Hier präsentieren wir ein Protokoll zum induzieren Toleranz in der Transplantationsmedizin und in Vitro und in Vivo zu bewerten, die unterdrückende unterschiedliche Zelle Teilmengen des Empfängers und der Immunstatus des Empfängers in Richtung Spender oder exogene Antigene.
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Methodenartikel
In Vitro und In Vivo Beurteilung der T, B und myeloische Zellen Suppressive Aktivität und humorale Reaktionen von Transplantationspatienten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Hauptanliegen der Transplantation ist, spezifische Toleranz durch Induktion von regulatorischen Zellen zu erreichen. Das Verständnis der Mechanismen der Toleranz erfordert zuverlässige Modelle. Hier beschreiben wir Modelle der Toleranz gegenüber cardiac Allograft in Ratte, induziert durch Blockade der Costimulation Signale oder durch Hochregulation von immunregulatorische Molekülen durch Gentransfer. Jedes dieser Modelle erlaubt in Vivo Generierung von regulatorischen Zellen wie regulatorische T-Zellen (Tregs), regulatorische B-Zellen (Bregs) oder regulatorische myeloische Zellen (RegMCs). In diesem Manuskript beschreiben wir zwei zusätzliche Protokolle, die verwendet wurden, um zu identifizieren und definieren in Vitro und in Vivo -regulatorischen Zell-Aktivität zu bestimmen, ihre Verantwortung in der Toleranzinduktion und Wartung. Erstens ein in-vitro- suppressive Assay erlaubt schnelle Identifizierung von Zellen mit suppressive Kapazität auf Effektor Immunantworten in einer Dosis-abhängigen Weise und kann für weitere Analysen wie Cytokine Messung oder Zytotoxizität verwendet werden. Zweitens markiert die Adoptiveltern Übertragung von Zellen von einem toleranten behandelten Empfänger an einen neu bestrahlten veredelte Empfänger der tolerogene Eigenschaften dieser Zellen im Transplantat gerichtet Immunantworten zu kontrollieren bzw. Umwandlung von neuen regulatorischen Zellen ( infektiöse Toleranz bezeichnet). Diese Methoden beschränken sich nicht auf Zellen mit bekannten phänotypische Markierungen und können auf jede Zellenbevölkerung ausgedehnt werden. Darüber hinaus gerichtet Spender Allospecificity der regulatorischen Zellen (ein wichtiges Ziel im Feld) mithilfe Dritter Spenderzellen beurteilt werden können oder in Vitro oder in Vivo-Transplantat. Schließlich, um die spezifischen tolerogene Kapazität dieser regulatorischen Zellen zu bestimmen, bieten wir Protokolle zur Beurteilung der humoralen Anti-Spender Antikörperantworten und die Fähigkeit des Empfängers, humorale Reaktionen gegen neue oder ehemalige bekannte Antigene entwickeln. Die Modelle der Toleranz beschrieben können verwendet werden, um weitere regulatorische Zellen zur Ermittlung neuer Biomarker und immunregulatorische Moleküle, charakterisieren und sind anpassungsfähig an andere Transplantation Modelle oder Autoimmunerkrankungen in Nagetier oder menschliche.
Einleitung
Cardiac Allograft in Ratte ist ein zuverlässiger Organ Transplantation Modell zur Bewertung der Toleranz-Induktion-Behandlungen, um die Mechanismen der Toleranzinduktion und Wartung, zu entschlüsseln und hat das Potenzial, funktionell zuständigen und dominante regulatorische Zellen induzieren. Die folgenden Protokolle beschreiben eine voll Missverhältnis heterotopisch kardiale Transplantat von Lewis 1W Spender Ratte (LEW.1W, RT1u) in eine Lewis 1A Empfänger Ratte (LEW.1A, RT1ein). In dieser Kombination Transplantat akuten Abstoßung tritt schnell (in ca. 7 Tage) und von Graft schlagen Messung durch Abtasten des Bauches leicht beurteilt werden kann....
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Protokoll
Hinweis: Alle Protokolle hier von einer Ethikkommission genehmigt worden und sollte in einer sterilen Weise durchgeführt werden.
1. Generation der Toleranz in einem Modell der Cardiac Allograft in Ratte
-
Lew.1W LEW.1A Allograft Verfahren
- Ein Spender-Männchen LEW.1W Ratte mit Isofluran-O2 einatmen, ergänzt mit 1 % N2O nach 5 min Platz das Tier in dorsaler Dekubitus und desinfizieren Sie den Bauch mit Betadine, führen Sie eine Thorakotomie zu betäuben (d.h., Schnitt in die Pleuraraum der Brust).
- Klemmen Sie die minderwertigen und überlegenen Gian Zanichelli, ligature ....
- Ein Spender-Männchen LEW.1W Ratte mit Isofluran-O2 einatmen, ergänzt mit 1 % N2O nach 5 min Platz das Tier in dorsaler Dekubitus und desinfizieren Sie den Bauch mit Betadine, führen Sie eine Thorakotomie zu betäuben (d.h., Schnitt in die Pleuraraum der Brust).
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Ergebnisse
Die Beurteilung der suppressive Aktivität nach Sortierung der APCs (Abbildung 1) und Tregs Responder Zellen gleichzeitig (Abbildung 2) oder einzeln (Abbildung 4), und alle anderen vermeintlichen regulatorischen Zellen (Abbildung 3), kann fertig in Vivo durch direkte Injektion der regulatorischen Zellen und in-vitro- Messung der CFSE-Helligkeit (
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Diskussion
Adoptiveltern Übertragung des gesamten Splenocyten in einen neu verpflanzten Empfänger ist eine effiziente Möglichkeit, das Vorhandensein von regulatorischen Zellen induziert oder durch eine Behandlung potenzierte erkennen. Host Bestrahlung-induzierte vorübergehende Lymphopenie fördert Zelle Überleben nach der Übertragung und Etablierung der Toleranz. Darüber hinaus lässt subletale Bestrahlung Zeit für Zellen mit tolerogene Eigenschaften zum neuen regulatorischen Zellen während Immunrekonstitution, ein Phänomen namens in.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde realisiert im Rahmen des Projekts Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) ist Teil des Programms "Investissements Avenir" französische Regierung verwaltet durch die ANR (ANR-11-LABX-0016-01) und die IHU-Cesti Projekt auch durch die " Investissements Avenir"französische Regierung Programm, verwaltet von der französischen nationalen Forschung Agentur (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti-Projekt wird auch von Nantes Métropole und Région Pays De La Loire unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| animalsLEW.1W | |||
| und LEW.1A Ratten | Janvier Labs, Frankreich | 8 Wochen alt, | |
| BN Drittspenderratten | Janvier Labs, Frankreich | 8 Wochen alt, | |
| name | company | catalogue number | comments |
| reagents | |||
| AdCD40Ig | Viraler Vektorkern, INSERM UMR 1089, Nantes, Frankreich | hausgemachte Plasmide | |
| IL34-AAV | Viraler Vektorkern, INSERM UMR 1089, Nantes, Frankreich | hausgemachte Plasmide | |
| FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Frankreich | hausgemachte Plasmide | |
| anti-TCRab | Hybridom aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, UK | R7/3 Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluororophor-Kopplung |
| Anti-CD25 | Hybridom aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, UK | OX39 Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluorophor-Kopplung |
| Anti-CD8-Hybridom | aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, Großbritannien | OX8-Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluororophor-Kopplung |
| Anti-CD45RA-Hybridom | aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, Großbritannien | OX33-Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluororophor-Kopplung |
| Anti-CD161 | Hybridom aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, Großbritannien | 3.2.3 Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluorophor-Kopplung |
| Anti-CD11b/c | Hybridom aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluorophor-Kopplung |
| Anti-TCRgd | Hybridom aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, UK | V65 Klon | Selbstgemachte Kultur, Reinigung und Fluorophor-Kopplung |
| Anti-CD45RC-Hybridom | aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, Großbritannien | OX22-Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluororophor-Kopplung |
| Anti-CD4-Hybridom | aus der European Collection of Cell Culture, Salisbury, Großbritannien | OX35-Klon | Hausgemachte Kultur, Reinigung und Fluororophor-Kopplung |
| Anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 Klon | |
| Anti-Ratte IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
| Anti-Ratte IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| Anti-Ratte IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| Anti-Ratte IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| Anti-Ratte IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
| Streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphat-Pufferlösung ohne Calcium und Magnesium | |
| Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
| TMB-Substrat-Reagenzien-Kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE-Zellproliferations-Kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | ||
| RPMI 1640 mittel 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
| Hepes Puffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
| nicht-essentielle Aminosäuren | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
| Natriumpyruvat | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
| 2 Beta-Mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | ||
| Zellproliferationsfarbstoff eFluor® 450 Zellen | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
| Glutamin | Sigma, Saint-Louis, USA | ||
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | ||
| Kollagenase D | Roche Diagnostics, Deutschland | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | ||
| NaCl 0,9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Ziegen-Anti-Maus-IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
| Betadin | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| Isofluran | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| Naplbuphin | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| Terramycin | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| Leitlinien | |||
| Meloxicam | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Leitlinien | ||
| Vollständiges Freund's Adjuvans | |||
| Rompun | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| Ringer-Laktat | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| Ketamin | Beziehen Sie sich auf die institutionellen Richtlinien | ||
| für rote Blutkörperchen | Verdünnen Sie 8,29 g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1 g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) und 37,2 mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800 ml H2O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,2-7,4 ein und vervollständigen Sie ihn mit H2O auf 1 l. | ||
| Kollagenase D | Verdünnen Sie 1 g Kollagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%) | Fügen Sie 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) und 20ml FCS bis 1ml PBS 1X | ||
| CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | hinzuVerdünnung 50&Mikro; g (=1 Fläschchen) CFDA SE (Komponente A) in 90μm; l DMSO-Lösung (Komponente B), um eine 10 mM Stammlösung zu erhalten. Dann verdünnen Sie die Stammlösung bei 1/20 000 in PBS 1X, um einen Wert von 0,5 μm zu erhalten. M Lösung | ||
| Komplettmedium für die Kokultur | 500 ml komplettes RPMI-1640 Medium mit 5 ml Penicillin (80 Einheiten/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamin, 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren (100X), 5 ml Pyruvat-Natrium (100 mM), 5 ml HEPES-Puffer (1 M), 2,5 ml b Mercaptomethanol (7 ml 2-Bmercaptoethanol-Stamm verdünnt in 10 ml RPMI), 10 % FCS | ||
| name | company | Katalognummer< | strong>comments |
| equipments | |||
| falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
| falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
| Sieb | |||
| Corning Plastikkulturschalen | VWR, Pessac# | 391-0439 | |
| 100&Mikro; M und 60&Micro; m Gewebefilter | Sefar NITEX, Heiden, Schweiz# | 03-100/44 und #03-60/35 | |
| 96 Vertiefungen U-Bodenplatten für Kokultur | Falcon U-Bottom Gewebekulturplatte, steril, Corning | #353077 | |
| 96 Wells V Bodenplatten für FACS-Färbungen | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
| 96 Wells ELISA Platten mit flachem Boden | Nunc Maxisorb | ||
| Seringue für Milzcrush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
| ELISA Reader | SPARK 10M, Tecan, Schweiz | SPARK 10M, Tecan, Schweiz | |
| Zentrifugenbad | |||
| Röntgenstrahler | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
| Solarrührwerk | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| Magnet | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 12302D |
Referenzen
- Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
- Bézie, S., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
