In - vitro - Methoden zum Vergleich der Zielbindungs und CDC Induktion zwischen Therapeutische Antikörper: Anwendungen in Biosimilarity Analyse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt den in vitro - Vergleich von zwei wichtigen funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindungs und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC) Induktion. Die Verfahren wurden für eine Seite-an-Seite-Vergleich zwischen Referenz Rituximab und einem Rituximab biosimilar eingesetzt. Diese Assays kann während der Biosimilar Entwicklung oder als Qualitätskontrolle in der Produktion eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Therapeutische monoklonale Antikörper (mAbs) sind für die Behandlung von verschiedenen Pathologien, einschließlich Krebs, relevant. Die Entwicklung von biosimilaren mAbs von Pharmaunternehmen ist eine Marktchance, aber es ist auch eine Strategie zur Erhöhung der Arzneimittelzugänglichkeit und zur Verringerung der Therapiekosten. Die hier beschriebenen Protokolle beschreiben die Auswertung der Zielbindung und CDC-Induktion durch Rituximab in Daudi-Zellen. Diese beiden Funktionen erfordern unterschiedliche Strukturregionen des Antikörpers und sind für den durch Rituximab induzierten klinischen Effekt relevant. Die Protokolle erlauben den Seiten-zu-Seite-Vergleich eines Referenz-Rituximab und ein vermarktetes Rituximab-Biosimilar. Die ausgewerteten Produkte zeigten Unterschiede sowohl bei der Zielbindung als auch bei der CDC-Induktion, was darauf hindeutet, dass es physikalisch-chemische Unterschiede gibt und die Notwendigkeit, die Auswirkungen dieser Unterschiede in der klinischen Einstellung zu analysieren, hervorheben. Die hier berichteten Methoden sind in vitro einfach und kostengünstig/ Em> Modelle für die Bewertung der Aktivität von Rituximab Biosimilars. So können sie bei der Biosimilar-Entwicklung sowie bei der Qualitätskontrolle bei der Biosimilar-Produktion nützlich sein. Weiterhin können die vorgestellten Methoden auf andere therapeutische mAbs extrapoliert werden.

Einleitung

Therapeutische Antikörper sind rekombinante monoklonale Antikörper (mAbs) für die Behandlung von verschiedenen Krankheiten entwickelt, einschließlich Krebs, Autoimmun- und chronischen Krankheiten, neurologische Störungen und andere ^1. Derzeit hat die FDA-Zulassung in mehr als 40 therapeutischen mAb gewährt, und mehr wird erwartet, dass der Markt in den kommenden Jahren zu erreichen.

Rituximab ist ein hochaffine chimäre monoklonale IgG1 - Antikörper für die Behandlung von CD20 ⁺ B-Zell - Non-Hodgkin-Lymphom zugelassen (NHL), CD20 ⁺ follikulärem NHL, chronischer lymphatischer Leukämie und Gelenk....

Protokoll

1. Bewertung der Zielbindung durch Durchflusszytometrie

1. Herstellung von biologischen Materialien und Reagenzien
   1. Stellen 500 ml RPMI-Kulturmedium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum (H-IFBS) ergänzt.
   2. Kultur Daudi Burkitt-Lymphom (Daudi) Zellen und Daudi GFP ⁺ Zellen unter Verwendung von RPMI und 75-cm ² Kulturflaschen. Pflegen die Kulturen bei 37 ° C in einer 5% CO ₂ befeuchteten Atmosphäre , bis sie ausge 6 - 9 x 10 ⁵ Zellen / ml.
   3. Make 50 ml Färbepuffer durch Verdünnung 1/100 H-IFBS in PBS; Dieser Puffer wird bei 2 stabil - 8 ° C für mindestens einen Monat.....

Ergebnisse

Unter Verwendung der oben beschriebenen Protokolle, und die Zielbindungs ​​CDC Induktion von Referenz Rituximab wurden parallel mit denen einem biosimilar Rituximab hergestellt und im Handel erhältlich in Asien verglichen.

In Daudi - Zellen, CD20 in einer konzentrationsabhängigen Weise (Figur 1D) gebunden beide mAbs. Nicht-lineare Regressionen von Bindungsdaten zeigten ein R ² von 0,978 und 0,848 fü.......

Diskussion

Der Patentablauf eines therapeutischen mAb fördert die Entwicklung von Biosimilars. So besteht ein Bedarf an einfachen Methoden, die Unterschiede in den klinisch relevanten Aktivitäten dieser Produkte identifizieren können. CD20 ⁺ kultivierte Zellen wurden für die Bewertung von zwei wichtigsten funktionellen Eigenschaften von Rituximab: Zielbindung und CDC-Induktion eingesetzt. Die frühere Aktivität erfordert die Erkennung von CD20 durch die Fab-Region des mAb, während letztere hauptsächlich von der Wechselwi.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modifizieren Sie die Kultur je nach Zelllinie
Trypanblau-Lösung	Sigma	T8154	0,4%, flüssig, sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur
Daudi Burkitt's Lymphomzellen	ATCC	CCL-213	Sie können die Zelllinie je nach Antikörper von Interesse modifizieren
Fötales Rinderserum (FBS)	GIBCO	16000-044	Sie können die Serumquelle je nach den Anforderungen der Zelllinie ändern
Normales menschliches Serumkomplement	Quidel	A113	Es eignet sich daher für den Einsatz in Biokompatibilitätsexperimenten, einschließlich Arzneimittelentwicklung, Biomaterialtests und anderen Anwendungen
7AA-D	BDPharmigen	559925	Sie können eine breite Palette von Farboptionen verwenden, die mit den meisten Gerätekonfigurationen kompatibel sind, um die Lebensfähigkeit zu analysieren.
PECy5 Maus Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Fluorochrom je nach Filter und Laser Ihres Durchflusszytometers wechseln
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change abhängig von mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Durchflusszytometrie Fixierungspuffer (1 - 4% Formaldehyd oder Paraformaldehyd )
PBS pH 7,4 10x (Phosphatpuffer	GIBCO	70011-044	Phosphatpuffer ohne Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] und endotoxinfrei.
Zellkulturplatten 96 Well, V-Boden	Corning	29442-068	12 x 75 mm Reagenzgläser mit rundem Boden oder 96 Wells Mikrotiterplatten mit V- oder U-Boden
MabThera (Rituximab)	Roche	–	Referenzprodukt
Rituximab	Indisch	–	Biosimilar-Produkt
Konische Zentrifugenröhrchen mit 15 oder 50 mL	Corning	430290 oder 430052
Pipettenspitzen	Eppendorf	–	Mehrere Volume-Konfigurationen sind erforderlich
Pipetten	Eppendorf	–	Pipetten mit einstellbarem Volumen sind erforderlich
Zentrifuge 5430/ 5430R Modell	Eppendorf	—	Gekühlte Zentrifuge mit variabler Drehzahl (4 bis 25 &Grad; C) mit Geschwindigkeiten von 10 bis 30.130 & mal; g
Durchflusszytometer	BD Dickinson	–	BD FACSAria III oder anderes Durchflusszytometer
Optisches und Lichtmikroskop von Olympus	Olympus	–	Zur Quantifizierung und Bewertung des Zellwachstums
Inkubator	SANYO	–	Inkubator für Temperatur- und CO2 zur Kultivierung von Zellen
Biologische Sicherheitswerkbank	CHC BIOLUS	–	Biologische Sicherheitswerkbank, die zum Schutz von Forscher, Produkt und Umwelt eingesetzt wird.