Die Elektroporation der nächsten Generation ist eine effiziente Methode zur Transfektion menschlicher Th17-Zellen mit kleinen RNAs, um die Genexpression und das Zellverhalten zu verändern.
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Methodenartikel
Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
CD4+ T-Zellen können sich in Abhängigkeit vom umgebenden Zytokinmilieu in mehrere Untergruppen von Effektor-T-Helferzellen differenzieren. Th17-Zellen können aus naiven CD4+ T-Zellen in vitro erzeugt werden, indem sie in Gegenwart der polarisierenden Zytokine IL-1β, IL-6, IL-23 und TGFβ aktiviert werden. Th17-Zellen orchestrieren die Immunität gegen extrazelluläre Bakterien und Pilze, aber ihre abweichende Aktivität wurde auch mit mehreren Autoimmun- und Entzündungskrankheiten in Verbindung gebracht. Th17-Zellen werden durch den Chemokinrezeptor CCR6 identifiziert und durch ihren Master-Transkriptionsfaktor RORγt und ihr charakteristisches Effektorzytokin IL-17A definiert. Optimierte Kulturbedingungen für die Differenzierung von Th17-Zellen erleichtern mechanistische Untersuchungen der Biologie humaner T-Zellen in einer kontrollierten Umgebung. Sie bieten auch einen Rahmen für die Untersuchung der Bedeutung spezifischer Gene und Genexpressionsprogramme durch RNA-Interferenz oder die Einführung von microRNA (miRNA)-Nachahmungen oder -Inhibitoren. Dieses Protokoll bietet eine einfach zu bedienende, reproduzierbare und hocheffiziente Methode für die transiente Transfektion von differenzierenden primären humanen Th17-Zellen mit kleinen RNAs unter Verwendung eines Elektroporationsgeräts der nächsten Generation.
Einleitung
CD4 + T - Zellen sind von entscheidender Bedeutung orchestrators der adaptiven Immunantwort. Naive CD4 + T - Zellen sind in der Lage in mehr verschiedenen Effektor - T - Zellen entwickeln (zB Th1, Th2, Th17, etc.), das jeweils mit ihrem eigenen Satz von charakteristischen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren, abhängig von der lokalen Mikroumgebung 1. Die Linie Entscheidungen, die T-Zellen machen sind entscheidend für sowohl eine schützende Immunität und Toleranz gegenüber sich selbst. Th17 - Zellen sind eine Untergruppe von T - Zellen bekannt extrazellulären Bakterien und Pilze zu bekämpfen, aber ihre fa....
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Protokoll
Dieses Protokoll hält sich an UCSF-Richtlinien für die Forschung mit menschlichen Ethik.
1. Herstellung von T - Zell - Kultur, Isolierung von CD4 + T - Zellen, und Th17 Polarization
- Am Tag 0 Mantel 6-Well - Gewebekulturplatten mit 1,5 ml pro Vertiefung Anti-Human - CD3 (2 ug / ml) und Anti-Human - CD28 (4 ug / ml) in PBS mit Calcium und Magnesium für mindestens 2 h bei 37 ° C.
- Alternativ Beschichtung der Platten über Nacht bei 4 ° C. Wickeln Sie Platten in Parafilm.
- Bereiten Sie die Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CB....
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Ergebnisse
Der erste Schritt , ein zuverlässiges System erfolgreich Elektroporation Th17 menschliche Zellen zu entwickeln , war in vitro differenzierte humane Zellkulturen Th17 robust zu erzeugen. T - Zellen, die unter Th17 polarisierenden Bedingungen exprimiert den Chemokinrezeptor CCR6 und den Transkriptionsfaktor RORγt (1A, links). Dieser Marker wurde nicht exprimiert wird, wenn T - Zellen unter nicht-polarisierenden (ThN) Bedingungen (1A, rechts) kulti.......
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Diskussion
Dieses Protokoll stellt ein verbessertes Verfahren für die Lieferung von kleinen RNAs in humanen Zellen Th17. Obwohl menschliche Zellen Th17 hier verwendet wurden, diese Methode der Elektroporation mit kleinen RNAs mit anderen primären humanen T-Helfer-Untergruppen, wie zum Beispiel Th1, Th2 und Tregs verwendet werden. Es ist nicht gut für naive CD4 + T - Zellen gearbeitet , so müssen die Zellen vor der Transfektion in Kultur aktiviert werden. Für dieses Protokoll optimierten wir zunächst das in -
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die US National Institutes of Health Stipendien (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), einen Stipendiatenpreis der Leukemia & Lymphoma Society (K.M.A.) und das Medical Scientist Training Program des National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (Grant #T32GM007618) (M.M.).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anti-Human-IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Klon: eBio64DEC17 |
| Anti-Human-IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Klon: 4S. B3 |
| Anti-Human-CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Klon: SK3-Maus |
| Anti-Human-CD196 (CCR6) BV421 | BD Biowissenschaften | 562515 | Klon: 11A9 |
| Anti-Human-RORgt AF647 | BD Biowissenschaften | 563620 | Klon: Q21-559 |
| Anti-Human-CD45 eFluor450 ebioscience | 48-9459-42 | Klon: 2D1 | |
| Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbung Puffersatz | ebioscience | 00-5523-00 | Für die intrazelluläre Transkriptionsfaktor-Durchflusszytometrie-Färbung |
| Hu FcR Binding Inhibitor Aufgereinigt | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T-Zell-Expansionsmedium | Stammzelltechnologien | 10981 | "serumfreie Basismedien" |
| MACS CD28 reine funktionelle Qualität, human | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Klon: 15E8 |
| anti-humaner CD3-gereinigter | monoklonaler UCSF-Antikörperkern | N/A | Klon: OKT-3 |
| LEAF gereinigter anti-humaner IL-4 | Biolegend | 500815 | Klon: MP4-25D2 |
| anti-humanes IFNg, gereinigte | Ebioscience | 16-7318-85 | Klon: NIB42 |
| Rekombinantes humanes IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Rekombinantes humanes IL-1β | Peprotech | 200-01B | |
| Rekombinantes humanes TGF-β 1 | Peprotech | 100-21C | |
| Rekombinantes humanes IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, Non-Targeting #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Unberührte humane CD4-T-Zellen Kit | ThermoFisher Scientific | 11346D | Humane CD4+ T-Zellen Isolationskit |
| Neon-Transfektionssystem | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Elektroporationsinstrument der nächsten Generation |
| Neon-Transfektionssystem 10 μ L Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Resuspensionspuffer T | ThermoFisher Scientific | Bereitgestellt im Kit (MPK1096) | "Transfection Resuspension Buffer" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Density Gradient Medium |
| Costar 6-Well-Gewebekultur-behandelte Platten | Corning | 3516 | Platten |
| mit flachem Bodencostar 48-Well-Platten mit Gewebekulturen Corning | 3548 | Platten mit flachem Boden | |
| BD Pharm Lyse Lysing Puffer, 10x | BD biosciences | 555899 | Vor der Verwendung muss 1x Lösung mit destilliertem Wasser hergestellt |
Referenzen
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
