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Methodenartikel

Zebrafisch

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DOI:

10.3791/55507

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18. April 2017

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Zusammenfassung

Zebrafisch, zunächst als Entwicklungsmodell eingeführt hat an Popularität gewinnt in vielen anderen Bereichen. Die Leichtigkeit der Aufzucht einer großen Anzahl von sich rasch entwickelnden Organismen, mit der embryonalen optische Klarheit kombiniert, diente als Ausgangs zwingenden Attribute dieses Modells. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Erfolg dieses Modells weiter durch seine Ansprechbarkeit auf groß angelegte Mutagenese-Bildschirme und durch die Leichtigkeit der Transgene angetrieben worden. In jüngster Zeit haben Gen-Editing Ansätze, um die Leistung des Modells erweitert.

Für Studien der neurologischen Entwicklung der Larve Zebrafischembryo und liefern ein Modell, an dem mehrere Methoden angewendet werden können. Hier konzentrieren wir uns auf Methoden, die die Studie einer wesentlichen Eigenschaft von Neuronen, elektrische Erregbarkeit ermöglichen. Unsere Vorbereitung für die elektrophysiologische Untersuchung von Zebrabärbling spinalen Neuronen beinhaltet die Verwendung von Tierarzt Naht Kleber, um die Vorbereitung auf eine Aufzeichnungskammer zu sichern. Alternative Methoden zur Aufzeichnungvon Zebrabärbling - Embryonen und Larven betreffen die Befestigung des Präparates an die Kammer eine feine Wolframstift 1, 2, 3, 4, 5 verwendet wird . Ein Wolframstift wird am häufigsten verwendet , um die Zubereitung in einer seitlichen Orientierung zu montieren, obwohl sie verwendet wurde Larve dorsale Seite nach oben 4 zu montieren. Der Naht Leim verwendet worden Embryonen und Larven in beiden Orientierungen zu montieren. Unter Verwendung des Klebers kann eine minimale Dissektion durchgeführt werden, die den Zugang zu spinalen Neuronen ohne die Verwendung einer enzymatischen Behandlung, um dadurch eventuelle Schäden zu vermeiden. Doch für die Larven, ist es notwendig, eine kurze Enzymbehandlung anzuwenden, um das Muskelgewebe rund um das Rückenmark zu entfernen. Die hier beschriebenen Methoden sind verwendet worden, die intrinsischen elektrischen Eigenschaften von Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen an mehreren developmenta zu studierenl Stufen 6, 7, 8, 9.

Einleitung

George Streisinger Pionier bei der Verwendung von Danio rerio, das gemeinhin als Zebrabärbling bekannt, als Modellsystem für die genetische Analyse von Wirbel Entwicklung 10. Das Modell bietet mehrere Vorteile, einschließlich: (1) relativ einfach und kostengünstig Tierhaltung; (2) externe Befruchtung, die einen leichten Zugang zu Embryonen von den frühesten Entwicklungsstadien; und (3) ein transparentes Embryo ermöglicht direkte und wiederholte Beobachtungen von Zellen, Geweben und Organen, wie sie bilden.

In den folgenden Jahrzehnten stiegen einige Fortschritte weiter die Leistung des Zebrabärbling-Modells. Insbesondere Vorwärts genetischen Screens und Sequenzierung des gesamten Genoms Bemühungen kritischen Schlüsselrollen bei der Identifizierung von Mutationen und Gene gespielt zu vielen Entwicklungsprozesse 11, 12, 13, 14,„> 15, 16. Gateway - Klonierungsverfahren die Routineanwendung von transgenen erlaubt haben Ansätze 17, 18. Die jüngsten Fortschritte in der Genombearbeitung, beispielhaft dargestellt durch Transkriptionsaktivator-like (TALENS) und gruppierten regelmäßig voneinander beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -Cas9 Nukleasen, ermöglicht die gezielte Einführung von Mutationen sowie Knock-out und knock-in Ansätzen 19, 20, 21, 22. Combined, diese Methoden Zebrabärbling machen ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung der genetischen Mechanismen , bestimmte Verhaltensweisen und mehrere menschliche Krankheiten zugrunde liegen 23, 24, 25, 26, 27.

Diese Arbeit konzentriert sich auf die Entwicklung vonpsychische Regulierung und die Rolle der elektrischen Aktivität in neuronalen Entwicklung. Der Schwerpunkt liegt auf dem Rückenmark, für die das Modell Zebrabärbling mehr Vorteile bietet. Erstens ist es relativ einfach, Zebrabärbling an embryonalen und Larvenstadien zuzugreifen; Daher kann eine Rückenmarksfunktion während der Entwicklungsstadien untersuchen , die weniger Neuronen und einfachere Schaltungsanordnung 28, 29 haben. Darüber hinaus hat die Zebrabärbling Rückenmark eine vielfältige Gruppe von Neuronen, ähnlich wie bei anderen Wirbeltieren, als Faktoren , 30, 31, 32, 33, 34, 35 und durch charakteristische Unterscheidungsmuster der Transkription nachgewiesen.

Die meisten Studien in Zebrabärbling, das die Mechanismen aufzudecken darauf abzielen, die die Funktion von Rückenmarksschaltungen zugrunde liegen, vor allemdiejenigen , die Fortbewegung, sind verständlicherweise konzentrieren sich auf Larvenstadien 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 unterstützen. Allerdings sind viele der Neuronen, die das Rücken Lokomotive Netzwerken initiieren ihre Differenzierung in frühen Embryonalstadium, ~ 9-10 h nach der Befruchtung (hpf) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 bilden. Im Hinblick darauf, das Verständnis, wie die morphologischen und elektrischen Eigenschaften von spinalen Neuronen entstehen und Wechsel zwischen den embryonalen und Larvenstadien ist wichtig für eine Marktpreisefürll Verständnis der lokomotorischen Schaltungsbildung und -funktion.

Die Dissektion hier beschriebenen Methoden erlauben Patch-Clamp-Aufnahmen von spinalen Neuronen und haben an embryonalen Stadien (~ 17-48 HPF) und Larvenstadien (~ 3-7 Tage nach der Befruchtung [dpf]) erfolgreich angewandt worden. Dieser Ansatz begrenzt die Menge der Dissektion erforderlich, um Zugang zu den Neuronen von Interesse bereitzustellen. Das Protokoll unterscheidet mich von der Mehrzahl der anderen veröffentlichten Verfahren für in Tierarzt dieses Naht Leim aus Zebrabärbling spinalen Neuronen Aufzeichnung verwendet wird, sondern als ein feiner Wolframstift, den Embryo oder Larve auf die Aufzeichnungskammer zu befestigen. Die Verfügbarkeit von zwei unterschiedlichen Ansätzen (dh Naht Klebstoff gegenüber dem Wolframstift) für die Zebrabärblingembryonen oder Larven für elektrophysiologische Analyse Montage bietet Forscher mit alternativen Optionen ihre spezifischen experimentellen Ziele zu erreichen.

Als erstes Verfahren für den Zugriff auf und die Aufnahme von einem Pop ulation von primären sensorischen Neuronen, Rohon Beard-Zellen, beschrieben. Die Zellkörper dieser Neuronen liegen im dorsalen Rückenmark. Rohon-Beard - Zellen existieren in zahlreichen Wirbeltierarten unterscheiden früh in der Entwicklung, und liegen unter der embryonalen Touch - Reaktion 6, 44, 47, 48.

Zweitens Verfahren für den Zugriff auf und die Aufnahme von spinalen motorischen Neuronen sind detailliert. Zebrafisch-spinale motorische Neuronen entstehen während zwei Wellen des Neurogenese. Die früheren geborenen primären motorischen Neuronen entstehen am Ende der Gastrulation (~ 9-16 HPF), mit nur 3-4 primären motorischen Neuronen , die pro hemisegment 45, 46, 49. Im Gegensatz dazu ist die später geborene Bevölkerung von sekundären motorischen Neuronen zahlreicher und stellt sich während eines längeren Zeitraums, beginnend bei ~ 14 HPFef "> 45, 50. Secondary Motoneuron Genese Mitte trunk Segmente meistens von 51 HPF 50. Secondary motorischen Neuronen sind als abgeschlossen ist das Gegenstück von Motoneuronen in amniotes 46 sein. Interessanterweise supraspinalen Neuronen über Dopamin, regulieren Lokomotion in der Larve und sekundären Motoneuron Genese im Embryo und junge 50 Larve, 51. primäre und sekundäre Motorneuronen umfassen , die jeweils mehrere verschiedene Subtypen. jeder primäre Motoneuron - Subtyps projiziert einen peripheren Axonen , die eine charakteristische Muskelgruppe innerviert, in einer stereotypen führt, axonalen Trajektorie identifiziert. im Allgemeinen sekundäre Motorneuronen die axonale Wege zuvor eingesetzten primären motorischen Neuronen folgen. Somit wird mit Bezug auf die axonale Trajektorien, primäre und sekundäre Motorneuronen sind ähnlich, mit der Ausnahme, dass axonale Dicke und Größe a somatawieder größer für die primären Motorneuronen 45.

Drittens Methoden für die Aufzeichnung von einigen Arten von Inter diskutiert. In diesen Fällen ist jedoch eine begrenzte Menge an Entfernung anderer Rückenmarkszellen erforderlich ist, und damit das Rückenmark ist weniger intakt als bei Aufnahmen von Rohon Beard-Zellen oder motorischen Neuronen.

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Protokoll

(; Amt für Labortier Ressourcen, University of Colorado Anschutz Medical Campus IACUC) Alle Tierverfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Zebrabärbling Haltung

  1. Erhöhen und adulten Zebrabärbling (Danio rerio) bei 28,5 ° C in einem 10 h Dunkelheit / 14 Stunden Licht - Zyklus und mit einem geeigneten Wasserbehandlung und Austausch 52 aufrechtzuerhalten.
  2. Heben Zebrabärbling Embryonen / Larven bei 28,5 ° C in Embryomedium , bis sie die gewünschte Stufe (zB 2 dpf) erreichen.

2. Herstellung von Dissection Material

  1. Klebstoffspender für Zebrabärbling Dissektion
    Hinweis: Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Tierarzt Naht Kleber, um die Vorbereitung auf die Aufnahmekammer zu befestigen. Der erfolgreiche Einsatz des Naht Klebstoff erfordert die Anwendung von geringen Mengen von Klebstoff in einer kontrollierten Art und Weise. Der Kleber beginnt, sobald es zu härtentrifft eine wässrige Umgebung. Daher zieht den Kleber in eine Mikropipette und liefern geringe Mengen einen hausgemachten „glue dispenser“ verwendet, die die Anwendung von Unter- oder Überdruck durch den Mund ermöglicht. Der zentrale Teil der Klebstoffspender eine Glasbohrung, ein Stück , das in dem Paket enthalten ist , den Borsilikat dünnwandiger Glaskapillaren (1A) enthält. An einem Ende ist die Bohrung über ein Schlauchstück mit einem Mundstück verbunden ist , während das andere Ende hält die Glasmikropipette (Abbildung 1).
    1. Die schwarze Lampe aus einer Glasbohrung und ersetzen sie durch den weißen Gummiadapter aus einer anderen Glasbohrung (1B und 1C).
      Hinweis: Diese doppelsträngige Adaptor-capped Glasbohrung ermöglicht den Anschluss an eine Glas - Mikropipette an einem Ende und am anderen Ende mit einem Schlauchstück über ein kleines, geraden Polypropylen Fitting (1B, Einschub).
    2. Schneiden Sie ein Stück flexiblen Schlauch auf eine Länge von ~ 38 cm. Bringen Sie das Mundstück ( zum Beispiel, eine gelbe 200 & mgr; l Mikropipettenspitze) bis zum Ende des flexiblen Schlauchs nicht auf die Glasbohrung verbunden ist .
      HINWEIS: Das Schlauchstück sollte lang genug seine Manipulation der Glasmikropipette unter einem Binokular zu ermöglichen , während die Mikropipette gelbe Spitze im Mund ist (1D).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Klebespender. (AC) eine Glasbohrung einer Verbindung zum flexiblen Schlauch an einem Ende und die Glasmikropipette am anderen Ende . Der Gummi Adapter ermöglichen Befestigung über eine kleine Polypropylen Fitting (B, kleines Bild) auf die Rohrleitung und schließlich in eine Glas - Mikropipette am anderen Ende. (D) Der endgültige Klebstoffspender hat ein Mundstück ( zum Beispiel von einem Plas gemachttic Pipettenspitze) an einem Ende des Schlauchs und die Glasbohrung mit der angebrachten Mikropipette am anderen (Pfeilspitze).

  1. Dissection / Aufnahmekammer
    HINWEIS: Die Dissektion Kammer dient auch als Elektroaufnahmekammer. Die Kammer ist auf einem Glasträger gebildet wird unter Verwendung von vorgeschnittenen Stücken des gehärteten Siliconelastomer (2A).
    1. Um das Siliconelastomer zuzubereiten, die Basis und das Härtungsmittel zu einem konischen Kunststoffrohr in einem 4: 1-Verhältnis auf.
    2. Mischen Sie die Elastomerbasis und den Härtungsmittels gründlich und gießt die Mischung in zwei 100 mm-Petrischalen. Gießen des Elastomers mit einer Dicke von <1 mm in einer Petrischale und ~ 2,5 mm in der anderen.
    3. Lassen Sie den Silikon-Elastomer durch Kontakt mit Luft heilen für ~ 4-5 Tage. Wenn gehärtete Elastomer früher benötigt wird, inkubieren bei 60 ° C.
    4. Schnittstücke des gehärteten Siliconelastomer auf die folgenden Größen:
      1. Vom ~ 1 mmdicker gehärtete Elastomer, ausgeschnitten ein ~ 3,8 × 6,3 cm Rechteck; Dieses Stück dient als der Boden der Kammer (2A). Von der ~ 2,5 mm dicken gehärteten Silicon, schnitt ein Rechteck ~ 3,8 x 6,3 cm. Aus letzterem Rechteck, schnitt eine interne Rechteck aus ~ 2,5 x 5 cm; der resultierende Rahmen dient als die Oberseite der Kammer (2A).
    5. Um die Dissektion / Aufnahmekammer zu bilden, legt das dünne Silikon Rechteck direkt auf einen Glasträger (5 x 7,6 cm), um sicherzustellen , keine Luftblasen zwischen dem Silikon zu entfernen und dem Glas (2A). Platzieren Sie die Silikon rechteckigen Rahmen, abgeschnitten von dem dickeren Elastomer, auf der Oberseite der dünnen Bodenschicht aus Silikon.
    6. Stellen Sie sicher , dass die Silikonschichten anheften gut aneinander , und dass es keine Luftblasen zwischen den beiden Schichten (2A).
    7. die Kammer nach dem Gebrauch, Demontage durch den dicke Silikon Rechteck-Rahmen von dem unteren Silikon lay Entfernener die an die Objektträger aus Glas angebracht. Spülen Sie die Silikonoberflächen mit ddH 2 O vor der Verwendung und nach jeder Aufzeichnungssitzung und trocken mit fusselarme wischt.
    8. Lagern Sie die Kammer trocken zu Pilzwachstum zwischen den beiden Stücken von Silikon zu verhindern.
      HINWEIS: Wenn Toxinen oder pharmakologische Wirkstoffe, die nicht ohne weiteres aus dem Silikon spülen können verwendet werden, widmet spezifische Kammern für diese Zwecke.

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Abbildung 2: Electrophysiology Kammer und Dissektion Werkzeuge. (A) , um die Kammer für die Dissektion und elektrophysiologischen Ableitungen verwendet wird, besteht aus einem Glasträger , auf dem zwei Stücke von ausgehärteten Silikon - Elastomer angeordnet sind, überlagert auf dem jeweils andere für eine gut einen Rahmen und einen Boden zu schaffen. Die Größe des Brunnens, ~ 2,5 x 5 cm, ermöglicht die Verwendung von kleinen Volumina (2-2,5 ml) der extrazellulären AufnahmeLösung. Die untere Silikonschicht ermöglicht eine sichere Positionierung des Zebrafischembryos unter Verwendung von Gewebeklebstoff, der nicht auf Glas haftet. (B) mit einer Glasmikropipette (oben) zur Lieferung Kleber während der Dissektion verwendet wird . Die dünnwandige Glas gezogen wird eine lange, sich verjüngendes Ende zu schaffen, die später geschnitten wird, eine Spitze mit einem Durchmesser von ~ 75 & mgr; m zu schaffen. Der sich verjüngende Glasmikropipette ist an dem freien Ende der Klebstoffspender (1D, Pfeilspitze) und Front gefüllt befestigt mit Klebstoff durch die Anwendung von Saugen. Die andere Mikropipette (unten), gezogen , wie eine für eine Patch-Clamp - Aufzeichnung verwendet wird , für die Durchtrennung des Rautenhirns verwendet wird , und für die Hautentfernung. (C) Unter einem aufrechten Mikroskop wird ein Mikromanipulator verwendet , um die Mikropipette für die endgültigen Dissektion Schritte zu manövrieren. Eine Glas - Mikropipette, wie in B, unten, ist an den Elektrodenhalter (Pfeil) befestigt ist . Muskelentfernung wird erzielt durch einepplying Saugwirkung durch die Rohrleitung zu dem Luftauslaß (Pfeilspitze) verbunden ist . An seinem anderen Ende verbindet der Schlauch an einen Absperrhahn (schwarzer Pfeil) , die auf ihrer anderen Seite (Sternchen), Schlauch an ein Mundstück angebracht ist.

3. Dissection von Embryonen und Larven für Patch-Clamp-Aufnahmen von Spinal Neurons

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Abbildung 3: Dorsal Dissektion eines Zebrabärbling Rückenmark. (AA‘) Nach hindbrain transection (a) eines 2-dpf embryo, die Haut auf der linken und rechten Seite des Embryos geschnitten wird (b). Ein zweiter Schnitt, senkrecht zum ersten wird dann durchgeführt (c). Als nächstes wird die Haut mit einer Mikropipette abgehoben, Pinzette, die Haut zu greifen und ziehen weg ermöglicht. (B) Entfernen der Haut macht die dorsalen Rückenmark. Rostra auf die schwarze Linie, der Skin entfernt wurde und die Oberfläche des Rückenmarks (Sternchen), innerhalb der Meningen enthalten ist , ausgesetzt ist. Die Haut bleibt intakt kaudal die schwarze Linie (Pfeil). (CC‘) , um die Spitze der Glasmikropipette auf die Meningen gedrückt und rasche seitliche werden kurze Bewegungen durchgeführt , um die Meningen eindringen. (DD ‚und EE‘) Nachdem die Meningen durchstochen werden (DD ‚), ist die Mikropipette fortgeschritten und (EE‘) bewegt rostral die Meningen in zwei Segmente zu reißen. Die somata von Rohon-Beard Neuronen entstehen typischerweise bei der Entfernung der Meningen (Pfeil). (FG‘) in einem 7-dpf Larve, Muskelschichten bedecken die Dorsalseite des Rückenmarks, behindern den Zugang zu Rohon Beard-Neuronen. Nach dem Entfernen der Haut, wird die Larve mit 0,05% Kollagenase behandelt. (F) A 5 min Inkubation mit 0,05% Kollagenase ist zu streng, wasin übermäßigen Muskelschäden, wie durch den ausgefransten Muskel (Pfeil und kleines Bild) belegt. Line: (F‘) Übermäßige Kollagenase - Behandlung kann auch hier durch ihre Expression von GFP in der Tg (gfp islet2b) Rohon-Beard Neuronen (Pfeil), ergab beschädigen. In der Tg (islet2b: gfp) -Leitung, dorsal root ganglion Neuronen exprimieren auch gfp (Pfeilspitze). A briefer 1 min Inkubation mit 0,05% Kollagenase lockert ausreichend , den Muskel (G) , während die Myotom Morphologie (Pfeil und Einfügung) zu bewahren. (G‘) sind Pigmentzellen , die auf der Oberseite der meisten dorsalen Muskelschicht (Pfeilspitze). (H und I) , in der Tg (islet2b: gfp) -Leitung, Rohon Beard-Neuronen (Pfeile) und die Spinalganglien (Pfeilspitze) weiterhin gfp bei 7 dpf auszudrücken. Dorsal Ansichten von Tg (islet2b: gfp) Zebrabärbling - Embryonen bei 2 dpf (H) eind 7 dpf (I). In Feld A Maßstabsbalken = 500 & mgr; m; BE Maßstabsbalken (in Feld B gezeigt ist) = 80 & mgr; m; F 'und G' (gezeigt in Tafel F) Maßstabsbalken = 200 & mgr; m; H und I (in Panel H gezeigt), Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Dissection von Embryonen für die Aufnahmen von Rohon-Beard - Zellen
    1. Platzieren einen Embryo in einer Dissektion enthaltenden Kammer ~ 2-3 ml Ringer-Lösung (2A). Immobilisieren den Embryo durch Zugabe von ~ 100 & mgr; l von 0,4% Tricaine Lösung in die Kammer.
    2. Ziehen dünnwandiger Glasmikropipetten auf einer Mikropipette einen Kasten Filaments puller mit einer langen, dünnen Spitze, ähnlich wie bei einer Injektion Mikropipette (2B, oben) 53 zu erhalten.
    3. Bringen Sie die gezogene Glasmikropipette auf die Glasbohrung of den Klebstoffspender. Unter dem Binokular, mit Hilfe einer Pinzette , die Spitze der Glas - Mikropipette zu durchbrechen , so dass die Spitze von ~ 75 um (2B, oben).
      HINWEIS: Die Spitzengröße sollte groß genug sein, um eine effiziente Beladung des Leims in die Spitze durch die Anwendung von Unterdruck (Mund Saugen) Frontfill die Mikropipette zu ermöglichen, aber klein genug, um die präzise Anwendung des Leims über Überdruck zu ermöglichen, .
    4. Legen Sie das Glasmikropipette mit ~ 3-5 & mgr; l des Leims durch Saugwirkung durch das Mundstück aufgebracht wird. Bringen Sie den Kleber gefüllten Spitze auf die Dissektion Kammer.
      HINWEIS: Füllen des Mikropipette mit Klebstoff erfordert starken Sog. Wenn die Mikro schnell mit schwachen Sog füllt, ist die Spitze zu groß.
    5. Platzieren Sie den Embryo in der Aufzeichnungskammer (3A und 3A‘); für Aufnahmen von Embryonen und jungen Larven (≤72 HPF), gibt es keine Notwendigkeit, Muskelgewebe zu entfernen.
    6. Bringendie Spitze der Leim belastete Mikropipette in der Nähe der Spitze der Embryos / Larve während leichten Überdrucks auf die Mikropipette über das Mündungsrohr aufrechterhalten (um das Eindringen von wässriger Lösung zu verhindern). Sobald die Spitze in der Nähe des Kopfes des Embryos ist, gelten ausreichenden positiven Druck einen kleinen Tropfen Klebstoff auf den Boden der Kammer auszustoßen.
      HINWEIS: Der Kleber härtet einmal in Kontakt mit der wässrigen Lösung, so ist es wichtig, mild positiven Druck auszuüben und aufrechtzuerhalten, wie es in der Präparation Lösung gebracht wird.
    7. Werkzeug verwendet ein Präpariermikroskop Stift den Embryo / Larve in Richtung des Tropfen Klebstoff zu bewegen, so dass der Kopfkontakt mit dem Klebstoff macht. Richten Sie die Embryo Rückenseite nach oben und drücken Sie auf dem Kopf eines guten Kontakt mit dem Klebstoff zu gewährleisten.
    8. Da der Klebstoff langsam aushärtet, verwenden Sie das Sezieren Stift den Embryo / Larve neu zu positionieren, so dass es nach unten ventral-Seite liegt, dorsal-Seite nach oben. Dip das Sezieren Stiftwerkzeug in den Tropfen Klebstoff und zeichnen Fäden des Leims über und über den Kopfdes Embryos sichern ihre Position weiter.
      HINWEIS: Tricaine beschleunigt die Rate bis zu dem der Klebstoff aushärtet. Um mehr Zeit, um mit dem Leim zu arbeiten, verwenden Sie die minimale Menge an Tricaine erforderlich ist, um den Embryo / Larve zu immobilisieren. Zusätzlich kann die Härtungsrate mit verschiedenen Chargen von Klebstoff variieren. Dementsprechend wird, wenn eine neue Charge von Klebstoff verwendet wird, festzustellen, seine Härtungsgeschwindigkeit, bevor es für die Präparation verwendet wird.
    9. Sobald der Kopf fest mit dem Silikon und die Kleber befestigt ist erstarrt, opfern , den Embryo / Larve durch Transektion am hindbrain Ebene mit einer weiteren Glas - Mikropipette (Figur 3A- und 4A - a a).
      HINWEIS: Hinterhirn transection ist die Methode, die hier für die humane Tieropfer verwendet wird. Allerdings, je nach den experimentellen Zielen (zB die Studie von fiktiven Schwimmen), kann ein anderes Verfahren erforderlich sein.
    10. Vor dem Schwanz in die Kammer angebracht wird, entfernen Sie die Haut aus dem Kofferraum.
      1. Benutzenein frisches Glasmikropipette (2B, unten) die Haut mehrmals an einer Position kaudal das Rautenhirn (Figur 3A- und 4A - b b) oberflächlich zu schneiden. Pierce die Haut oberflächlich auf jeder Seite des Rumpfs für dorsal die Pipette senkrecht zur rostro-kaudal Achse bewegt montiert (Figur 3A- b) Proben oder auf der freiliegenden Seite des Rumpfes für seitlich angebrachte Proben (Figur 4A- b).
    11. Um einen Hautlappen zu schaffen Pinzette zu ergreifen, kratzen die Haut mehrmals mit der Mikropipette auf der Ebene und senkrecht zu dem ersten Schnitt in Schritt 3.1.10.1 (Figur 3A- und 4A - C c).
    12. Mit einer Pinzette, heben Sie nach und nach den Hautlappen und zieht kaudal die Haut.
      HINWEIS: Dies führt häufig bei der Entfernung von der Gesamtheit der Haut aus dem Kofferraum. Es ist jedoch sometimes notwendig, um die Haut in mehrere Abschnitte durch Durchführen einer wiederholten Abkratzen und Ziehen der Haut zu entfernen. Für einige Anwendungen, teilweise Entfernung der Haut kann ausreichend Zugang zum Rückenmark - Segmente von Interesse (3B und 4B) erlauben.
    13. einen kleinen Tropfen Kleber in der Nähe des Schwanzes der Embryos / Larve liefern. Verwenden dieser Kleber den Schwanz an den Boden der Kammer Dissektion zu befestigen. In diesem Schritt, da der Klebstoff härtet, stellen Sie die Position des Rumpfes mit dem Sezieren Stift-Werkzeug, um sicherzustellen, dass der Stamm vom Rücken her orientiert bleibt und dass sie fest an der Kammer angebracht ist.
    14. Nach dieser anfänglichen Dissektion, spülen Sie die Zubereitung extensiv mit Ringerlösung Tricaine und Debris zu entfernen. Lassen Sie die Vorbereitung für ~ 5 min ruhen.
    15. Ersetzen Sie die Dissektion Lösung mit extrazellulären Recording-Lösung. Falls erforderlich, ein Immobilisierungsmittel zur Vorbereitung hinzuzufügen (z. B. α-Bungarotoxin [final concentration von 1 & mgr; M]).
      HINWEIS: 1 uM α-Bungarotoxin lähmt 1 bis 2 dpf Embryonen innerhalb von ~ 30 min. Für ältere Larven kann eine höhere Konzentration von α-Bungarotoxin benötigt werden. a-Bungarotoxin ist in der Badlösung während Aufnahmen gehalten, die typischerweise innerhalb eines Zeitraums von 1 h durchgeführt werden. Aufzeichnungslösungen, die zweiwertige Kationen, wie beispielsweise Kobalt enthalten, erfordern nicht die Zugabe eines Immobilisierungsmittels. Für Experimente längere Aufzeichnungszeiten erfordern (über 1 h) wird die Zubereitung mit Badlösung in einer Menge von 0,5-1 ml / min perfundiert.
    16. Bewegen, um die Dissektion Kammer mit dem montierten Embryo auf die Bühne eines aufrechten Mikroskops Verbindung mit einem 40X Eintauchen in Wasser Langarbeitsstreckenziel ausgestattet.
      Hinweis: Dieses Mikroskop Teil der Anlage ist, wo Aufnahmen durchgeführt werden. Das Rigg sollte auch mit einem heads, ein Patch-Clamp - Verstärker, ein Mikromanipulator und einem Datenerfassungs- / Computersystem (2C ausgestattet werden).
    17. Montieren eines leeren Borosilikat dickwandigen Glasmikropipette auf die Elektrodenhalter der heads (Figuren 2B, 2C und unten, Pfeil). Attach - Schlauch (Innendurchmesser: 0,16 cm, Außendurchmesser: 0,32 cm, und Länge: ~ 90 cm) an einem Ende mit dem Luftauslaß des Elektrodenhalters (Pfeilspitze) und am anderen Ende mit einem Dreiwegehahn (2C , schwarzer Pfeil).
      1. Platzieren ein Mundstück an einem Ende eines weiteren Rohrstück (~ 60-70 cm in der Länge) und befestigen sie an den Dreiwegehahn am anderen Ende (2C, schwarzer Stern).
        Hinweis: Dieses Schlauchsystem ermöglicht die Anwendung von positivem und negativen Druck an die Innenseite der Aufnahmepipette während Dichtungsbildung.
    18. Bringen Sie die Mikropipettenspitze an den meisten dorsalen Teil des Rückenmarks und durchstechen sanft die Meningen. Folgen Sie mit schnellen, kurzen, Seitwärtsbewegungen loosen das Meningen (3C und 3C‘).
    19. Nachdem der Mikropipettenspitze , die Meningen durchlaufen hat, und die Mikropipette vorzurücken heben die Meningen weg von dem Rückenmark (3D und 3D‘) zu ziehen.
    20. Bewegen Sie die Mikropipette rostral, über 1 bis 2 hemisegments vorrückenden Rohon Beard-Zellen (Abbildung 3E und 3E‘) zu exponieren.
      HINWEIS: Präparieren Sie die minimale Menge an Meningen nur wenige Rohon-Beard-Zellen belichten erforderlich. Nach jeder Aufzeichnung wird zusätzliche Dissektion durchgeführt, um mehr Rohon Beard-Zellen zu zeigen. In beiden Embryonen und Larven kann Rohon Beard-Neuronen bersten gelegentlich bei Kontakt mit der Patch-Mikropipette. Andere Rückenmarksneuronen verhalten sich nicht auf diese Weise, was darauf hindeutet, dass diese einzigartigen Eigenschaften der Rohon-Beard-Zellen beeinträchtigen könnten, wie ihre Mechanosensitivität. Um dies zu unterstützen, mehrere Lösungszusammensetzungen (zB ionische Komponentenund Osmolarität) wurden getestet, und keiner dieses Verhalten von Rohon-Beard-Zellen verhindert hat.
  2. Dissektion der Larven für Aufnahmen von Rohon-Beard - Zellen
    HINWEIS: In 7 dpf Larven, Muskel rund um das Rückenmark Rücken entfernt werden muß. Folgen Sie den Schritten 3.1.1 bis 3.1.15 (mit einer Larve für einen Embryo substituierten) vor der Behandlung mit dem Enzym.
    1. Um den Muskel zu entfernen, inkubiere die Larve mit 0,05% Kollagenase für 1 min.
    2. Entfernen Sie die Kollagenase durch die Vorbereitung ~ 5-mal mit Ringer-Lösung gespült. Folgen Sie mit ~ 5 Spülungen der extrazellulären Lösung vollständig die Kollagenase zu entfernen.
    3. Trägt den Rest der Präparation, nachdem die Aufzeichnungskammer auf dem Objekttisch des Mikroskops des Aufzeichnungs rig Montag. Anhängen einer Borosilikat dickwandigen Patch - Mikropipette (2B, unten) mit dem Elektrodenhalter und brechen die Spitze der Mikropipette durch leichtes Bürsten es gegen den Boden desdie Silikonkammer.
    4. Verwenden Sie die leicht gebrochen Mikropipette den Muskel ab und setzen den dorsalen Rückenmark aufzuziehen. Um Muskelfasern aus der Zubereitung unter Absaugen durch den Schlauch an den Elektrodenhalter Steckdose. Verwenden Sie das Mikromanipulator die Mikropipette entlang der Länge der Muskelfaser zu bewegen, während abgesaugt wird.
      HINWEIS: Das Ziel ist es, zuerst die Mikropipette zu verwenden, um mechanisch die Muskeln zu lockern und dann weg zu saugen und die einzelnen Muskelfasern entfernen. Gelegentlich während der Entfernung des Muskels, wird die Mikropipette mit dem saugte Gewebe verstopft.
      1. der Mikropipette, Pinsel die Mikropipette gegen den Boden der Kammer Sprünge zu helfen, leicht, die Spitze zu brechen, während die Luft durch den Schlauch bläst den Inhalt auszustoßen.
        HINWEIS: Wenn die Größe der Mikropipettenspitze übermäßig groß wird, wird eine neue Mikro benötigt werden. Die Größe der Mikropipettenspitze ist noch kritischer, wenn die Muskelschichten cl entfernenosest an die Membranen des Rückenmarks oder Hirnhäuten (kleine Mikropipettenspitzen ermöglichen eine kontrollierte Arbeit) umgibt.
    5. Entfernen Sie die Meningen wie in den Schritten 3.1.18-3.1.20 einen neuen Mikropipette (2B, unten).

figure-protocol-4
Abbildung 4: Lateral Dissektion der Zebrabärbling Rückenmark. Montag Zebrabärbling Embryonen in einer seitlichen Orientierung erleichtert den Zugang zu motorischen Neuronen. Die Entfernung der Muskel- und Dissektion der Meningen der motorischen Neurone zu belichten unter einem aufrechten Mikroskop mit einem 40x Wasserimmersionsobjektiv durchgeführt wird , angepasst ist (siehe Abbildung 2). (A) Motoneuron - Zellkörper sind ventral und lateral innerhalb des Rückenmarks. Die Embryonen werden mit der Kammer befestigt, so dass ihre Rückenseite des Elektrodenhalters zugewandt ist.Beachten Sie, dass die Naht Kleber weiß erscheint , sobald es härtet (Sternchen). Sobald das Rautenhirn (a) durchtrennt wird, wird die Haut oberflächlich mehrmals an einer Stelle (b) kaudal das Rautenhirn geschnitten , um eine Glas - Mikropipette verwenden. Zusätzliche oberflächliche Schnitte (c), die senkrecht zu der ersten Gruppe (b) bilden eine Haut , die Lasche Pinzette zum Entfernen von der Haut greifen. (BG) Eine leere Glasmikropipette, gezogen auf eine kurze, sich verjüngende Spitze (2B, unten), ist an dem Elektrodenhalter befestigt ist . Die Mikropipette wird manövriert des Mikromanipulator für die anschließende Fein Dissektion und Entfernung von Muskelgewebe verwenden. (B) Die Spitze der Glas - Mikropipette ist zunächst leicht gebrochen , indem sie sanft gegen den Boden der Kammer Bürste, ein gezacktes Ende und ein größeres Spitzendurchmesser zu schaffen. Die Mikropipette wird entlang der Länge der Muskelfasern bewegt, während Sog angewendet wird. Muskelfasern sind eine Schicht entferntzu einem Zeitpunkt, um die Störung der zugrunde liegenden Hirnhaut zu verhindern. In Embryonen werden die meisten Rückenmuskelschichten zuerst entfernt, da diese dünner sein neigen. Die Haut wird nicht von mehr Schwanz hemisegments (Pfeil) entfernt. (C) Die dorsale Hälfte des Muskels in einer hemisegment wird entfernt (Pfeil). (D) Schwarze Linien abgrenzen eine hemisegment frei von Muskelfasern, mit intakten Meningen Abdecken das Rückenmarks (Sternchen). (EE‘) mit einer Mikropipette, wird der Druck an einer Position dorsal leicht Motoneuron somata die Meningen angewandt. Schnell, um das Piercing der Meningen kurze, seitliche Bewegungen des Mikro führen. (FF‘) der Mikropipette wird ventral vorgeschoben, in Richtung des ventralen Aspekt der hemisegment und hob die Meningen vom neuronalem Gewebe zu trennen. (GG‘) Meninges werden durchtrennt , indem die Mikropipette rostral entlang der Länge der bewegtenhemisegment. Neurone entsteht sofort aus dem Rückenmark freigelegt und ist jetzt zugänglich Flächenelektroden (Pfeil). Maßstabsbalken = 500 & mgr; m in (A); Maßstabsbalken = 100 & mgr; m in BG (gezeigt in Feld B).

  1. Dissection von Embryonen für Motoneuron und Euron Aufnahmen
    1. Platzieren Sie den Embryo in einer Dissektion Kammer enthält Ringer-Lösung und immobilisieren, den Embryo mit Tricaine, wie es in Schritt 3.1.1.
    2. Montieren des Embryos seitlich mit seiner dorsalen Seite der Seite der Kammer gegenüber, die für den Benutzer optimal ist (hängt typischerweise von Händigkeit). Führen Sie die Schritte 3.1.2-3.1.17 und sicherzustellen , dass der Embryo bleibt flach gegen die Silicon (4A und 4A‘).
    3. Verwenden , um eine Borsilikat dickwandigen Mikropipette mit einer Spitze , die gebrochen wurde auf ~ 25 & mgr; m schaben und Absaugung den Muskels entfernt und die Meningen belichten, wie in den Schritten 3.2.4-3.2.4.1 (4B beschrieben - 4D).
    4. Sobald die Muskelschichten vom hemisegment (e) von Interesse (4D) entfernt sind, ersetzt die Glasmikropipette mit einem neuen Spitze , die eine intakte (2B, unten) aufweist. Punktion der Meningen an einer Position, die dorsal an den Zielneuronen ist. Unter Verwendung des Mikromanipulators, drücken Sie die Mikropipette auf die Meningen nach unten und dann seitwärts bewegen schnell zu reißen und die Meningen (4E und 4E‘) durchqueren.
    5. Auf die Meningen Zerreißen, vorzurücken und erhöht die Mikropipette die Meningen weg von dem Rückenmark (4F und 4F‘) zu heben. Bewegen , um die Mikropipette rostral die Membran entlang der Länge des hemisegment (Figur 4G und 4G‘) zu reißen.
      HINWEIS: Für Aufnahmen von Rohon Beard-Zellen und primären motorischen Neuronen ist Dissektion begrenzt die Meningen weg von der immediat zum Clearinge Zielregion. Im Gegensatz dazu für die Aufnahmen von Inter und sekundär Motoneuronen, ist es notwendig, Neuronen im Rückenmark zu entfernen, den Zugriff auf die Zelle von Interesse zu behindern. Im letzteren Fall wird auf Grund der umfangreichen Störung der Rückenmarks-Schaltung, sind Studien zur Analyse der intrinsischen elektrischen Membraneigenschaften begrenzt.

4. Elektrophysiologische Aufnahmen von Spinal Neurons

  1. Für Aufnahmen von Rohon Beard-Zellen und motorischen Neuronen verwenden Borosilikat dickwandigen Glaskapillaren auf einen Widerstand von ~ 3 MOhm gezogen wird, wenn mit der Pipettenlösung (2B, unten) gefüllt.
    1. Anwenden positiven Druck durch vorsichtige durch den Schlauch bläst vor dem Elektrodenhalter befestigt ist, um die Mikropipette in dem Bad eingetaucht wird.
      HINWEIS: Der positive Druck Schmutz von Verstopfungen der Mikropipettenspitze verhindert, und wird durch Drehen des Dreiwegehahn in den ausgeschalteten p beibehaltenosition. Sobald in der Nähe des Zielneurons, wird der positive Druck führen zu einem markanten Einrückung des Zellmembran, ein hilfreichen Indikatoren, dass die Mikropipette nahe genug ist, Dichtungsbildung zu initiieren.
    2. Lösen der positive Druck, der durch das Absperrventil in die offene Position gedreht wird, während die Anwendung zusätzlicher Licht Saugwirkung durch das Mundstück.
    3. Nach der Bildung einer GOhm-Dichtung zwischen der Zellmembran und der Mikropipettenspitze, gelten kurze Impulse des Saugens die Membran und erreichen eine Gesamtzellkonfiguration bersten.
    4. eine stabile Gesamtzellkonfiguration, mit einem Eingangswiderstand 500 MOhm und einem Zugangswiderstand 10 MOhm, erhält in Aufnahmen entweder spannungs- oder strom-clamp Modus nach dem Aufbau.

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Ergebnisse

Wir haben erfolgreich von Rohon Beard-Neuronen in 17 hpf Embryonen bis 7 dpf Larven (5A und 5B) aufgezeichnet. Wenn Rohon Beard-Zellen aufgenommen wurden, wurde die Zubereitung montiert dorsal-Seite nach oben. Eine solche Montage ermöglicht die eindeutige Identifizierung von Rohon-Beard auf ihrer oberflächlichen dorsalen Positionen und große Größen soma Zellen basieren. Die Identifizierung wird durch das stereotypisch hyperpolarisiertem Ruhemembranpotent...

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Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die elektrische und morphologische Charakterisierung von sensorischen und motorischen Neuronen von Zebrabärbling Embryonen nach minimaler Zerlegung des Rückenmarks. Neurone bleibt für mindestens 1 h gesund, die Frist auf diesen Aufnahmen auferlegt. Neurone wurden unter Verwendung der Standard Gesamtzellkonfiguration aufgezeichnet, sowie von nukleierten Patches; Das letztere Verfahren minimiert Raum-clamp - Probleme , die eine detaillierte Untersuchung der biophysikalischen lon...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (F32 NS059120 zu RLM und R01NS25217 und P30NS048154 zu ABR) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vakuumfilter/Vorratsflasche, 0,22 mm PoreCorning431096
Spritzenfilter 0,2 mmWhatman6780-2502
TricainSigmaA-5040Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz 
α-BugarotoxinTocris11032-79-4
TetrodotoxinTocris4368-28-9
Alexa-549 HydrazinsalzMolekulare SondenA-10438Fluoreszenzfarbstoff
Spin-X ZentrifugenröhrenfilterCorning8161
GlasobjektträgerFisher12-550C
Sylgard Silikon Elastomer-KitDow Corning184Silikon-Elastomer-Petrischalen
Falcon351029
Kapillaren aus BorosilikatglasHarvard Apparatus30-0038Innen- und Außendurchmesser von 0,78 und 1,0 mm (dünnwandige Glaskapillaren)
Kapillaren aus BorosilikatglasDrummond Scientific1-000-1000-100Innen- und Außendurchmesser von 1,13 und 1,55 mm (dickwandige Glaskapillaren)
Miniatur-Stabverschraubung aus Polypropylen mit Widerhaken Cole-Palmer6365-90
Vetbond Klebstoff 3M1469SB
Collagenase XISigmaC7657
MikroelektrodenabzieherSutter Instruments  Modell P-97 
VerstärkerMolecular DevicesAxopatch 200B
KopftischMolecular DevicesCV203BU
Motorisierter Mikromanipulator   Sutter InstrumentsMP-285
Tygon-SchlauchFisher14-169-1BID 1/16 IN, OD 1/8 IN und WALL 1/32 IN (flexible Laborschläuche)
ElektrodenhalterMolecular Devices1-HC-U
Pharmaseal Dreiwege-Absperrhähne BaxterK75
DigitizerAxon InstrumentsDigidata 1440A
Inverses MikroskopZeissAxioskop2 FS plus
40X/0,80W Achroplan ObjektivZeiss
Software zur Datenerfassung und -analyse Axon InstrumentsPClamp 10 - Clampex und Clampfit 
MikropipettenabzieherSutter InstrumentsModell P-97
NameCompany<strong>KatalognummerComments
Dissektions- und Aufzeichnungslösungen (in mM)
Alle Lösungen, mit Ausnahme der intrazellulären, sind ~2-3 Monate haltbar, wenn sie filtriert (0,22 mm Filterbecher) und bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
Die intrazelluläre Lösung wird filtriert (0,2 mm Spritzenfilter) und gefroren (-20 &Grad; C) in kleinen Aliquoten, die am Tag der Anwendung einzeln aufgetaut werden.
Sezieren/Klingeln" s Lösung145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (mit NaOH)
Pipette (intrazelluläre) Aufnahmelösung135 KCl, 10 EGTA-Säure, 10 HEPES; pH 7,4 (mit KOH).
Bad (extrazellulär) zur Aufzeichnung von Lösung/Spannungs- und Stromzange125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (mit NaOH).
Alexa-594 Hydrazinsalz-Stammlösung. Bereiten Sie einen 13,2 mM Stamm in ddH2O, aliquot (~100 µ l) und bei -20 °C lagern. Zur Verwendung wird die 132-fache Lösung mit Pipettenlösung auf eine Endkonzentration von 100 mM verdünnt. Nach der Verdünnung die Alexa-594 mit Pipettenlösung filtrieren  mit einem Zentrifugenrohrfilter.
NameUnternehmen<>KatalognummerKommentare
Immobilisierungsmittel
0,4%iges Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (Tricain)Bereiten Sie eine 0,4%ige Stammlösung in 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricain/100 mL 0,2 M Tris
Den pH-Wert mit NaOH auf 7 einstellen und bei -20 °C lagern.
Zur Verwendung die Stammlösung ~25-fach im Embryomedium verdünnen
250 mM α-BungarotoxinBereiten Sie einen 250 mM Stamm in ddH2O (1 mg/500 mL) vor, bereiten Sie 100 & Mikro vor; L aliquots und sotre bei -20 °C.
Zur Verwendung 2.500-fach mit extrazellulärer Lösung auf eine Endkonzentration von 100 nM verdünnen.
1 mM TetrodotoxinBereiten Sie eine 1 mM Brühe in ddH2O (1 mg/3 mL) vor, bereiten Sie 100 & micro; L aliquots und sotre bei -20 °C.
Zur Verwendung 2.000-fach mit extrazellulärer Lösung auf eine Endkonzentration von 500 nM verdünnen.

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