Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Summary

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Abstract

Monolayer - Zellkultur - Modell nicht ausreichend das in vivo Verhalten von Geweben, die Wechselwirkungen komplexen Zell-Zell- und Zell-Matrix beinhaltet. Dreidimensionale (3D) Zellkulturtechniken sind eine neue Innovation entwickelt, um die Mängel der adhärenten Zellkultur zu adressieren. Während verschiedene Techniken zur Gewebe Analoga in vitro Erzeugung entwickelt wurden , sind diese Verfahren häufig komplex, teuer herzustellen, erfordern spezielle Ausrüstung und durch Kompatibilität mit nur bestimmte Zelltypen beschränkt. Hier beschreiben wir eine schnelle und flexible Protokoll für Zellen in vielzelligen 3D Sphäroide konsistenter Größe aggregieren, die mit Wachstum einer Vielfalt von Tumor- und normalen Zelllinien kompatibel ist. Wir verwenden verschiedene Konzentrationen von Serum und Methylcellulose (MC) verankerungsunabhängigen Sphäroid Erzeugung und verhindern die Bildung von Zell-Monoschichten in einer hoch reproduzierbaren Weise zu fördern. Optimale Bedingungen für indivIdual Zelllinien kann durch Einstellen MC oder Serumkonzentrationen in der Sphäroidbildung Medium erreicht werden. Die 3D-Sphäroiden erzeugt wird, kann für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gesammelt werden, einschließlich Zellsignalisierung oder Genexpressionsstudien, Kandidat Wirkstoff-Screening oder bei der Untersuchung von zellulären Prozessen wie Tumorzellinvasion und Migration. Das Protokoll wird auch klonale Sphäroide aus einzelnen Zellen zu erzeugen, ohne weiteres angepasst und angepasst werden kann, verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit zu bewerten. Insgesamt bietet unser Protokoll eine leicht modifizierbare Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von 3D - Zell Sphäroide, um die 3D - Mikroumgebung von Geweben und modellieren das in vivo Wachstum von normalen und Tumorzellen zu rekapitulieren.

Introduction

Biologisch relevante Beurteilung der Tumorzellverhalten ist eine Herausforderung mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkulturmethoden, zum Teil , weil diese nicht in angemessener Weise die Zelle Mikroumgebung in vivo gefunden reflektieren. Alternative Ansätze enthält extrazellulären Matrixkomponenten in die Kultur (zB Boyden - Kammer - Assays) sind physiologisch repräsentativ für die in vivo Gewebeumgebung. Jedoch können sie für die Beurteilung der einzelnen Zellverhaltens begrenzt, und nicht den Komplex in vivo Kombinationen von Zell-Matrix- und Zell-Zell - Wechselwirkungen rekapitulieren, die Gewebe- oder Tumorwachstum ^{1, 2, 3} tragen.

Die Verwendung von mehrzelligen Sphäroiden ist ein neuer Ansatz, der genauer die kompakte Architektur von in vivo Zellwachstum ¹ wiedergibt ^,4. Sphäroide können verwendet werden , Zell-Matrix - Wechselwirkungen von normalen Zellen zu untersuchen, sondern kann auch als Tumor - Analoga wirken Charakteristika der Tumorprogression, wie metastatische Wachstum oder drug resistance ⁴ zu modellieren.

Sphäroide können in einer Matrix ⁵ oder schneller eingebettet durch Vermehrung von Einzelzellen gebildet werden, durch die Aggregation von mehreren Zellen fördern ⁷ eine Einzelzellcluster (zB hängenden Tropfen, Zentrifugationsverfahren) ^6, zu bilden. Bestehende Zellaggregation Techniken können teure Materialien oder spezielle Ausrüstung erfordern. Darüber hinaus haben diese Sphäroide eine Vielzahl von Größen und Morphologien und schwierig sein kann, in großen Mengen, so dass Vergleiche zwischen den Wachstumsbedingungen oder Behandlungen schwer herzustellen. Schließlich wird durch diese Verfahren erzeugten Sphäroide kann schwierig sein, von dem proteinischen extracel zu isolierenin anderen Anwendungen zellulären Matrix, in der sie für den Einsatz eingebettet.

Hier beschreiben wir eine robuste und einfach modifizierbar Zellaggregation Methode für die schnelle Bildung von einheitlich bemessen Zelle Sphäroide mit handelsüblichen U-bottom zellabweisenden Platten und ein inertes haftungsvermittelnden Matrix, Methylcellulose. Einmal gebildet, werden diese mehrzellige Sphäroide für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen gut isoliert. Das Protokoll ist auch leicht zu erzeugen Sphäroide durch Zellproliferation geeignet, die verwendet werden können, andere Zellprozesse zu beurteilen. Hier zeigen wir Zellinvasionsassays, durch Immunfluoreszenzfärbung quantifiziert, und ein anoikis Assay, wie beispielsweise Anwendungen dieser zwei unterschiedlichen Sphäroidbildung Protokolle.

Protocol

HINWEIS: Alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sind in der Materialliste aufgeführt.

1. Sphäroid-Produktion von Zellaggregation

1. Methylcellulose - Lösung: Herstellung von 100 ml einer 100 mg / ml Methylcellulose.
   1. Wärme 50 ml ultrareines H ₂ O bis 80 ° C. In 10 g Methylcellulosepulver und rühren, bis alle Partikel gleichmäßig verteilt sind.
   2. Bringen Sie auf das Endvolumen mit kaltem Reinst - H ₂ O und rühren bei 4 ° C , bis die Lösung klar wird, strohfarben, und enthält keine sichtbaren Feststoffe.
   3. Fahren Sie durch einen 0,45 um Filter, um ungelöste Feststoffe zu entfernen. Hergestellte Lösung kann für bis zu 12 Monate bei 4 ° C aliquotiert und gelagert werden.
      HINWEIS: Methylcellulose dient als nicht-zytotoxisch, inert, Suspendiermittel Zell-Zell-Adhäsion zu verbessern und die Bildung einer anhaftenden Zellschicht verhindern. Methylcellulose ist wasserlöslich und kann entfernt spher folgende gewaschen werdenoid Generation.
2. Sphäroidformation Medium
   HINWEIS: Bereiten Sphäroidbildung Medium unmittelbar vor der Verwendung. Nicht lagern.
   1. Verdünnte Methylcellulose-Lösung auf 1-5 mg / mL in dem geeigneten Kulturmedium.
   2. Fahren Sie durch einen 0,22 um Filter zu sterilisieren und nicht gelöste Feststoffe zu entfernen.
3. Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)
   1. Verdünnt und durch ein 0,45-um-Filter vor dem Gebrauch passieren auf 1x. Vorbereitete Lösung kann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.
4. Zell - Sphäroiden Produktion (Abbildung 1)
   HINWEIS: Bereiten Sie alle Reagenzien im Voraus. Es ist wichtig, eine Kontamination der Lösungen durch Staub, Fasern oder andere unlösliche Partikel zu vermeiden. Das Vorhandensein dieser Verunreinigungen werden nachteilig Sphäroidbildung beeinflussen. Kulturmedium und andere Lösungen sollten durch einen 0,45 um Filter geleitet werden, um diese Partikel zu entfernen, wenn poswortlich. Vermeiden Sie die Verwendung von Baumwolle gefilterten Pipetten bei der Übertragung von Lösungen, da diese zusätzlichen Fasern einführen können.
   1. Kulturzellmonolayern auf 70% Konfluenz in dem geeigneten Kulturmedium, das mit 10% Serum ergänzt. Aspirat Kulturmedium und Spülen mit 1x PBS Schmutz zu entfernen. 3 ml Trypsin-EDTA (0,05% Trypsin) Dissoziationspuffer zu einer 10 cm Zellkulturschale und inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5% CO _2.
   2. Untersuchen Zellen unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung Ablösung zu bestätigen. Neutralisieren Dissoziationspuffer mit 7 ml Serum-ergänztem Kulturmedium.
   3. Zentrifuge Zellsuspension bei 500 xg für 10 min sanft Pellet-Zellen.
   4. Überstand entfernen. Resuspendieren Zellpellet in 1 ml Sphäroidformation Medium eine p1000 Pipette mit einer Filterspitze mit.
      HINWEIS: Die Zellsuspension sollte frei von Klumpen sein.
      1. Verreiben Zellpellet, drücken Sie die Pipettenspitze an der Unterseite des Rohres in einem leichten Winkel, währendPipettieren zu scheren Zellpellet. Vermeiden Verreiben mehr als 3 bis 5 mal, da dies die Zellen beschädigen können. Pipette langsam und sie vertreiben nicht gesamten Inhalt der Pipettenspitze Blasen verursachen zu vermeiden.
   5. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und verdünnte Zellsuspension auf 1 x 10 ⁴ Zellen / mL.
      HINWEIS: Die Zellzahl optimiert werden kann Sphäroiden unterschiedlicher Größe zu erzeugen. Trypan-Blau-Färbung von beschädigten Zellen kann verwendet werden, die Lebensfähigkeit von resuspendierten Zellen zu bestätigen.
   6. Transfer Zellsuspension in einen sterilen, staubfreien Mehrkanalpipette Reservoir und verwenden Filterspitzen 100 & mgr; l in jede Vertiefung einer 96-Well-U-Boden zellabweisenden Platte verzichtet werden kann.
      1. Rinse Behälter mit gefiltertem Reinst - H ₂ O Staub und Fasern zu entfernen.
      2. Mischen der Zellsuspension periodisch während Animpfen Zellen zu verhindern, um den Boden des Behälters absetzen. Um zu vermeiden, Blasen erstellen, verwenden Sie eine Reverse Pipettiertechnik beim Mischen und dispensinG.
   7. Übertragungsplatten zu Gewebekultur - Inkubator (37 ° C und 5% CO ₂₎ und untersuchen täglich für Sphäroidbildung. Die Zellen sollten innerhalb von 6 h auf den Boden jeder Vertiefung absetzen und aggregieren im Allgemeinen in ein Sphäroid innerhalb von 24-48 Stunden (Abbildung 2).
   8. Zur Bestätigung der erfolgreichen Sphäroidformation, verwenden Sie eine p10 Spitze und sanft Medium über die Sphäroid pipettieren, während sie unter einem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung beobachtet. Richtig wird gebildet Sphäroiden von der Platte und Rolle lösen, ihre 3D-Struktur zu bestätigen.
      HINWEIS: Methylcellulose und Serumkonzentrationen sollten durch Titration bestimmt werden, für jede Zelllinie pro Vertiefung Bildung eines einzigen Sphäroid zu ergeben. Bedingungen auf diese Weise optimiert für die ausgewählten Zellinien sind in der Tabelle 1, und Beispiele für die Sphäroide in 2B gezeigt gebildet. Sphäroiden kann länger gehalten werden als angegeben, aber wie sie größer werden, wachsen sie immer schwierigerohne Fragmentierung zu behandeln. Wenn Zellen eine Monoschicht bilden, Satelliten - Sphäroiden oder nicht an den Boden des Bohrlochs zu regeln, muss die Konzentration von Methylcellulose und Serum kann weiter für eine optimale Sphäroidbildung (3B) angepasst werden. Verwenden keine Sphäroide Verunreinigungen wie Fasern oder Staub (3A) enthält. Vorgeformte Sphäroiden können mit Verbindungen von Interesse, wie Wachstumsfaktoren, lebenden Zellen Flecken oder Inhibitoren für die Analyse behandelt werden.

2. Spheroid Invasion Assay (Figur 4)

1. neutralisiert Kollagen
   1. Cool Alle Flüssigkeiten bis 4 ° C und halten Sie auf dem Eis, wenn sie mit Kollagen arbeiten unerwünschte Polymerisation zu verhindern.
   2. Bereiten Sie frisch 0,1 M und 0,01 M Lösungen von NaOH und frisch 0,1 M HCl in Reinst - H ₂ O - Pass alle Lösungen durch 0,22 & mgr; m - Filter.
   3. Mischen Sie Rinder-Typ-1-Kollagen (3,1 mg / ml Stamm), 0,01 M NaOH und 10x PBS (8: 1: 1-Verhältnis von Volumen) und auf pH 7,4 mit kaltem 0,1 M NaOH und HCl einzustellen. Die Endkonzentration an Kollagen beträgt 2,5 mg / mL.
   4. Bereiten genug neutralisiert Kollagen des Abbildungsgefäß bis zu einer Tiefe von 2-3 mm zu füllen. Ein Minimum von 100 & mgr; l wird für jede Vertiefung der 8-Well-Gewebekulturkammer Schieber in der Materialliste aufgeführt erforderlich.
2. Einbetten von Sphäroiden in Kollagen (Figur 4)
   1. Mantel der Boden jedes Wells eines 8-Well-Gewebekulturkammerobjektträger mit einem Minimum von 50 & mgr; l neutralisiert Kollagen.
      1. Verwenden Reverse Pipettiertechnik zu vermeiden Blasen im Kollagen zu schaffen. Verwenden Sie die Pipettenspitze das Kollagen gleichmäßig über die Erdoberfläche zu verbreiten.
         HINWEIS: Diese Kollagen-Basisschicht wird Sphäroiden in der Schwebe zu halten und ist in der Regel 1-2 mm dick. Die Basisschicht minimiert die Bildung eines Meniskus auf der oberen Kollagenschicht. Wenn die Basisschicht zu dünn ist, Sphäroiden Kontakt mit dem Boden der Kammer Rutsche machen kann undbilden eine Zellmonoschicht.
   2. Legen Sie die Kammer Rutsche und eine 35 - mm - Gewebekulturschale gefüllt mit Reinstwasser H ₂ O, in einer 10 cm Gewebekulturschale. bei 37 ° C inkubieren, bis das Kollagen polymerisiert wird, in der Regel 1 h. Shop verbleibende Kollagen auf Eis neutralisiert.
      HINWEIS: Das mit Wasser gefüllte 35-mm-Schale wird Feuchtigkeit liefern und Austrocknen zu verhindern. Die Kammer Schieber sollte während des Tests in dieser Feuchtigkeitskammer bleiben. Die Kollagenbasisschicht kann über Nacht zu polymerisieren gelassen werden. Längere Inkubationen führen typischerweise zu einem steiferen Gel.
   3. Mit Hilfe eines p1,000 Filterspitze, sammeln vorgeformten Sphäroiden (Schritt 1.4.7) aus der 96-Well-U-Boden zellabweisenden Platte in 1,5 ml Röhrchen mit Snap. Pipette langsam und vermeiden Sie wiederholt oder heftiges Pipettieren Fluid-Scherung von Sphäroiden zu minimieren. Mehrere Sphäroide können in einem einzigen Rohr für die Übertragung auf eine Vertiefung des 8-Well-Gewebekulturkammer slide gepoolt werden.
   4. Zentrifugieren Sie die gesammelten Sphäroiden in einer tabletop Mikro bei 2.000 × g für 2-5 s und entfernen Überstand eine p200 Pipette. Vermeiden Zentrifugation länger als erforderlich, da dies die Sphäroide verursachen auseinander oder zusammenklumpen zu brechen.
      HINWEIS: Nach den meisten der Überstand Abpipettieren kann das Rohr vorsichtig über einem sauberen Papiertuch invertiert werden, um überschüssige Flüssigkeit abzusaugen. Nicht in Sphäroiden zu trocknen.
   5. Mit einer breiten Bohrung p200 Spitze, sanft resuspendieren Sphäroiden in 50 & mgr; l neutralisiert Kollagen. Tun Sie dies für jedes Röhrchen der gesammelten Sphäroiden, bevor Sphäroiden in die Kammer Träger übertragen werden. Halten Sie Sphäroiden, die für die Übertragung an die Kammer gleitet in neutralisierten Kollagen auf Eis, bis sie bereit suspendiert wurden.
   6. Entfernen Kammer Folie aus Inkubator und Pipette vorsichtig die Sphäroid-Kollagen-Mischung auf der Kollagen-Basisschicht. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ bis zum Kollagen polymerisiert wird.
      1. Sie verzichten nicht gesamte Inhalt der Pipette zu schaffen Blasen zu vermeiden. Dropwise Pipettieren reduziert die Chancen, die Kollagen-Basisschicht zu stören.
   7. Langsam ein Minimum von 100 & mgr; l Kulturmedium erwärmt gewünschte chemische Lockstoffe, Inhibitoren enthalten, oder andere Behandlungen zu jeder Vertiefung der Kammer Rutsche. Die Kollagenschicht, die Sphäroiden reißen kann, wenn Flüssigkeit zu stark auf sie pipettieren. Kulturmedium langsam auf die Seite eines gut verzichtet gelegt werden kann Störung des Kollagens zu vermeiden.
   8. Inkubieren Kammerobjektträger bei 37 ° C und 5% CO ₂ Zellinvasion zu ermöglichen. Zellinvasion in die umgebende Kollagen kann durch Hellfeld- oder Fluoreszenzbildgebung und quantifiziert durch eine Vielzahl von Verfahren unter Verwendung von Epifluoreszenz, konfokaler oder Lichtbogen-Mikroskopie beobachtet werden.

3. Quantifizierung der Invasion: Hellfeldmikroskopie

1. Zu bestimmten Zeitintervallen Bild Kollagen eingebetteten Sphäroiden mit 10facher Vergrößerung ein Hellfeldmikroskop mit (Schritt 2.2.8).
   HINWEIS:längerfristige Lebendzellexperimenten, ein beheizbarer Mikroskoptisch und CO ₂ reguliert Kammer kann verwendet werden , Sphäroide zu halten , bei 37 ° C und 5% CO ₂ während Bildgebung.
2. Quantifizierung der Invasivität mit Software wie ImageJ die Anzahl der Zellen zu messen eindringenden in das umgebende Kollagen und den durchschnittlichen Abstand zu jedem Zeitpunkt eindrangen.

4. Quantifizierung der Invasion: Fluoreszenzmikroskopie mit Live Cell Stain

1. Nach dem Schritt 2.2.8 ergänzen das Medium in der Kammer gleitet mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie DAPI, Calcein AM, oder anderen zell Tracking Verbindung entsprechend der Zelllinie gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Für die Quantifizierung der Invasivität, homogene Färbung im gesamten Sphäroid nicht wesentlich ist. Für Anwendungen, die ein tieferes Eindringen von Flecken, längere Inkubationszeiten (> 3 h) erforderlich sein.
2. Entfernen Sie den Fleck und ersetzen mit 500 & mgr; l warmem 1x PBS. Imcubate bei 37 ° C für 10 min überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Wiederholen mindestens zweimal.
3. Mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops, erwerben optische Schnitte durch die eindringenden Sphäroiden.
   HINWEIS: Bei längerer Exposition gegenüber Laserlicht sollte während wiederholter Bildgebung minimiert werden Phototoxizität und Photobleaching zu begrenzen.
4. Verwenden Software wie ImageJ eine Z-Projektion zu erzeugen, die verwendet werden können, die Gesamtfläche des Sphäroids, der Anzahl der eindringenden Zellen zu quantifizieren, und Entfernungen in die Kollagenmatrix eingedrungen.
5. Als Beispiel Invasion zu quantifizieren, stellen Sie die Bild Schwelle Hintergrund auszuschließen, Hervorhebung nur die Sphäroid und eindringenden Zellen und ihre Umgebung zu messen. Die Fläche des ursprünglichen Sphäroid kann von dieser Summe abgezogen werden Invasions zu quantifizieren.

5. Quantifizierung der Invasion: Immunofluoreszenz

HINWEIS: Alle Lösungen und Puffer sollten durch einen 0,45 um Filter geleitet werden vor der Verwendung zu Remove Trümmer, die sich negativ auf Färbung beeinflussen können.

1. Bereiten PBS ⁺ Waschpuffer. Bereiten 1x PBS und fügen CaCl ₂ und MgCl ₂ zu einer Endkonzentration von 0,1 mM. Autoklaven nicht Puffer nach CaCl ₂ und MgCl ₂ zugesetzt werden. Lösung kann bei Raumtemperatur sterilfiltriert und gespeichert werden.
2. Bereiten Sie neutral gepuffertem Formalin (NBF) Fixierungspuffer. 5 Tropfen 1 M NaOH auf 0,6 g Paraformaldehyd. Bringen Sie zu 20 ml mit PBS ⁺ und Inkubation bei 60 ° C bis Paraformaldehyd gelöst ist (ca. 1 h). Abkühlen auf Raumtemperatur und pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl.
   HINWEIS: NBF Fixierung Puffer unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden sollen.
3. Bereiten Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungspuffer. Auflösen BSA in PBS ⁺ 3% w / v. Lösungsfilter kann für mehrere Tage bei 4 ° C sterilisiert und gelagert, sondern wird am besten frisch zubereitet. Nicht erhitzen.
4. Bereiten Sie Permeabilisierungs Puffer. Verdünnte Triton X-100bis 0,2% v / v in PBS ^+.
   HINWEIS: Die Permeabilisierung Puffer unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden sollen.
5. MOWIOL Eindeckmediums Optional vorzubereiten. Kombinieren 2,4 g MOWIOL, 6 g Glycerol und 6 ml ultrareines H ₂ O - Mischung für 3 h in einem Rotator bei Raumtemperatur. Hinzufügen 12 ml 0,2 M Tris-Cl (pH 8,5). Inkubieren mit 10 min bei 50 ° C gemischt wird .
   1. Zentrifuge bei 5.000 xg für 15 min unlösliche Material zu pelletieren. Hinzufügen Antibleichmittel, wie beispielsweise 2,5% DABCO. Store in 500 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C.
6. Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden (Figur 5)
   HINWEIS: eine Pipette können Sie langsam Flüssigkeiten aus der Kammer Folie hinzuzufügen oder zu entfernen. Vermeiden die Verwendung einer Saugvorrichtung, wie dies die Kollagenschicht unterbrechen können.
   1. Bereiten Sie Sphäroiden und einbetten in Kollagen gefüllte Kammer gleitet, wie in den Abschnitten 1 bis 2 beschrieben.
      HINWEIS: Collagen Autofluoreszenz kann durch die Verwendung dünner Schichten oder kleine Mengen von c minimiert werdenollagen.
   2. Entfernen Sie so viel Kulturmedium wie möglich von jeder Kammer Rutsche.
   3. Spülen Sie kurz Kollagenschicht mit 500 & mgr; l PBS ⁺ Waschpuffer Restmedium zu entfernen.
   4. In 500 ul frischem PBS ⁺ Waschpuffer in jede Vertiefung und Inkubation bei 37 ° C für 5 min Sphäroiden zu waschen. Zweimal wiederholen.
   5. Ersetzen PBS ⁺ Waschpuffer mit 500 & mgr; l NBF Fixierung Puffer. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 bis 25 min.
   6. Entfernen Sie NBF Fixierung Puffer und spülen mit 500 & mgr; l PBS ⁺ Waschpuffer. Waschen Sie für 5 min mit frischer PBS ⁺ Wasch mindestens 3 mal puffern.
      HINWEIS: Fest Sphäroiden kann bei 4 ° C in frischem PBS ⁺ Waschpuffer für mehrere Tage aufbewahrt werden. 0,01% Natriumazid zu dem Waschpuffer zugesetzt werden, um mikrobielles Wachstum während der Lagerung zu hemmen.
   7. Ersetzen PBS ⁺ Puffer mit 500 & mgr; l Permeabilisierung Puffer waschen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 10-15 min.
   8. Ersetzen Permeabilisierung Puffer mit 500 & mgr; l BSA-Puffer blockiert und bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.
      1. BSA Blockierungspuffer Optional entfernen. Verwendung Skalpell oder eine Schere, den Verbrauch Sphäroide und den umgebenden 3 mm x 3 mm Bereichs aus der Kollagenschicht. Unter Verwendung eine große Bohrung p1000 Spitze abzulösen den ausgeschnittenen Block von Kollagen durch vorsichtig mit frischem BSA Blockierungspuffer gespült. Übertragen Kollagen Block zu 1,5 ml-Röhrchen.
      2. Zentrifuge bei 2000 × g für 2 min und Überstand entfernen. Das Rohr kann vorsichtig über sauberes Papiertuch umgedreht werden, um überschüssige Flüssigkeit nach außen ab.
   9. In primären Antikörper zu Sphäroiden und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Gebe ausreichend Volumen des primären Antikörpers, so dass die gesamte Kollagenschicht gleichmäßig eingetaucht ist. Die optionalen obigen Schritte (5.6.8.1-5.6.8.2) ermöglichen typischerweise die Verwendung von kleineren Mengen des Antikörpers.
   10. Unterzutauchen Kammerobjektträger in einem Behälter mit mindestens 10 ml PBS ⁺ wash buffer für 10 min zu waschen. Wiederholen mindestens zweimal.
       1. Optional, wenn Sphäroiden aus Kollagenschicht herausgeschnitten wurden vorher (Schritt 5.6.8.1), ein Minimum von 1 ml PBS hinzufügen ⁺ waschen , um die 1,5 - ml - Röhrchen Puffer und vorsichtig geschwenkt. Lassen Sie für mindestens 10 Minuten einweichen.
       2. Zu entfernen , so viel PBS ⁺ Waschpuffer wie möglich und wiederholen Waschen mit PBS ⁺ wash mindestens zweimal puffern. Zentrifuge bei 2000 × g für mehrere min Kollagen Block zu pelletieren.
          HINWEIS: Reinigen Sie Außenflächen der Kammer Rutsche durch mit 70% Ethanol abgewischt vor Waschpuffer eingetaucht in.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 5.6.9-5.6.10 geeigneten sekundären Antikörper verwendet wird.
       HINWEIS: Wenn Sphäroiden wurden direkt im Abbildungsgefäß gefärbt, gehen 5.6.13 zu treten.
   12. Optional, wenn Sphäroiden wurden aus Kollagenschicht ausgeschnitten zuvor (Schritt 5.6.8.1), saubere Glasobjektträger und der konfokalen Mikroskopie-kompatible Deck mit 70% Ethanol.
       1. Entfernen Sie so viel Waschpuffer wie möglich aus dem Kollagenblock und resuspendieren in ultrareinem H ₂ O Führen Sie diesen Schritt unmittelbar vor der Montage. Lassen Sie keine gefärbten Blöcke in Wasser einweichen.
       2. Mit feinen Spitze einer Pinzette greifen Rand von Kollagen Block und Transfer zum Glasträger.
       3. mit der Pinzette das Kollagen an Ort und Stelle mit einem sauberen Wattestäbchen zu halten, überschüssige Flüssigkeit aus dem Kollagen Block Docht, um sicherzustellen, nicht das Kollagen direkt zu berühren.
          HINWEIS: Wenn Kollagen Wattestäbchen stecken wird, kann es leicht entweder mit einer Pinzette entfernt werden, oder durch Untertauchen im Wasser.
   13. Mit Reverse Pipettiertechnik werden 100 & mgr; l MOWIOL Montagemedium auf die Kollagenblock und Eindecken über die Probe.
       1. Verwenden Sie ein Wattestäbchen oder Papiertuch unter dem Deck Überschuss MOWIOL Eindeckmediums und Wasser aus Docht.
       2. Lassen Sie MOWIOL Eindeckmediums über Nacht bei 4 ° zu härtenC. Siegel Kanten von Deck mit Nagellack.
   14. Bild gefärbten Sphäroide konfokalen oder Fluoreszenzmikroskopie Lokalisierung von Proteinen von Interesse zu beobachten, die Bildung von invasive Strukturen usw. (Figuren 5B, 5C).
       HINWEIS: Befleckt Sphäroiden sollte vor Licht geschützt werden Photobleichens zu verhindern.

6. Anoikis Assay

HINWEIS: Die Sphäroidbildung Protokoll ist einfach angepasst verankerungsunabhängiges Wachstum und anoikis Beständigkeit in einer Vielzahl von Zelltypen zu quantifizieren.

1. Aussäen Zellen für anoikis Assay (Figur 6)
   1. Folgen Sie den Anweisungen für die Sphäroid-Produktion in Abschnitt 1.4, aber ein Minimum von 30 mg / ml Methylcellulose verwenden, um Sphäroidformation Medium herzustellen.
      HINWEIS: Wenn erwärmt, 30 mg / ml Methylcellulose ein dickes Gel erzeugen sollte, die Zellen in Suspension hält.
   2. Inkubiere Zellen für mehrere Tage bis Wochen und inspect regelmäßig bei 10-facher Vergrößerung mit einem Mikroskop. Zellen, die anoikis widerstehen sollten Kolonien vermehren und bilden.
   3. Quantifizierung anoikis durch Messen der Anzahl und Grße der Kolonien in jeder gebildet gut.
      HINWEIS: Sobald Kolonien gebildet sind, werden sie gewaschen werden, um die Methylcellulose und für Sphäroid basierenden Assays zu entfernen, wie beschrieben.

Results

Wir beschreiben eine flexible und effiziente Methode diskreten Sphäroiden zu erzeugen, unter Verwendung von zellabstoßenden Platten und Sphäroidbildung Medien mit MC ergänzt. Unter den geeigneten Bedingungen von MC und Serum, siedeln einzelnen Zellen und halten uns zusammen in der Mitte des Brunnens Sphäroiden zu bilden, mit minimaler Einhaltung des Näpfchenboden. Unter Verwendung dieses Protokolls, Sphäroide wurden aus einer Vielzahl von Zelllinien (2B) erzeugt wird . T...

Discussion

Wir präsentieren Ihnen eine schnelle und flexible Methode zur 3D - Zell Sphäroiden Herstellung der Architektur von in - vivo - Gewebe unter Verwendung von kostengünstigen und weithin verfügbare Reagenzien zu modellieren. Unser Protokoll nutzt die nicht-zytotoxischen und haftungsverbessernde Eigenschaften von MC ^{8, 9} Zellaggregation zu vermitteln und Zellschicht Bildung zu minimieren. Anders als Proteinbasis Matrices aus tierischen Quellen isoli...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffers
10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calciumchlorid-Lösung	Sigma-Aldrich	21114	zur Verwendung von PBS+ Waschpuffer; PBS+ Waschpuffer nach Zugabe von Calciumchlorid nicht autoklavieren
Magnesiumchlorid-Lösung	Sigma-Aldrich	M1028	Wird für PBS+ Waschpuffer verwendet; PBS+ Waschpuffer nach Zugabe von Magnesiumchlorid nicht autoklavieren
Name<	>Company	Katalognummer	Kommentare
Für die Sphäroidbildung
96-Well-U-Boden-Zellabweisungsplatte	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Für die Kultivierung von SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 Zelllinien
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	Für die Kultivierung von TT-Zelllinien
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter vor der Verwendung zur Entfernung von partikulären Verunreinigungen
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Aufbereitung in Wasser bis 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	Für die Kultivierung von HCT-116, BxPC-3 Zelllinien
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissoziationspuffer
Name	<>Company	Katalognummer	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated 354231		Stock 3,1 mg/ml; Bei Gebrauch auf Eis halten
DMEM Phenolrot frei mit niedrigem Glukosespiegel	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Weniger Hintergrundfluoreszenz im Vergleich zu Phenolrot supplementiertem Medium
Neurotropher Faktor aus der Gliazelllinie	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	<>Katalognummer><	strongKommentare
Für die Immunfluoreszenzmikroskopie
#1.5 Deckglas	Elektronenmikroskopie Sciences	72225-01	Zum Einbetten von exzidierten Sphäroiden
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Wird verwendet, um Aktin im Verhältnis 1:200 zu färben
Rinderserumalbumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Wird in BSA-Blockierungspuffer verwendet
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerin	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Wird in MOWIOL-Eindeckmedium
verwendet ImageJ Software	Freeware, NIH-Wird		für die Bildanalyse verwendet
Objektträger	VWR International	48312-024	Zum Einbetten von exzidierten Sphäroiden
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Verwendet im MOWIOL-Einbettmedium
Paraformaldehyd	EMD-Millipore	PX0055-3	Wird in Fixierungspuffer
verwendet Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Wird in Permeabilisierungspuffer verwendet