Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a Bacillus -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG

Zusammenfassung

Bacillus anthracis ist der obligatorische Erreger der tödlichen Inhalations-Milzbrand, so dass Studien über seine Gene und Proteine ​​streng reguliert sind. Ein alternativer Ansatz ist es, orthologe Gene zu untersuchen. Wir beschreiben biophysikochemische Studien eines B. anthracis ortholog in B. cereus , bc1531, die minimale experimentelle Ausrüstung erfordern und keine ernsthaften Sicherheitsbedenken haben.

Zusammenfassung

Zur Überwindung von Sicherheitsbeschränkungen und -regelungen beim Studium von Genen und Proteinen aus echten Pathogenen können ihre Homologen untersucht werden. Bacillus anthracis ist ein obligativer Erreger, der tödliche inhalative Milzbrand verursacht. Bacillus cereus gilt als ein nützliches Modell für das Studium B. anthracis aufgrund seiner engen evolutionären Beziehung. Der Gencluster ba1554 - ba1558 von B. anthracis ist mit dem bc1531 - bc1535 - Cluster in B. cereus sowie mit dem bt1364 - bt1368 - Cluster in Bacillus thuringiensis hoch konserviert, was die kritische Rolle der assoziierten Gene in der Bacillus - Gattung anzeigt. Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur Herstellung und Charakterisierung eines Proteinprodukts des ersten Gens ( ba1554 ) aus dem Gencluster in B. anthracis unter Verwendung eines rekombinanten Proteins seines Orthologen in B. cereus , bc1531.

Einleitung

Rekombinante Proteinexpression ist weit verbreitet, um Probleme zu lösen, die mit natürlichen Proteinquellen verbunden sind, wie z. B. begrenzte Proteinmengen und schädliche Kontamination. Darüber hinaus kann bei Studien von pathogenen Genen und Proteinen eine alternative Laborstämme, die keine zusätzlichen Sicherheitsvorkehrungen erfordern, genutzt werden. Zum Beispiel ist Bacillus cereus ein nützliches Modell für das Studium der Bacillus anthracis aufgrund ihrer engen evolutionären Beziehung ¹ .

B. anthracis ist ein obligativer Erreger, der bei Menschen und Vieh tödlichen inhalativen Milzbrand verursacht und potentiell als Biowaffen verwendet werden kann ² . So werden Laboruntersuchungen an B. anthracis streng von den US-Zentren für die Krankheitsbekämpfung geregelt, die Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) Praktiken erfordern, die behaupten, dass der Laborbereich mit negativem Raumdruck getrennt wird. Im Gegensatz zu B. anthracis , B. cereus wird als BSL-1-Agent kategorisiert und hat daher minimale Sicherheitsbedenken. B. cereus ist ein opportunistischer Erreger, der bei der Infektion eine Lebensmittelvergiftung verursacht, die ohne medizinische Hilfe behandelt werden kann. Da aber B. cereus viele kritische Gene mit B. anthracis teilt , können die Funktionen von B. anthracis-Proteinen mit den entsprechenden Homologen von B. cereus ¹ untersucht werden.

Der ba1554 - ba1558 - Gencluster von B. anthracis ist mit dem bc1531 - bc1535 - Cluster hoch konserviert Von B. cereus , sowie mit dem bt1364-bt1368- Cluster von Bacillus thuringiensis , in Bezug auf Genorganisation und Sequenz. Weiterhin sind die ersten Gene ( ba1554 , bc1531 und bt1364 ) der jeweiligen Cluster absolut konserviert ( dh 100% Nukleotidsequenzidentität), implyiEine kritische Rolle des Genprodukts in der Bacillus- Spezies. Aufgrund seiner Lage in diesen Genclustern wurde ba1554 als mutmaßlicher Transkriptionsregulator ³ identifiziert. Die Aminosäuresequenzanalyse des ba1554- Produkts zeigt jedoch an, dass es zur MazG-Familie gehört, die eine Nukleotid-Pyrophosphohydrolase-Aktivität aufweist und nicht mit der Transkriptionsfaktor-Aktivität ^{4 , 5} assoziiert ist. Obwohl Proteine, die zur MazG-Familie gehören, in Bezug auf die Gesamtsequenz und -länge verschieden sind, teilen sie eine gemeinsame MazG-Domäne von 100 Resten, die durch ein EXXE _12-28 EXXD-Motiv charakterisiert ist ("X" steht für jeden Aminosäurerest und die Zahl Gibt die Anzahl der X-Reste an).

Die MazG-Domäne berücksichtigt nicht immer eine bestimmte katalytische Aktivität. Ein MazG-Mitglied aus Escherichia coli (EcMazG) besitzt zwei MazG-Domänen, aber aufDie C-terminale MazG-Domäne ist enzymatisch aktiv ⁶ . Darüber hinaus variiert die Substratspezifität von MazG-Enzymen von unspezifischen Nukleosidtriphosphaten (für EcMazG) bis zu spezifischem dCTP / dATP (für Integrin-assoziiertes MazG) und dUTP (für dUTPasen) ^{6 , 7 , 8 , 9} . Daher sind biophysikochemische Analysen des BA1554-Proteins notwendig, um seine NTPase-Aktivität zu bestätigen und seine Substratspezifität zu entschlüsseln.

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Verfügung, dass die meisten Laboratorien ohne BSL-3-Anlage folgen können, um das Proteinprodukt des B. cereus bc1531- Gens zu charakterisieren , das ein Orthologe von B. anthracis ba1554 auf molekularer Ebene ist. Kurz gesagt wurde rekombinantes BC1531 (rBC1531) in E. coli exprimiert und unter Verwendung eines Affinitätsmarkens gereinigt. Für kristallographische Röntgenuntersuchungen wurden die kristallinenZationsbedingungen des rBC1531-Proteins wurden gesiebt und optimiert. Um die enzymatische Aktivität von rBC1531 zu beurteilen, wurde die NTPase-Aktivität kolorimetrisch überwacht, um radioaktiv markierte Nukleotide zu vermeiden, die herkömmlicherweise verwendet wurden. Schließlich ermöglichten die Analysen der erhaltenen biophysikalisch-chemischen Daten, den Oligomerisierungszustand und die katalytischen Parameter von rBC1531 zu bestimmen sowie Röntgenbeugungsdaten aus dem rBC1531-Kristall zu erhalten.

Protokoll

1. Rekombinante Proteinherstellung und -reinigung von rBC1531

1. Herstellung eines rekombinanten BC1531-Proteins (rBC1531) -expressionsplasmids
   1. Genomische DNA von B. cereus ¹⁰ vorbereiten .
   2. Amplifizieren des bc1531- Gens aus einer Matrize von B. cereus genomischen DNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern (siehe Materialliste) zur Bildung von BamHI- und SalI- Restriktionsenzymstellen bzw. ¹⁰ .
   3. Das PCR-Produkt und einen modifizierten pET49b-Vektor (pET49bm) unter Verwendung von BamHI und Sal I, wie beschrieben, verdauen.
   4. Mischen Sie das verdaute PCR-Produkt und den Vektor (3: 1-Verhältnis) aus Schritt 1.1.3 unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in einer 10 & mgr; l-Reaktion, wie beschrieben ¹¹ . Inkubieren bei 18 ° C für 30 min.
   5. 3 μl der Ligationsreaktion in 50 μl Chemica pipettierenLly kompetente E. coli DH5α Zellen in einem Röhrchen. Mischen Sie sanft durch Pipettieren auf und ab und legen Sie auf Eis für 30 min. Hitzeschock für 45 s bei 42 ° C. Füge 1 ml Luria-Bertani (LB) Medium hinzu und wachse die Zellen bei kräftigem Schütteln (250 U / min, 37 ° C, 45 min).
   6. Nehmen Sie 100 μl der transformierten Zellen aus Schritt 1.1.6 und verbreiten Sie sie mit 100 μg / ml Kanamycin (Kan) auf die LB-Agarplatten. Inkubieren für ~ 18 h bei 37 ° C.
   7. Pick-Kolonien unter Verwendung einer sterilen Spitze und wachsen die Zellen in 3 ml LB-Medium mit 100 & mgr; g / ml Kan; Kräftig schütteln (250 U / min, 37 ° C, 18 h).
   8. Vorbereiten von Plasmid-DNA unter Verwendung eines alkalischen SDS-Lyse-Verfahrens, wie beschrieben ¹⁰ .
   9. Bestätigen Sie die Nukleotidsequenz des rBC1531-Expressionskonstrukts unter Verwendung der DNA-Sequenzierung ¹² .
2. Überexpression des rBC1531-Proteins
   1. Re-transformieren Sie den E. coli BL21 (DE3) Stamm mit rBC1531-expWie in den Schritten 1.1.5-1.1.6 beschrieben, für die Überexpression.
   2. Wählen Sie eine Kolonie und wachsen Sie sie in 10 ml LB-Medium mit 50 μg / ml Kan (LB + Kan); Kräftig für 18 h bei 37 ° C schütteln.
   3. Inkulieren Sie 10 ml über Nacht Kultur in 1 l LB + Kan-Medium und wachsen bei 37 ° C, bis die OD ₆₀₀ (optische Dichte bei 600 nm) ~ 0,7 erreicht.
   4. Die Kultur in eiskaltem Wasser für ca. 15 min eintauchen, um die Temperatur auf 18 ° C abkühlen zu lassen und Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) der Kultur bei einer Endkonzentration von 1 mM zur rekombinanten Proteinexpression zuzusetzen. Wachsen die Kultur bei 18 ° C für weitere ~ 16-18 h.
3. Reinigung von rBC1531
   1. Die Zellen durch Zentrifugation (5.000 xg, 4 ° C, 30 min) ernten. Verwerfe den Überstand sorgfältig, um die Zellen nicht zu stören. Die Zellen in 50 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 10 mM Imidazol enthält, erneut suspendieren.
   2. Lyse die Zellen zweimal durch Beschallung auf Eis, um die Überhitzung der Zelllysate zu verhindern (Zeit: 2 min 30 s, Zyklus auf: 5 s, Zyklus aus: 10 s, Amplitude: 38%).
   3. Löschen Sie das Zelllysat durch Zentrifugation (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 min).
   4. Mischen Sie 3 ml Nickelperlen und 60 ml PBS, enthaltend 10 mM Imidazol und den Schwerkraftfluss, den zusätzlichen Puffer, um die äquilibrierten Nickelperlen in einer 2,5 x 10 cm großen Glaschromatographiesäule zu fixieren.
   5. Pipettieren Sie den Überstand von Schritt 1.3.3 auf die Säule mit voräquilibrierten Nickelperlen und inkubieren bei 4 ° C für 2 h auf einem Spinnrad bei niedriger Geschwindigkeit (~ 20 U / min).
   6. Den Überstand durch Schwerkraft abtropfen lassen und die Nickelperlen in der Säule dreimal mit 100 ml PBS, enthaltend 10 mM Imidazol, waschen.
   7. Eluiertes rBC1531-Protein durch Aufbringen von 4 x 5 ml PBS, enthaltend 250 mM Imidazol.
   8. Nehmen Sie 15 μl der Elution aus Schritt 1.3.7 und führen Sie es auf 15% SDS-PAGE. Visualisierung der Proteinbänder aufDas Gel mit Coomassie-Blau-Färbung ¹⁰ .
4. Entfernung der Affinitäts-Tags des rBC1531-Proteins durch Thrombin-Proteolyse
   1. Die Fraktionen in das Dialyse-Röhrchen pipettieren (Molekulargewichts-Cutoff: 3 kDa) und das Röhrchen in ein Becherglas geben, das 4 l Thrombinspalt-kompatiblen Puffer (20 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl und 1,5 mM β-Mercaptoethanol) Bei 4 ° C über Nacht.
   2. Die Fraktionen pipettieren und auf ein konisches Röhrchen übertragen.
   3. Messen Sie die Extinktion bei 280 nm und schätzen Sie die rBC1531-Proteinkonzentration, wie beschrieben ¹³ .
   4. Nehmen Sie 50 μg rBC1531 in ein 0,5 ml-Röhrchen und fügen Sie verschiedene Mengen an Thrombin ( dh 2, 1, 0,6 und 0,3 Einheiten) hinzu. Inkubieren Sie die rBC1531- und Thrombinreaktionen bei 20 ° C für ~ 3 h, um die geringste Menge an Thrombin zu bestimmen, die erforderlich ist, um das N-terminale Affinitäts-Tag zu spalten.
   5. Führen Sie die rBC1531 und Thrombin Reaktionen auf eine 15%SDS-PAGE und bestimmen die niedrigste Menge an Thrombin ( z. B. 0,3 Einheiten Thrombin pro 50 μg rBC1531), die das N-terminale Affinitäts-Tag vollständig verdaut und ein tag-freies rBC1531 erzeugt.
   6. Füge 10 mg rBC1531-Protein und 60 Einheiten Thrombin zu einem 15-ml-Röhrchen hinzu und inkubiere bei 20 ° C für ~ 3 h für die Thrombin-Proteolyse-Reaktion.
   7. Wenden Sie Gel-Filtrationsstandards auf eine Größen-Ausschluss-Chromatographie (SEC) -Spalte an, um eine Standardkurve von Molekulargewichten und Elutionsvolumina herzustellen, wie beschrieben ¹³ .
   8. Das Thrombin-verdaute rBC1531-Protein aus Schritt 1.4.6 in einem Zentrifugal-Filterröhrchen (Molekulargewichts-Cutoff: 3 kDa) platzieren und bei 3.000 g bei 4 ° C zentrifugieren, um auf ein Volumen von weniger als 5 ml zu reduzieren.
   9. Das konzentrierte rBC1531-Protein in die SEC-Säule geben und 60 eluierte Fraktionen in 0,5 ml pro Röhrchen ¹³ sammeln.
   10. Nehmen Sie 15 μl pro Fraktion, führen Sie sie auf einer 15% SDS-PAGE und staiN das Gel unter Verwendung der Coomassie-Färbelösung (0,15% (w / v) Coomassie-Brillantblau, 40% (v / v) Methanol und 10% (v / v) Eisessig) wie beschrieben ¹⁰ .
   11. Pipettieren Sie die Fraktionen, die rBC1531 enthalten und sammeln sie in einem Tube.

2. Kristallisations-Screening und Optimierung von rBC1531

1. Screening-Bedingungen für die rBC1531-Proteinkristallisation
   1. Konzentrieren Sie den rBC1531 von Schritt 1.4.11 bis zu ~ 18.5 mg / ml mit einem Zentrifugalfilterrohr, wie in Schritt 1.4.8 beschrieben.
   2. Füge 50 μl jeder Kristallisations-Screening-Lösung (siehe Abschnitt 2.2) ¹⁴ zu den Vertiefungen von 96-Well-Sitzen-Tropfen-Kristallisationsplatten hinzu. Platzieren Sie 0,5 μl der 18,5 mg / ml rBC1531 Proteinlösung auf einem Sitzbett. Mischen Sie die Proteinlösung mit 0,5 μl der Bohrlochlösung und wiederholen Sie das Verfahren für die gesamte Platte.
   3. Die Platte mit klarem Klebefilm bedecken.Die Platten mit 96 Vertiefungen auf 18 ° C stellen und Dampfdiffusion zulassen.
   4. Scannen Sie die Tropfen bei 20-40facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop, um die Kristallbildung täglich für 2-3 Wochen zu überwachen.
   5. Sammeln Sie Röntgenbeugungsdaten ¹² unter Verwendung der erhaltenen rBC1531-Proteinkristalle.
2. Optimierung der rBC1531-Kristallisationsbedingungen
   1. Bereiten Sie 500 & mgr; l der ausgewählten Anfangskristallisationsbedingungen-Lösung ( z. B. 0,1 M Natriumcacodylat, pH 6,5 und 1,0 M Natriumcitrat) vor und füllen Sie eine 24-Well-Kristallisationsplatte für den Sitztropfen.
   2. Füge 0,5 μl der 18,5 mg / mL rBC1531-Proteinlösung zu einem Sitzbett hinzu, mischen mit 0,5 μl der Vertiefungslösung und decke die Platte sofort mit klarem Klebstofffilm ab. Legen Sie die Platte auf 18 ° C.
   3. Beobachten Sie das Kristallwachstum unter einem Lichtmikroskop für eine Woche.
   4. Optimieren Sie verschiedene Kristallisationsbedingungen durch Variieren des pH-Werts ( dh, PH 5,5-6,8) von 0,1 M Kacodylat und durch Veränderung der Salzkonzentration ( dh 0,9-1,2 M) Natriumcitrat , um Singularkristalle zu erhalten. Überwachen Sie das Kristallwachstum für 1 Woche und sammeln Sie Röntgenbeugungsdaten ¹² .

3. Charakterisierung der Nucleosid Triphosphatase (NTPase) Aktivität von rBC1531

1. Validierung der anorganischen Phosphat-abhängigen kolorimetrischen Studie
   1. Bereiten Sie einen Vorrat an Pyrophosphat (100 mM) vor und verdünnen Sie es auf Endkonzentrationen von 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 und 250 & mgr; M in 200 & mgr; l Reaktionspuffer (20 mM HEPES, pH 7,4; MM NaCl und 2 mM MgCl & sub2 _; ) in doppelten 96-Well-Platten. Benutze die erste Platte als Kontrolle (dies enthält keine Pyrophosphatase). Stellen Sie sicher, dass die zweite Platte Pyrophosphatase als Arbeitsplatte enthält, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben.
   2. Add 0.01 Einheit von Saccharomyces cerevisiae anorganischen pYrophosphatase (1 & mgr; l) zu den Vertiefungen der Arbeitsplatte gegeben und bei 20 ° C für 30-60 min inkubiert.
   3. Vorbereitung der Molybdatsäurelösung durch Mischen von Ammoniummolybdat (0,86% v / v) und Ascorbinsäure (14% v / v) Lösungen im Verhältnis 7: 3. Füge 16 μl Molybddsäurelösung sowohl den Arbeits- als auch den Kontrollvertiefungen zu und warte 15 min.
   4. Lesen Sie die optische Dichte bei 690 nm (OD _690nm ).
2. Farbmetrischer NTPase-Assay
   1. Vorbereiten eines Materials von 100 mM Nukleosidtriphosphat (NTP) -Substrat und Verdünnen auf die gewünschte Konzentration ( z. B. 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 oder 132 & mgr; M) in 180 & mgr; l Assaypuffer (20 mM HEPES, PH 7,4, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl ₂ ).
   2. Fügen Sie 20 μg rBC1531 (1,5 mM) und die NTP-Substrate aus Schritt 3.2.1 bis zu 200 μL pro Reaktion in einer 96-Well-Platte hinzu und pipettieren Sie nach oben und unten, um gut zu mischen. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und legen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator für 30 minUm die Substrathydrolysereaktion durchzuführen.
   3. Übertragen Sie die Platte auf ein 70 ° C Wasserbad und lassen Sie für 15 min stehen, um rBC1531-vermittelte katalytische Reaktionen zu stoppen.
   4. Füge 0,01 Einheiten von S. cerevisiae anorganische Pyrophosphatase (1 μL) zu jeder Vertiefung der Reaktionsplatte (aus Schritt 3.2.3) hinzu und inkubiere bei 20 ° C für 30 min. Füge 16 μl Molybddsäurelösung zur Reaktionsplatte hinzu, um die Farbe zu entwickeln (~ 15 min). Lesen Sie bei OD _690nm .
   5. Analysieren mit der Michaelis-Menten-Gleichung, wie beschrieben ¹² .

Ergebnisse

Die Charakterisierung des Proteins von Interesse in dieser Studie begann mit der Herstellung einer ausreichenden Menge an rekombinantem B. cereus bc1531 (rBC1531) Protein, vorzugsweise mehr als mehrere Milligramm. Das DNA-Fragment, das für das BC1531-Protein kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung der genomischen DNA von B. cereus als Matrize hergestellt, da es orthologe Gene enthält, die mit ba1554 identisch sind . RBC1531 wurde als lösliches Protein in ...

Diskussion

Studien über echte Krankheitserreger sind aufgrund von Sicherheitseinschränkungen und -vorschriften begrenzt. Alternativ können Krankheitserreger mit evolutionär verwandten Nicht-Krankheitserregern oder weniger pathogenen Spezies untersucht werden. Das ba1554-Gen gilt als kritisches Gen in B. anthracis. Glücklicherweise ist ein identisches Gen in nicht-klinischem B. cereus vorhanden. Somit kann das rekombinante BC1531-Protein ohne ernsthafte Sicherheitsbedenken für die biophysikalische und enzy...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bacillus cereus ATCC14579	Koreanische Sammlung für Gewebekultur	3624
Genomic DNA Prep Kit	GeneAll	106-101	Genomic DNA
preparation Forward	primer Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	em>BamHI Stelle ist unterstrichen
Reverse	Primer Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI Stelle ist unterstrichen
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR Polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b Expressionsvektor	Novagen	71463	Der Expressionsvektor wurde modifiziert, um Affinitäts-Tags und BamHI/SalI-Stellen hinzuzufügen10
T4-DNA-Ligase	Enzynomics	M001S
Dialyse-Memebran	Thermofisher	18265017
Trockenblockheizung	JSR	JSBL-02T
LB-Bouillon (Luria-Bertani)	LPS-Lösung	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson and Company
Kanamycin	LPS-Lösung	KAN025
Mini-Prep-Kit	Favorgen	FAPDE300	Plasmid-DNA-Präparation
BL21(DE3) Kompetente Zelle	Novagen	69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
Natriumchlorid	Daejung	7548-4100	PBS-Material
Kaliumchlorid	Daejung	6566-4405	PBS-Material
Kaliumphosphat	Bio Basic Inc	PB0445	PBS-Material
Natriumphosphat	Bio Basic Inc	S0404	PBS-Material
Imidazol	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Nickel bead
Rotator	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE Protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie Färbelösung
Methylalkohol	Samchun Chemikalie	M0585	Coomassie Färbelösung
Essigsäure	Daejung	1002-4105	Coomassie Färbelösung
Dialysemebran	Thermofisher	68035
2-Mercaptoethanol	Sigma-aldrich	M6250
Thrombin	Merckmillipore	605157-1KUCN	Aliquots von 20 & mu; L (1 Einheit pro μ L) und bei 70 Grad lagern; C und Auftauen vor Gebrauch
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Größenausschlusschromatographie
Gelfiltrationsstandard	Bio-rad	151-1901
Zentrifugalfilter	Amicon	UFC800396
Kristallisationsplatten	Hampton research	HR3-083	96-Well-Sitzplatte
Die JCSG-Kernsuite I-IV	Qiagen	130924-130927	Kristallisationsabscheidelösung
Mikroskop	Nikon	SMZ745T
Kristallplatten	Hampton research	HR3-158	24-Well-sitzende Fallplatte
Anorganische Pyrophosphatase	Sigma	10108987001
Ammoniummolybdatlösung	Sigma	13106-76-8
L-Ascorbinsäure	Sigma	50-81-7
NTP-Substrat	Startagene	200415-51
Spektralphotometer	Biotek	SynergyH1	Mikroplatten-Reader
GraphPad Prism 5		GraphPad Prism 5 für Fenster