Kleine RNA Transfektion in primären humanen Th17-Zellen durch Next Generation Elektroporation

Zusammenfassung

Die Elektroporation der nächsten Generation ist eine effiziente Methode zur Transfektion menschlicher Th17-Zellen mit kleinen RNAs, um die Genexpression und das Zellverhalten zu verändern.

Zusammenfassung

CD4⁺ T-Zellen können sich in Abhängigkeit vom umgebenden Zytokinmilieu in mehrere Untergruppen von Effektor-T-Helferzellen differenzieren. Th17-Zellen können aus naiven CD4⁺ T-Zellen in vitro erzeugt werden, indem sie in Gegenwart der polarisierenden Zytokine IL-1β, IL-6, IL-23 und TGFβ aktiviert werden. Th17-Zellen orchestrieren die Immunität gegen extrazelluläre Bakterien und Pilze, aber ihre abweichende Aktivität wurde auch mit mehreren Autoimmun- und Entzündungskrankheiten in Verbindung gebracht. Th17-Zellen werden durch den Chemokinrezeptor CCR6 identifiziert und durch ihren Master-Transkriptionsfaktor RORγt und ihr charakteristisches Effektorzytokin IL-17A definiert. Optimierte Kulturbedingungen für die Differenzierung von Th17-Zellen erleichtern mechanistische Untersuchungen der Biologie humaner T-Zellen in einer kontrollierten Umgebung. Sie bieten auch einen Rahmen für die Untersuchung der Bedeutung spezifischer Gene und Genexpressionsprogramme durch RNA-Interferenz oder die Einführung von microRNA (miRNA)-Nachahmungen oder -Inhibitoren. Dieses Protokoll bietet eine einfach zu bedienende, reproduzierbare und hocheffiziente Methode für die transiente Transfektion von differenzierenden primären humanen Th17-Zellen mit kleinen RNAs unter Verwendung eines Elektroporationsgeräts der nächsten Generation.

Einleitung

CD4 ⁺ T - Zellen sind von entscheidender Bedeutung orchestrators der adaptiven Immunantwort. Naive CD4 ⁺ T - Zellen sind in der Lage in mehr verschiedenen Effektor - T - Zellen entwickeln (zB Th1, Th2, Th17, etc.), das jeweils mit ihrem eigenen Satz von charakteristischen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren, abhängig von der lokalen Mikroumgebung ^1. Die Linie Entscheidungen, die T-Zellen machen sind entscheidend für sowohl eine schützende Immunität und Toleranz gegenüber sich selbst. Th17 - Zellen sind eine Untergruppe von T - Zellen bekannt extrazellulären Bakterien und Pilze zu bekämpfen, aber ihre falschen Antworten werden ebenfalls in der Pathogenese von mehreren Autoimmun- und Entzündungserkrankungen, wie Multiple Sklerose und Psoriasis , ^{2, 3} gebracht. Menschliche Zellen können Th17 ⁴ , indem sie mit einer geeigneten Polarisations Umgebung von naiven CD4 ⁺ T - Zellen in vitro erzeugt werden. Vario wir Kombinationen der Zytokine IL-1β, IL-23, TGF-ß und IL-6 wurden für die Entwicklung der menschlichen Th17-Zellen verwendet. Th17 menschliche Zellen exprimieren CCR6, einen Chemokin - Rezeptor, der üblicherweise verwendet wird , diese Zellpopulation zu identifizieren und werden durch die Expression ihres Haupttranskriptionsfaktor, RORγt (kodiert durch RORC) ^{5, 6} definiert. Th17 Zellen haben die Fähigkeit, mehrere Cytokine zu exprimieren, aber IL-17A ist die Linie definierte Effektor Cytokin von diesen Zellen produziert. Wir untersuchten die Expression aller drei Th17-assoziierter Marker (CCR6, RORγt, IL-17A) , um die Robustheit des menschlichen Th17 in vitro Differenzierungsassay zu bewerten. Zusätzlich kultivierten wir humane CD4 ⁺ T - Zellen unter nicht-polarisierenden Bedingungen, in denen keine Zytokine oder blockierende Antikörper zu dem Kulturmedium hinzugefügt wurden als Negativkontrolle zu verwenden , da die Expression dieses Th17 Marker sollte sehr niedrig sein oder fehlen.

ve_content "> Eine Möglichkeit, normale menschliche T-Zell-Entwicklung und Biologie zu studieren ist die Genexpression während ihrer Entwicklung zu manipulieren. Short-interfering RNA (siRNA) synthetische kleine RNA-Moleküle sind, die Protein-kodierenden mRNAs Ziel und verwendet werden kann, spezifische Genexpression zu reduzieren MicroRNAs. (miRNAs) sind endogene nicht-kodierenden kleine RNAs bekannt Genexpression post-transkriptionell zu modulieren. miRNAs gezeigt wurde , sowohl in der murinen und humanen T - Zell - Biologie, einschließlich in Th17 Zellen ^{7, 8, 9} eine wichtige Rolle spielen. Es Hier ist entscheidend, zuverlässige Methoden der Manipulation von kleinen RNA-Aktivität in menschlichen T-Zellen zu haben, um ihre Auswirkungen auf die Genexpression und letztlich auf die menschliche T-Zell-Biologie zu studieren., beschreiben wir eine einfach zu bedienende, konsistente und zuverlässige Protokoll, das wir entwickelt für die Einführung kleine synthetische RNAs und locked nucleic acids (LNA, chemisch Nukleinsäuren mit erhöhter Stabilität modifiziert)Immunzellen in und speziell in der menschliche Th17-Zellen.

Es gibt mehrere alternative Methoden der kleinen RNAs in Säugerzellen einzuführen, die in der Regel fallen chemische, biologische oder physikalische Kategorien ^10. Üblicherweise verwendete chemische Verfahren, einschließlich lipidbasierten Transfektionen und Calciumphosphat-Transfektionen stützen sich chemisch-DNA-Komplexe zu schaffen, das effiziente up von Zellen aufgenommen werden. Im allgemeinen chemischen Methoden sind nicht so effizient für die Transfektion von primären T-Zellen. Die häufigste biologische Methode ist einen viralen Vektor (zB Retrovirus oder Lentivirus), zu verwenden , die direkt an fremde RNA in einen Wirt als Teil ihres natürlichen Replikationszyklus einfügt. Virale Transduktion dauert in der Regel länger, abgeschlossen vor allem, wenn man für die molekulare Klonierung von proviralen Plasmiden in Zeitfaktoren. Darüber hinaus können virale Transduktion Vektoren für die menschlichen Forscher potentiell schädlich sein. Elektroporation ist eine physikalische methode von Membranpermeabilisierung Induzieren von Zellen, um Hochspannungsimpulse zu unterziehen, so dass Nukleinsäuren in die Zelle transient einzutreten, wo sie auf ihrem Ziel wirken können. Traditionelle Elektroporation Instrumente waren nicht wirksam für die Transfektion von primären Lymphozyten. Allerdings wurde optimierte nächste Generation Elektroporation von Transfizieren T-Zellen mit sehr hohen Effizienz fähig erwiesen, vor allem, wenn das Material zu transfizierenden ist kleine RNA. Der Begriff der nächsten Generation ist lose die beiden neueren Plattformen (zB Neon, Amaxa) von den traditionellen Elektroporation Maschinen zu unterscheiden verwendet. Darüber hinaus ist dieses Verfahren leicht skalierbar für moderates Throughput-Screens mit bis zu etwa 120 kleinem RNAs in einem einzigen Experiment, oft validierten synthetische Reagenzien verwenden. Wichtig ist, dass erfolgreiche Transfektionen nach dem T-Zell-Aktivierung in weniger als 16 Stunden erreicht werden. Der Nachteil dieser Methode ist jedoch, dass es nicht in stabiler genomischen diedrei führtauf und ist daher vorübergehend. Daher lohnt es sich, den zusätzlichen Aufwand ein stabiles Expressionskonstrukt zu schaffen, die in einen viralen Vektor verpackt werden können und erfolgreich in T-Zellen in den Fällen zum Ausdruck, wo langfristige Expression eines kleinen RNA erforderlich ist.

Wir haben eine neue Generation Transfektion (zB Neon) verwendet , um diverse synthetische einzelsträngige oder doppelsträngige RNA oder LNA - Oligonukleotid für verschiedene Zwecke ¹¹ Werkzeuge zu ^{liefern, 12, 13.} Effiziente RNA-Interferenz kann in primären murinen und humanen T-Zellen unter Verwendung von doppelsträngigen kurze interferierende RNA (siRNA) induziert werden. Dieses Protokoll beschreibt optimierte Bedingungen für die Verwendung dieser Technik in der menschlichen Th17-Zellen. Zusätzlich zu siRNAs, im Handel erhältliche synthetische miRNA-Mimetika und Inhibitoren können verwendet werden, miRNA Verstärkung und Verlust der Funktion zu untersuchen. miRNA imitiert sind doppelsträngige RNA-Moleküle sehr ähnlich siRNAs, aber designed mit der Sequenz des reifen endogenen miRNAs. miRNA-Inhibitoren sind, chemisch modifizierten RNA und / oder LNA basierten einzelsträngigen Oligonucleotiden, die zu nativem miRNAs binden und ihre Funktion antagonisieren. Wir haben festgestellt, dass alle diese Tools effektiv in kultivierten primären T-Lymphozyten verwendet werden können, einschließlich, aber nicht für die menschliche Th17 Zellen beschränkt.

Protokoll

Dieses Protokoll hält sich an UCSF-Richtlinien für die Forschung mit menschlichen Ethik.

1. Herstellung von T - Zell - Kultur, Isolierung von CD4 ⁺ T - Zellen, und Th17 Polarization

1. Am Tag 0 Mantel 6-Well - Gewebekulturplatten mit 1,5 ml pro Vertiefung Anti-Human - CD3 (2 ug / ml) und Anti-Human - CD28 (4 ug / ml) in PBS mit Calcium und Magnesium für mindestens 2 h bei 37 ° C.
   1. Alternativ Beschichtung der Platten über Nacht bei 4 ° C. Wickeln Sie Platten in Parafilm.
2. Bereiten Sie die Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMCs) durch Dichtegradientenzentrifugation den Anweisungen des Herstellers.
   ACHTUNG: Arbeiten Sie vorsichtig und sorgen Persönliche Schutzausrüstung (PSA) getragen wird, wenn menschliches Blut Handhabung das Risiko einer Exposition gegenüber Blut übertragbaren Krankheitserregern zu vermeiden.
3. Sobald die einkernigen Zellen isoliert und gewaschen worden ist , führt die menschliche CD4 ⁺ T - Zell - Isolierung durch negative selection unter Verwendung eines kommerziellen menschlichen CD4 ⁺ T - Zell - Kit.
   HINWEIS: Wenn es rot Kontamination nach einkernigen Zellisolierung Blutkörperchen ist, eine optionale Lyse der roten Blutkörperchen an die CD4 ⁺ T - Zellen - Isolationsschritte vor durchgeführt werden kann. Resuspendieren der mononukleären Zellen in 1 ml Isolationspuffer (2% FBS in PBS). In 5 ml 1x Lyselösung. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur. Anschließend werden 5 ml Isolationspuffer und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min bei 4 ° C, um die Zellen zu pelletieren.
   1. Resuspendieren der mononukleären Zellen in einer Dichte von 50 x 10 ⁶ pro 500 & mgr; L in dem Isolationspuffer in einem neuen Rohr 5 mL.
   2. Füge 100 & mgr; l FBS und 100 & mgr; l des Antikörper-Mixes pro Röhrchen anschließend jedes Röhrchen für 20 Minuten auf einem Rundschüttler bei 4 ° C inkubieren, um gut zu mischen.
   3. Nach der Inkubation wurden 3-4 ml Isolationspuffer hinzufügen, um die Zellen zu waschen. Zentrifugieren der Zellen bei 300 · g für 8 min bei 4 ° C, um die Zellen zu pelletieren. aspirieren vorsichtig die supernatant.
   4. Während dieser Spin, vorwaschen die magnetischen Kügelchen. Übertragen, um die gewünschte Menge an magnetischen Kügelchen in ein neues Röhrchen (verwendet in einer 1: 1 mit den Zellen) und füge ein gleiches Volumen Isolationspuffer an die Kügelchen zu waschen. Gut mischen eine 1 ml-Mikropipette verwenden und dann das Rohr in den Magneten für mindestens 1 min. aspirieren vorsichtig den Überstand. Resuspendieren der magnetischen Kügelchen in dem gleichen Volumen anfänglich vor der Wäsche transferiert.
   5. Resuspendieren der Zellen in jedem Röhrchen mit 500 & mgr; L des Isolationspuffer und füge 500 ul vorgewaschene magnetischen Kügelchen.
   6. Inkubieren der Zellen mit den magnetischen Kügelchen für 15 min auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur (18 ° C bis 25 ° C) gut zu mischen.
   7. Nach der Inkubation Pipettieren gründlich die Zellen einer 1 ml-Mikropipette mindestens 10-mal verwenden. Dann fügen Sie 3-4 ml Isolationspuffer und stellen jedes Rohr in dem Magneten für 2 min.
   8. Sorgfältig übertragen die negativ selektierten CD4 ⁺ T - Zellen , die in sindder Überstand in ein neues Röhrchen.
4. Sobald CD4 ⁺ T - Zellisolierung abgeschlossen ist, die Zellen mit einem Hämozytometer zählen und die Zellen auf Eis halten.
5. Waschen der Antikörper-beschichteten Platten zweimal mit PBS. Dann fügen Sie 1,5 ml 2x Mischung aus Th17 polarisierenden Medien in jeder Vertiefung: anti-human IFN- & ggr; (20 ug / ml), Anti-Human-IL-4 (20 & mgr; g / ml), human TGF- & bgr; (10 ng / ml), menschliche IL-1β (40 ng / ml), humane IL-23 (40 ng / ml), humanes IL-6 (50 ng / ml), die alle in einem serumfreien Basismedium verdünnt (ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat und 100 & mgr; M 2-Mercaptoethanol).
   HINWEIS: Die Transfektion und RNA-Interferenz funktioniert in serumhaltigen Medien. Der Zweck des Serum-freie Medien mit diesem Protokoll ist besser IL-17A Produktion zu erreichen.
6. Zentrifuge die humanen CD4 ⁺ T - Zellen bei 500 · g für 5 min bei 4 ° C - Zellen zu pelletieren. Aspirieren vorsichtig die SupernatAmeise. Die Zellen in einer Dichte von 3 × 10 ⁶ in 1,5 ml pro Vertiefung , so dass das Endvolumen beträgt 3 ml pro Vertiefung und Polarisieren Cytokine sind nun bei einer 1x Endkonzentration resuspendieren dann die Zellen in serumfreien Medien Base und Platte.
   1. Legen Sie die Platten in 5% CO _2, 37 ° C Inkubator für zwei Tage.

2. Elektroporation von In - vitro - polarisierten Menschen Th17 Zellen

1. Am Tag 2 Mantel 48-Well - Gewebekulturplatten mit 250 & mgr; l pro Vertiefung Anti-Human - CD3 (2 ug / ml) und Anti-Human - CD28 (4 ug / ml) in PBS mit Calcium und Magnesium für mindestens 2 h bei 37 ° C.
   1. Alternativ Beschichtung der Platten über Nacht bei 4 ° C. Wickeln Sie Platten in Parafilm.
2. Bereiten Sie kleine RNAs für die Transfektion. Für jede Transfektion Aliquot 1 & mgr; l einer 5 & mgr; M Stammlösung von siRNA in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie die entsprechenden Chemie abgestimmten kleinen RNA-control. Halten Sie alle Röhrchen auf Eis.
3. Waschen der Antikörper-beschichteten Platten zweimal mit PBS. Dann fügen 500 ul 1X Th17 polarisierenden Medien in jede Vertiefung: anti-human IFN- & ggr; (10 ug / ml), Anti-Human-IL-4 (10 & mgr; g / ml), humanes TGF- & bgr; (5 ng / ml), menschliches IL- 1β (20 ng / ml), alle humanen IL-23 (20 ng / ml), humanes IL-6 (25 ng / ml) in einem serumfreien Basismedium verdünnt (ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat und 100 & mgr; M 2-Mercaptoethanol).
4. Nachdem die Kulturplatten und Transfektionsreagenzien hergestellt, Resuspendieren der Zellen mit einer 1 ml-Mikropipette, Pipettieren vorsichtig, aber sichergestellt wird, dass alle Zellen vom Boden der Vertiefungen losgelöst werden. Pool der Zellen in einem konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C.
   HINWEIS: Für Kulturperioden länger als das Vier-Tage-Protokoll hier vorgestellten, sollten die Zellen etwa alle 3 Tage transfiziert werden, das gleiche Protokoll. Schritt 20,4 sollte jedoch geändert werden, da die mit verschiedenen kleinen RNAs behandelten Zellen sollten nicht gepoolt werden. Alle Bedingungen getestet werden müssen separat gesammelt, gezählt und transfiziert werden.
5. aspirieren sorgfältig den Überstand, und dann die Zellen in mindestens 1 ml PBS zu waschen. Zählen Sie die Live - Th17 Zellen (zB mit einem Hämocytometer unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluß Lebensfähigkeit zu bewerten) und überträgt dann die Zellen in ein Reaktionsgefäß.
6. Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur um die Zellen zu pelletieren.
7. Aspirieren sorgfältig den Überstand, und dann die Zellen resuspendieren vorgesehen Resuspensionspuffer vom Transfektionssystem 10 & mgr; l - Kit mit einer Dichte von 2,5-4 x 10 ⁷ Zellen pro ml. Halten Zellen bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Als Richtlinie nur versuchen, so viele Zellen herzustellen, wie innerhalb von 30 Minuten transfiziert werden. Mehrere Chargen können verglichen werden.
8. In 9 ul Zellen zu 1 & mgr; l von kleinen RNA in jeder MicroCentrifuge Röhre. Pipettieren, sobald die Zellen und kleine RNAs für die Transfektion zu mischen lädt dann in die Pipettenelektrodenspitze vorgesehen.
   HINWEIS: In der Regel wird 9,5 ul Zellsuspension hinzu, um sicherzustellen, gibt es genug von der Mischung zu schaffen Blasen in der Pipettenelektrodenspitze vor der Transfektion zu verhindern.
9. Füllen der Küvette bereitgestellt mit 3 ml Raumtemperatur Electrolytic Buffer E. Platz die Küvette in der Pipettenstation und dann die Pipette in die Position innerhalb der Küvette.
10. Unmittelbar jeweils 10 & mgr; l Mischung von Zellen und kleinen RNA elektroporieren die folgenden Parameter: Pulsspannung 1,500-1,550 V, Impulsbreite 10 ms, und 3 Impulse Summe der auf der Transfektionseffizienz Vorrichtung.
11. Nachdem die Elektroporation abgeschlossen ist, direkt das Zellgemisch zu 500 ul 1X Th17 polarisierenden Medien in vorbereiteten Vertiefungen einer Kulturplatte hinzuzufügen. Ort Platte in einem 5% CO _2, 37 ° C Inkubator für weitere zwei Tage.
    HINWEIS: Waschen der Pipettenelektrodenspitze durch Pipettierennach oben und unten in PBS zwischen jedem der Transfektion.

3. Ernten Menschliche Th17 Zellen

1. Resuspendieren der Zellen in Kulturmedien mit einer Mikropipette, vorsichtiges Pipettieren aber sichergestellt wird, dass alle Zellen vom Boden der Vertiefungen abgelöst werden. Bereiten Sie die Zellen für die funktionelle und / oder Gen-Expressionsassays.
   HINWEIS: Routinemßig genug Zellen aus einer einzelnen Vertiefung von transfizierten Zellen ergeben Th17 sind zur durchflusszytometrischen Analyse der Oberflächenmarker und intrazellulären Cytokinen und Transkriptionsfaktor-Färbung oder zur Herstellung von RNA für die Genexpressionsanalyse verwendet werden.

Ergebnisse

Der erste Schritt , ein zuverlässiges System erfolgreich Elektroporation Th17 menschliche Zellen zu entwickeln , war in vitro differenzierte humane Zellkulturen Th17 robust zu erzeugen. T - Zellen, die unter Th17 polarisierenden Bedingungen exprimiert den Chemokinrezeptor CCR6 und den Transkriptionsfaktor RORγt (1A, links). Dieser Marker wurde nicht exprimiert wird, wenn T - Zellen unter nicht-polarisierenden (ThN) Bedingungen (1A, rechts) kulti...

Diskussion

Dieses Protokoll stellt ein verbessertes Verfahren für die Lieferung von kleinen RNAs in humanen Zellen Th17. Obwohl menschliche Zellen Th17 hier verwendet wurden, diese Methode der Elektroporation mit kleinen RNAs mit anderen primären humanen T-Helfer-Untergruppen, wie zum Beispiel Th1, Th2 und Tregs verwendet werden. Es ist nicht gut für naive CD4 ⁺ T - Zellen gearbeitet , so müssen die Zellen vor der Transfektion in Kultur aktiviert werden. Für dieses Protokoll optimierten wir zunächst das in -

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-Human-IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Klon: eBio64DEC17
Anti-Human-IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Klon: 4S. B3
Anti-Human-CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Klon: SK3-Maus
Anti-Human-CD196 (CCR6) BV421	BD Biowissenschaften	562515	Klon: 11A9
Anti-Human-RORgt AF647	BD Biowissenschaften	563620	Klon: Q21-559
Anti-Human-CD45 eFluor450 ebioscience		48-9459-42	Klon: 2D1
Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbung Puffersatz	ebioscience	00-5523-00	Für die intrazelluläre Transkriptionsfaktor-Durchflusszytometrie-Färbung
Hu FcR Binding Inhibitor Aufgereinigt	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T-Zell-Expansionsmedium	Stammzelltechnologien	10981	"serumfreie Basismedien"
MACS CD28 reine funktionelle Qualität, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Klon: 15E8
anti-humaner CD3-gereinigter	monoklonaler UCSF-Antikörperkern	N/A	Klon: OKT-3
LEAF gereinigter anti-humaner IL-4	Biolegend	500815	Klon: MP4-25D2
anti-humanes IFNg, gereinigte	Ebioscience	16-7318-85	Klon: NIB42
Rekombinantes humanes IL-23	Peprotech	200-23
Rekombinantes humanes IL-1β	Peprotech	200-01B
Rekombinantes humanes TGF-β 1	Peprotech	100-21C
Rekombinantes humanes IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-Targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Unberührte humane CD4-T-Zellen Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Humane CD4+ T-Zellen Isolationskit
Neon-Transfektionssystem	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Elektroporationsinstrument der nächsten Generation
Neon-Transfektionssystem 10 μ L Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspensionspuffer T	ThermoFisher Scientific	Bereitgestellt im Kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
Costar 6-Well-Gewebekultur-behandelte Platten	Corning	3516	Platten
mit flachem Bodencostar 48-Well-Platten mit Gewebekulturen Corning		3548	Platten mit flachem Boden
BD Pharm Lyse Lysing Puffer, 10x	BD biosciences	555899	Vor der Verwendung muss 1x Lösung mit destilliertem Wasser hergestellt

werden