medium , das mit dem Sondensubstrat 10 - fach und füge eine äquivalente Menge des Vehikels in Medium verdünnt (zB DMSO) auf eine leere Zelle steuert , wie in 5 gezeigt.
      8. Inkubieren der Zellen für 0 bis 5 min (Zeit 0, Hintergrundkontrolle) und 16 h in den Zellinkubator.
         HINWEIS: Diese Inkubationszeit wurde erfolgreich mit den Atemwegszellen und Leberzelllinie verwendet wird ; jedoch frische primäre Hepatozyten eine hohe metabolische Kompetenz verfügen, bis die Qualität der Zellpräparation und Erbgut von Spendern, also kürzere Zeiten (zB 2-4 h) könnte geeignet sein. Es wird immer ein Zeitverlauf Experiment empfohlen auszuführen, wenn verschiedene Zelllinien oder Zelltypen zu testen.
      9. Am Ende der Inkubationsperiode colldas Medium ect in getrennten markierten Röhrchen zur Quantifizierung des Stoffwechselproduktes der Sonden. Frieren Sie das Medium für die zukünftige Verarbeitung.
      10. Lyse der Zellen für die Proteinquantifizierung.
          HINWEIS: All Standard - Protein - Quantifizierung Kit und das Protokoll für diesen Schritt geeignet ist. BCA ist eine geeignete Option. Dieser Schritt ist optional, wenn die Zellen in einem anderen Test verwendet werden müssen.
   2. Medium Behandlung
      HINWEIS: Das Medium aus der Inkubation Stufe enthält den übergeordneten chemischen Sonde sowie deren Stoffwechselprodukte gesammelt. Um nur das Produkt der Umsetzung eine spezifische CYP Aktivität zu messen durch die CYP von Interesse katalysierte soll quantifiziert werden. Phase-I-Stoffwechselprodukte werden häufig im Tandem mit Phase-II-Metabolismus (Konjugation) verarbeitet und können daher nicht als solche erkannt werden. Um so eine möglichst genaue Quantifizierung einer CYP-Aktivität zu erhalten, ein Dekonjugation Schritt ist erforderlich, um zu entfernen,Phase-II-Metabolismus Modifikation. Da die Konjugation von Phase I oft Metaboliten beinhaltet Glucuronidierung oder Sulfatierung wird hepatischer durch Behandlung der Proben durch Glucoronidasen erreicht und Sulfatasen ^18. Glucuronidase und Sulfatase-Aktivität ist pH-abhängig mit der höchsten Aktivität Glucuronidase-Aktivität bei pH 4,5-5,0 und 6,0-6,5 Sulfatase erreicht wird am höchsten bei pH zu sein. Daher erfordert dieser Schritt der pH-Einstellung. In den hier beschriebenen Verfahren messen wir den pH-Wert aus praktischen Gründen pH-Streifen mit, da die meist pH-Meter-Sonden passen nicht in einem Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 ml. Im Handel erhältliche pH-Streifen kann mit einer Auflösung so günstig wie von 0,3 bis 0,2 pH-Einheiten gefunden werden.
      1. Übertragung von 250 & mgr; l Inkubationsmedium in ein 1,5 ml Mikroröhrchen und füge 4-Methylumbelliferon interne Standard-Stammlösung auf eine Endkonzentration von 100 nM zu erreichen.
      2. Der pH-Wert des Mediums auf 4,5-5,0 durch Zugabe von 1 M HCl. 1 & mgr; l HCl zu einer Zeit und überprüfen pHdurch Pipettieren von 2 ul Medium auf einen pH-Streifen. Das Erreichen einen pH-Wert von 5,0 würde erfordern in der Regel nicht mehr als 5-10 & mgr; l von 1 M HCl.
      3. Zugabe von 150 Einheiten (1,8 & mgr; l einer 85.000 Einheiten / ml Stammlösung ) von β-Glucuronidase / Arylsulfatase aus Helix pomatia und Inkubieren für 1 h bei 37 ° C. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 250 ul kaltem Methanol (-20 ° C). Lagern Sie die Proben bei -20 ° C oder Verfahren weiter.
      4. Dampfe das Lösungsmittel einer Vakuumzentrifuge bei 45 ° C verwendet wird. Rekonstituieren der Proben mit 500 & mgr; l einer 30% Acetonitril: Wasser-Lösung. Die Proben sind bereit für die Massenanalyse Spektrometrie und können bei -20 ° C in Braunglasfläschchen aufbewahrt werden.
   3. Massenspektrometrie basierte Quantifizierung
      HINWEIS: Alle UPLC und Massenspektrometer Einstellungen sind in der speziellen Supplemental Tabelle 1. Für eine quantitative Analyse, um eine Eichkurve zur Festlegung benötigt. die calibration Kurve wird durch Ausführen eines bekannten Verdünnungsbereich der Verbindung quantifiziert werden erhalten. In diesem Fall wurden die Kalibrierungskurven über 10 verschiedene Konzentrationen (Tabelle 2) erzeugt wird , mindestens 6 , von denen weniger als 20% des linearen Bereichs ¹⁹ sein sollte. Niedrigste Detektionsniveau wird als die niedrigste Konzentration ermittelt, die ein Signal größer als oder gleich gibt das durchschnittliche Hintergrundsignal 3x. Die unterste Ebene der Quantifizierung wird als Probe von niedrigste Konzentration ermittelt, die ein Signal größer oder gleich 10 x gibt den mittleren Signalhintergrund, die beide mindestens 3 unabhängige Läufe mit dreifachen Proben bestimmt über.
      1. Vorbereiten eine Verdünnungsreihe eines synthetischen Metabolit in dem Gewebekulturmedium , gemäß Tabelle 2, einschließlich den internen Standards. Ein Endvolumen von 250 ul pro Standardverdünnung ist ausreichend.
      2. Dampft die seriellen Verdünnungen von Standard beschrieben, wie in step 2.1.2.4 und Resuspendieren in einem Volumen von 30% Acetonitril: Wasser äquivalent zu dem Volumen der Medien vor Verdampfung ( zum Beispiel 250 & mgr; l 30% Acetonitril: Wasser , wenn die Ausgangsstandardlösung 250 ul Mediums betrug).
      3. In 250 ul jeder Verdünnungsreihe Standard zu einem bernsteinfarbenen UPLC Glasfläschchen zur Injektion in der UPLC-MS Autosampler.
      4. Fügen Sie die Testproben (250 ul) UPLC Fläschchen Bernstein und legen Sie sie in der UPLC Autosampler.
      5. Randomize alle Fläschchen.
         HINWEIS: Die Massenspektrometer Konfiguration wir verwenden , ist ein Hybrid - Quadrupol - triple / linearer Ionenfallen - Massenspektrometer gekoppelt mit einem UPLC detaillierten in der Supplemental Tabelle 1. Andere Plattformen würden unterschiedliche Software und Konfiguration haben aber würden ähnliche Schritte folgen, um die Quantifizierung durchzuführen.
      6. Führen Sie den UPLC-MS der Einstellungen detailliert in Supplemental Tabelle 1 in Abhängigkeit von der spezifischen Sonde zu quantifizieren.
      7. Benutzendas „Quantifizieren - Bauen Quantifizierungsmethode“ Werkzeug in Massenspektrometers Quantifizierungswerkzeugen (Table of Materials) die Kalibrierungskurve von dem erworbenen synthetischen Standard und die internen Standard zu erzeugen.
      8. Verwenden Sie die „quantitative Bestimmung Wizard“, um die Probencharge und Proben entnehmen zu quantifizieren und führen die „Quantifizierungsmethode“. Das Massenspektrometer Quantifizierungs Software zeigt eine Tabelle mit den Quantifizierungswerte der Zielverbindung in jeder Testprobe.
   4. Sonden Lumineszenz basierende Verfahren
      HINWEIS: luminogenes Sonden eine Reihe von CYP - Aktivitäten zu messen , ist im Handel erhältlich; aber nicht alle sind geeignet für zellbasierte Assays. Hier wird ein Protokoll vorgestellt, die Aktivität von CYP1A1 / CYP1B1 zu messen. CYP1A1 / 1B1 wurde ausgewählt, um darzustellen, wie die Aktivität der induzierbaren CYPs Assay und ein Beispiel zu geben, wie luminogene Sonden können als ein alter verwendet werdennative Massenspektrometrie-basierten Methoden. In Tabelle 3 sind die Konzentrationen und Inkubationszeiten wir für die Atemwegszellen und der hepatischen Zelllinie verwendet wird ; diejenigen, könnte jedoch haben für andere Zelltypen angepasst werden. Andere luminogene Sonden sind im Handel erhältlich und können als Substrate für eine Vielzahl von CYP eingesetzt werden.
      1. Bereiten ausreichend Zellen eine nicht-induzierte Kontrolle umfassen, um einen induzierten Test, und einen induzierten + Inhibitor-Test. Ein Beispiel einer Plattenanordnung ist in 5B gezeigt.
      2. Induzieren CYP1A1 / 1B1, Inkubieren der Zellen mit einer Endkonzentration von 10 nM TCDD in Medium für einen Zeitraum von 72 h (kürzeren Zeiträumen von 24 bis 48 h ebenfalls geeignet sein kann).
         ACHTUNG: TCDD ist ein Karzinogen und teratogen. Tragen Sie angemessene Schutzausrüstung, die Lieferanten MSDS Blatt überprüfen und eine Risikobewertung vor der Verwendung durchzuführen.
      3. Nach Ablauf dieser Frist, entfernen Sie das Medium, spülen Sie die Vertiefungen mit PBS 3 mal, und etwas frisches Medium hinzuzufügen.
      4. PrIOR die Zellen mit der luminogenen Reportersonde zum Inkubieren, die bezeichnete Untergruppe von induzierten Zellen mit einer Endkonzentration von 10 uM CYP1A1 / 1B1-Inhibitor, α-Naphthoflavon, in Medium für 30 min prä-inkubieren.
      5. Fügen Sie die luminogene Sonde LUC-CEE (Luciferin 6'-Chlorethylether) bei einer Endkonzentration von 50 & mgr; M zu den nicht-induzierten, induziert und induziert + Inhibitor-Zellen.
      6. Inkubieren für 4 h in einem Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubationszeit das Medium zur Quantifizierung der luminogener Sonde sammeln.
      7. Transfer von 25 ul Kulturmedium zu einer weißen opaken 96-Well-Platte und füge 25 ul Luciferin Nachweisreagenz vom Hersteller geliefert. Inkubieren für 20 min bei Raumtemperatur. Lesen Sie die Platte sofort unter Verwendung eines Luminometers.
      8. Spülen der Zellen mit PBS und Lyse für Gesamtproteinquantifizierung.
         HINWEIS: Dieser Schritt ist optional , wenn lebenden Zellen für zukünftige Experimente zurückgehalten werden. icht ist jedoch wichtig, dass Induktoren wie TCDD zu beachten sind toxisch und werden die Zellen schädigen.

Tabelle 1: Liste der Metabolic Probes, Produkte und Inhibitoren mit ihren entsprechenden Enzyme. Molekulargewicht und die empfohlenen Konzentrationen mit dem Luftweg und Leberzellen verwendet werden ebenfalls angegeben. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5: Empfohlene 24-Well - Platte Layout eine CYP - Assay durchführt. (A) Das empfohlene Layout für CYPs konstitutiv exprimierte enthält eine Reihe von Vertiefungen für das Rohling Medium, Die metabolische Sonde und der metabolische Sonde Plus-Inhibitor. Dieses Layout kann durch die Anzahl von Zeitpunkten multipliziert werden, die getestet werden. (B) Das Beispiel - Layout für induzierbare CYPs umfasst eine Reihe von gut für ein Medium blank, ein metabolisches Sonde nur die Kontrolle, induzierte Zellen (zB mit TCDD) mit den Sonden inkubiert und mit den Sonden und einem Inhibitor inkubiert.

Tabelle 2: Verdünnung von synthetischen Standards für die Eichkurven verwendet und Jeweilige LODs und LOQs. Der Verdünnungsbereich kann die Verwendung auf der Massenspektrometrie-Plattform und die Empfindlichkeit variiert. Hier verwenden wir einen Hybrid Triple-Quadrupol / linearen Ionenfallen-Massenspektrometers mit einem UPLC verbunden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieses anzuzeigenZahl.

Tabelle 3: Probe luminogenes, Inducer und Inhibitor für CYP1A1 / 1B1 - Assay. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergebnisse

Beispiele für Stoffwechselaktivität , gemessen für zwei Paare von CYPs (CYP1A1 / 1B1 und CYP2A6 / 2A13) in den Atemweg Zellkulturen aus drei verschiedenen Spendern (Atemweg M360, M370, M417) und die Leberzelllinie (Hep - Linie) sind in Abbildung 6 ^20.

CYP - Aktivität gemessen durch Luminometrie
6A zeigt die relative Lumineszenz von der CYP1A1 erzeugt / 1B1 O-Dealkylierung Aktivität von Luc-CEE (Luciferin 6'-Chlorethylether) in Atemwegszellen (3 Spender) und Leberzellen mit und ohne TCDD Induktion. CYP1A1 / 1B1 sind stark induzierbare Enzyme und sind in der Regel nicht zu einem konstitutiven Niveau in den meisten Geweben exprimiert wird. Wie in 6A zu sehen ist, kein luminogene Signal erkannt wird , wenn die Zellen nicht induziert. Wenn beiden Zelltypen sind mit TCDD vorinkubiert, einem starken CYP1A1 / 1B1 Induktor, eine Markeed luminogene Signal verglichen wird detektiert die Steuerung (6A). Dies zeigt an, daß die Luc-CEE-Sonde wird zur Freisetzung der Luciferins Einheit führender metabolisiert worden, die anschließend quantifizieren. Insgesamt ist die Aktivität von der TCDD Leberzelllinie behandelt ist geringer als bei den Atemwegszellen, auch nach Gesamtprotein Normalisierung. Dies ist nicht ungewöhnlich, da Zelllinien sind in der Regel weniger als metabolisch aktiver als Primärzellen. Die Zugabe von α-Naphtoflavon hat eine klare hemmende Wirkung auf CYP1A1 / 1B1-Aktivität in allen Zelltypen, die weiter die CYP-Abhängigkeit von Luc-CEE Stoffwechsel bestätigt.

Die Quantifizierung von CYP450 Metaboliten UPLC-MS
6B veranschaulicht die Quantifizierung der CYP2A6 / 2A13 Aktivität in Atemwegszellen aus 3 Donoren (Airway M343, M345, M347) und Leberzellen (Hep Linie) nach Inkubation mit Cumarin in Gegenwart und Abwesenheit des INHIBITOR 8-Methoxypsoralen. Die Daten werden für Gesamtprotein normalisiert. In der 0 min Cumarin Inkubation Kontrolle, keine 7-Hydroxycumarin detektiert wird (6B). CYP2A6 / 2A13 werden konstitutiv in bestimmten Geweben exprimiert wird und somit nach 16 h Inkubation mit Cumarin Bildung von 7-Hydroxycumarin wird in den verschiedenen getesteten Zelltypen, auch ohne Induktion nachgewiesen. Wenn 8-Methoxypsoralen ist ein CYP2A Inhibitor zugegeben (6B), wird die Bildung von 7-Hydroxycumarin erheblich reduziert.

Es sollte der CYP-Inhibitor in der Gegenwart angemerkt werden, es normal ist, noch eine gewisse Restaktivität zu erfassen, wie die Hemmung selten vollständig ist, und da andere CYPs könnte auch das Substrat erkennen können, aber es weit weniger effizient zu verarbeiten. Es kann auch beobachtet werden, dass die aufgezeichnete metabolische Aktivität unterschiedlich zwischen Spender sein kann, wenn unter Verwendung von Primärzellen, wie es für CYP2A6 in Atemwegszellen sichtbar ist(6B). Dies wird voraussichtlich als CYP Aktivität haftet jeden Genotyp des Spenders und Polymorphismen.

Abbildung 6: Aktivitätstest Ergebnis für CYP1A1 / 1B1 Aktivität (A) und CYP2A6 / 2A13 Aktivität (B) in der Leberzelllinie und in drei Airway Zellspendern (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE Dealkylierung Aktivität wird mit und ohne Induktion von CYP1A1 / 1B1 von TCDD gezeigt. α-Naphthoflavon wurde als CYP1A1 / 1B1 Inhibitor verwendet. Aktivität ist als relative Lumineszenz-Einheiten (RLU) normalisiert, indem die Inkubationszeit in Minuten (min) und Gesamtprotein (mg) ausgedrückt. (B) CYP2A6 / 2A13 nicht Induktion benötigen , da sie konstitutiv exprimiert werden. Cumarin 7-Hydroxylierung Aktivität in pmol / min / mg Proteine ​​wird zu verschiedenen Zeitpunkten mit und ohne den Inhibitor 8-methoxypsor gezeigtenalen. Alle Ergebnisse werden als Mittelwert von drei unabhängigen Messungen mit Standardabweichungen vom Mittelwert dargestellt. Diese Zahl wurde von Baxter ²⁰ modifiziert.

Supplemental Tabelle 1: UPLC und Massenspektrometer - Einstellungen. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Viele standardisierten toxikologischen Testsysteme verwenden Engineered Bakterien, Zelllinien oder Embryonalzellen Derzeit , die nicht repräsentativ für den normalen menschlichen Stoffwechsel ¹ sind. Dies kann zu einem ungenauen Vorhersage der potentiellen toxischen Aktivität eines chemischen oder Medizin führen. Innovative in - vitro - Modelle, wie etwa 3D - Zellkulturen und Organ auf einem Chip, werden in einem Versuch entwickelt , um die normale Morphologie und die metabolische Aktivität von menschlichen Geweben ^{21, 22, 23} besser zu replizieren. Metabolic Kompetenz ist ein Kriterium, das verwendet werden kann, zu entziffern, welche Modelle am besten geeignet sind für die toxikologische Bewertung und Drogen Biotransformation Studien.

Das Protokoll wir in diesem Papier skizziert haben, ist entworfen, um die Aktivität von CYP-Enzyme unter Verwendung von lebenden Zellen zu messen. Es ist flexibel und kann für verschiedene Zellsysteme in 2D- oder 3D-cultur verwendet werdenes bietet die Möglichkeit, entweder eine luminogener Sonden- oder einen Massenspektrometrie-basierten Ansatz zu verwenden. Beiden Verfahren sind empfindlich genug, um Nanogramm-Mengen von Materialien zu erkennen und nur eine kleine Anzahl von Zellen in einem Multi-Well-Format gezüchtet erfordern. Sie können auch auf spheroid oder Zellen in komplexen Matrices gewachsen angewendet werden. Die Auswahl des Sondensubstrat ist natürlich ein wichtiges Element des Protokolls. Die Spezifität des Assays beruht auf der selektiven Sonde des CYP Enzym und einer weiteren Schicht aus Sicherung sein kann durch die Verwendung eines selektiven Inhibitors CYP erhalten werden. Die Substrate und Inhibitoren in diesem Dokument aufgeführt sind nur einige Beispiele, aber andere können in der Literatur gefunden werden.

Es ist wichtig, mehrere Inkubationszeiten zu berücksichtigen, wenn mit einem neuen Zelltyp als negatives CYP Aktivität Ergebnis arbeiten könnte durch das Enzym auf einem niedrigen Niveau exprimiert werden. Die Zugabe eines Zelltypen, der als positive Kontrolle verwendet werden kann, wird empfohlen, dass ein, um sicherzustellen,negatives Ergebnis ein technisches Problem nicht verknüpft und mit jeder Fehlersuche zu helfen. Primäre Leberzellen metabolisch kompetent sind und können als Kontrolle verwendet werden, beispielsweise primären Hepatocyten in Suspension ist sehr einfach zu verwenden, aber ihre Lebensfähigkeit ist zeitlich begrenzt. Leberzelllinien sind mögliche Alternativen , die relativ einfach sind , wie in diesem Protokoll zu verwenden, aber einige sind besser als andere in Bezug auf die metabolische Aktivität ^{6, 21.}

Da der Test nicht zerstörend ist, es sei denn , Gesamtprotein quantitativ bestimmt wird, ist es möglich , die CYP - Aktivität im Laufe der Zeit in Langzeitstudien ²⁰ zu folgen. Dies ist ein wichtiger Punkt, da einige Zellen variable CYP Aktivität im Laufe der Zeit in der Kultur haben. Ein negatives Ergebnis könnte mit dem Mangel an Konfluenz, Fortschritten bei der Differenzierung oder Dedifferenzierung in vitro in Verbindung gebracht werden. In diesem Fall ist der Ansatz, halb quantitative, da die Daten nicht von der Gesamtmenge an Protein in jeder Zellkultur normiert sind. Es ist nicht immer möglich oder empfohlen, das Gewebe nach der Messung der CYP Aktivität als Exposition gegenüber Sonden, Inhibitoren oder Induktoren zur Wiederverwendung kann eine toxische Wirkung auf dem Gewebe hat, wie der Fall für TCDD ist.

Zellfraktionen wie Mikros könnte auch die CYP Aktivität eines gegebenen Zelltyp zu charakterisieren, verwendet werden. Mikrosomenzubereitungen erfordern jedoch eine Menge von Zellmaterial, die Zugabe von ausreichenden Cofaktoren und Puffer, um sicherzustellen, dass die Enzyme aktiv bleiben. lebende Zellen unter Verwendung entfällt den schwierigen Mikrosvorbereitungsschritt und ausarbeitet, welche Puffer und Cofaktoren am besten funktionieren.

Als allgemeine Empfehlung ist es eine bewährte Methode, das Expressionsprofil von CYP in Zellkulturen weiter zu charakterisieren, um sicherzustellen, dass sie die enzymatische Aktivität entspricht. Diese zusätzliche Ebene der Überprüfung wird empfohlen, da die Stoffwechselsonden sind nicht ENTIauf eine einzelne CYP verlassen spezifischen und erhöhte Sicherheit gibt, dass die gemessene metabolische Aktivität durch das entsprechende Enzym-Expression angepasst ist. Da CYPs Membranproteine sind , sind sie relativ schwer für Western - Blots herzustellen, deshalb quantitative RT-PCR der bevorzugte Ansatz wurde ²⁰ diese Enzyme profilieren.

Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll, ein Verfahren zum Test CYP-Enzymaktivität beschreibt, die nur eine Familie von Stoffwechselenzymen dar, wenn auch ein wichtiger. Die Flexibilität eines Massenspektrometrie-Ansatz ermöglicht die Entwicklung von Erfassungsmethoden für andere metabolische Transformationen von Sondensubstraten. diejenigen haben werden jedoch einen nach dem anderen entwickelt und es gibt derzeit weniger bekannte spezifische Sonden und selektive Inhibitoren für andere metabolische Enzymfamilien. Diese Lücke sollte für eine umfassende Beurteilung der metabolischen Kompetenz der in - vitro - Zell Syste zu ermöglichen , werden angesprochenFrau.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz & Zellen
2 μ m Spritzenfilter	Whatman	UN203NPEORG
24-Well-Platte	Corning	3524
4-Methylumbelliferon	Sigma Aldrich	M1381
5-Phenylpentin	Sigma Aldrich	CD5001437
6-Hydroxybupropion	Sigma Aldrich	H3167
6-Hydroxychlorzoxazon	Sigma Aldrich	UC148
7-Ethoxycumarin	Sigma Aldrich	195642
7-Hydroxycumarin	Sigma Aldrich	H24003
8-Methoxypsoralen	Sigma Aldrich	M3501
Essigsäure	Sigma Aldrich	695092
Acetonitril	Fisher	A/0626/17
α-Naphthoflavon	Sigma Aldrich	N5757
BCA Kit	Thermo Scientific	23227
b-Glucuronidase/Arylsulfatase	Sigma Aldrich	G0876
Bupropion	Sigma Aldrich	B102
Carbamazepin	Sigma Aldrich	C4024
Chlorzoxason	Sigma Aldrich	C4397
Kollagen	Cell Systems	5005-B
Cumarin	Sigma Aldrich	C4261
Disulfiram	Sigma Aldrich	86720
Fluvoxamin	Sigma Aldrich	F2802
Glutamax (Glutamin-Ergänzung)	Fisher	35050061
HepaRG Stoffwechsel-Ergänzung	Merck	MMAD621
HepaRG auftauen Medienergänzung	Merck	MMADD671
HepaRG	Merck	MMHPR116
Luciferin-CEE	Promega	V8751
Methanol	Fisher	M/4056/17
MucilAir Atemwegszellen	Epithelix	EP01
MucilAir Atemwegszellen Erhaltungsmedien	Epithelix	EP04MM
Phenomenex Kinetex 2.6 μ m, PFP 100A	Phenomenex	00B-4477-AN
TCDD	Sigma Aldrich	48599
thioTEPA	Sigma Aldrich	T6069
Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 µ m 2,1 x 50 mm	Waters	86003538
Williams' E media	Fisher	17704-024
Name	Unternehmen	Katalognummer	<>Kommentare
>Ausrüstung
UPLC	Waters	Acquity
QTRAP MS	Sciex	ABI Sciex 4000
QTRAP MS Software	Sciex	Analyst 1.4.2
Luminometer	Molecular Devices	SpectraMax M3
Spektralphotometer	Molecular Devices	SpectraMax M3
Zellzähler	Beckman Coulter	Vi-Cell XR
Rotationsverdampfer	Eppendorf	Eppendorf-5301