Methodenartikel

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

DOI:

10.3791/55533

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1. Mai 2017

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1Laboratory of Epidemiology and Population Science, National Institute on Aging, National Institutes of Health

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Zusammenfassung

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In Reaktion auf zellulärem Stress oder Schädigung, proliferierenden Zellen kann ein spezifisches Programm induzieren, die einen Zustand der Langzeit-Zellzyklusarrest einleitet, zelluläre Seneszenz bezeichnet. Akkumulation von seneszenten Zellen erfolgt mit organismal Altern und durch kontinuierliche Kultivierung in vitro. Seneszenten Zellen beeinflussen zahlreiche biologische Prozesse, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Gewebereparatur und -regeneration, Tumorunterdrückung und Alterung. Kennzeichnend für seneszenten Zellen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal); p16 INK4A, p53, p21 und Ebene; höhere Niveaus von DNA-Schäden, einschließlich γ-H2AX; die Bildung der Seneszenz-assoziierte Heterochromatin Foci (SAHF); und der Erwerb eines Seneszenz-assoziierte Sekretorische Phenotype (PUSA), ein Phänomen, das durch die Sekretion einer Anzahl von pro-inflammatorischen Cytokinen und Signalmolekülen charakterisiert. Hier beschreiben wir Protokolle sowohl für replikativen undDNA Seneszenz in kultivierten Zellen-Schädigung induziert. Außerdem markieren Techniken, die wir den seneszenten Phänotyp mit mehreren Seneszenz-assoziierte Marker, einschließlich SA-β-gal, γ-H2AX und SAHF Färbung und zu quantifizieren Protein und mRNA-Spiegel von Zellzyklusregulatoren und SASP Faktoren zu überwachen. Diese Methoden können zur Beurteilung der Seneszenz in verschiedenen Modellen und Geweben angewandt werden.

Einleitung

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Mehr als vor einem halben Jahrhundert, Hayflick und Kollegen beschrieben , wie nicht - transformierten Zellen in Kultur vermehren, aber nur für einen begrenzten Zeitraum 1. Langzeitkultivierung von humanen Fibroblasten verursacht die Zellen vermehren zu stoppen; jedoch waren sie metabolisch aktiv, und wurde dieser zelluläre Seneszenz bezeichnet. Seneszenz können zur Hemmung der Tumorgenese von Vorteil sein, sie kann aber auch nachteilig sein, wie es angenommen wird , auf den Verlust der Regenerationsfähigkeit beizutragen , die mit dem Altern auftritt , 2, 3. Seneszenten Zellen wurden i....

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Protokoll

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1. Inducing replikative Seneszenz

  1. Auftau - low-Passage humane diploide Fibroblasten (zB, WI-38 und IMR-90) oder ein anderes Zelllinie.
    HINWEIS: Hier menschliche diploide Fibroblasten wurden verwendet, aber diese Protokolle können verwendet werden, Seneszenz in anderen Zelltypen, wie Endothel, Epithel oder mesenchymalen Stammzellen zu bewerten. Kultivierungsbedingungen können für die verschiedenen Zelltypen verwendet, aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsraten oder Wachstumsbedingungen optimiert werden.
    HINWEIS: Die Zellen sollten eine Spindel Morphologie sein wuchernden und haben (siehe Abbildung 1 für eine schema....

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Ergebnisse

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Die Figuren 2 - 6 repräsentative Ergebnisse von SA-β-gal - Färbung zeigen; Anfärben für γ-H2AX und SAHF; Beurteilung der Proteinspiegel von p16 INK4A, p21 und p53; und mRNA und Protein-Ebene von seneszenten-assoziierte Moleküle. Erhöhter SA-β-gal-Färbung erfolgt mit replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz. Auch beachten Sie die morphologischen Veränderungen, die mit Seneszenz auftreten. Die Zellen werden vergrößert und flach im Vergleich zu den Sp.......

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Diskussion

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unter Verwendung von humanen diploiden Fibroblasten Hier haben wir Methoden zur replikativen und DNA-Schädigung induzierte Seneszenz beschrieben. Zusätzlich sind Techniken zum Protein- und mRNA-Mengen verschiedenen Seneszenz-assoziierte Proteine ​​Quantifizieren enthalten sind, sowie Färbung für SA-β-gal und für den DNA-Schädigung Marker γ-H2AX. Diese Protokolle können weit seneszenten Phänotypen verwendet werden , sowohl in vitro zu bewerten und in vivo, obwohl viele Einschränkungen bestehen für die C.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von der Intramural Research Program der National Institutes of Health, National Institute on Aging. Die Autoren möchten Myriam Gorospe und Kotb Abdelmohsen für viele hilfreiche Diskussionen über die Seneszenz und Kotb Abdelmohsen für auch kritisch Lesen des Manuskripts. Wir danken auch unser Labor Mitglieder, vor allem Douglas Dluzen für kritisch, das Manuskript zu lesen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
16% Tris-Glycin-GeleInvitrogenXP00160BOX
Säure-Phenol ChCl3AmbionAM9720
Alexa-Fluor 568 Ziegen-Anti-Maus-AntikörperInvitrogenA11031:300 Verdünnung
ZellheberCorning Inc.3008Zellschaber
ECL Anti-Maus HRP gebundener AntikörperAmershamNA931V
ECL Plus Western Blotting SubstratPierce32132ECL
DAPIMolekulare SondenMP01306Lager 5 mg/ml in dH2O
GAPDH AntikörperSanta Cruzsc-322331:1.000 - 5.000 Verdünnung
GlycoBlueAmbionAM9515
Histon H3-Dimethyl K9 monoklonaler AntikörperAbcam12201:500 Verdünnung
Humaner IL-6 Quantikine ELISA AssayR& D systemsD6050
IL-8 Quantikine ELISA-Assay für den MenschenF& T D systemsD8000C
Human GROa Quantikine ELISA AssayR& D-SystemeDRG00
N-N-DimethylformamidSigmaD4551DMF
p16 monoklonaler AntikörperBD Biosciences51-1325gr1:500 Verdünnung
p21 monoklonaler AntikörperMillipore05-3451:750 Verdünnung
p53 monoklonaler AntikörperSanta Cruzsc-1261:500 Verdünnungsklon DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC-Konjugat-AntikörperZellsignalisierung97191:2.000 Verdünnung
POWER SYBR-grüner PCR-Mastermix Applied Biosystems4367659
Vorgefärbte MolekulargewichtsmarkerBiorad161-0374
ProLong Gold Antifade InvitrogenP36930
PVDF-MembranThermo Scientific88518
Seneszenz β-Galactosidase-Färbekitdie Zellsignalisierung9860
TRIzolAmbion/Life Tech10296028
1 für

Referenzen

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  1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  3. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F.

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Schlagwörter

Induktion der SeneszenzSA Gal F rbungGammabestrahlungDNA Sch digungSASP QuantifizierungRT qPCR AnalyseELISA NachweisSeneszenzmarkerZellzyklusarrest

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