Die Genotypisierung hier beschriebene Technik, die Paare fluoreszierende Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Gelelektrophorese Kapillare ermöglicht eine Hochdurchsatz-Genotypisierung von Nuklease-vermittelte knockout-Klone. Es umgeht die von anderen Genotypisierung Techniken konfrontiert Einschränkungen und kostengünstiger als Sequenzierungsverfahren ist.
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Methodenartikel
Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Entwicklung von programmierbaren genom Editing-Tool hat die Verwendung von Reverse Genetik erleichtert die Rollen spezifische genomischen Sequenzen spielen in der Funktion von Zellen und ganzen Organismen zu verstehen. Diese Ursache wurde durch die kürzliche Einführung des CRISPR / Cas9 system eines vielseitiges Werkzeug, das Forscher ermöglicht zu manipulieren das Genom und Transkriptom, um unter anderem, knock out, knock down, oder Klopfen in Genen in einem gezielten enorm geholfen Weise. Für die Zwecke der Ausschlagen ein Gens, CRISPR / Cas9 vermittelte Doppelstrangbrüche, die nicht-homologe end-joining DNA-Reparaturwegs rekrutieren, um die Frameshift-verursachende Insertion oder Deletion von Nukleotiden an der Bruchstelle einzuführen. Jedoch kann eine einzelne Führungs RNA unerwünschte Nebeneffekte verursachen, und diese auszuschließen, die Verwendung von mehreren Führungs RNAs notwendig. Diese Vielzahl von Zielen, bedeutet auch, dass ein High-Volume-Screening von Klonen benötigt wird, was wiederum die Verwendung eines ef bittetreichend Hochdurchsatz-Technik, um den Knockout-Klone genotypisieren. Aktuelle Genotypisierung Techniken entweder von inhärenten Einschränkungen leiden oder hohe Kosten entstehen, damit sie nicht geeignet für Hochdurchsatz-Zwecke zu machen. Hier stellen wir detailliert das Protokoll für die Verwendung von Fluoreszenz-PCR, die genomische DNA aus einem rohen Zelllysat als Templat verwendet, und dann die Lösung der PCR-Fragmente über Kapillargelelektrophorese. Diese Technik ist genau genug, um eine Basenpaarunterschied zwischen Fragmenten zu unterscheiden, und somit ist ausreichend, in der Gegenwart oder Abwesenheit einer Rasterverschiebung in der kodierenden Sequenz des Zielgens anzeigt. Diese genaue Kenntnis schließt effektiv die Notwendigkeit für eine bestätigende Sequenzierung Schritt und ermöglicht es Benutzern, Zeit und Kosten in den Prozess zu speichern. Darüber hinaus hat diese Technik in Genotypisierung verschiedene Säugetierzellen verschiedenen Gewebe Ursprünge durch Führungs RNAs gegen zahlreiche Gene gezielt zu vielseitig erwiesen, wie hier und anderswo gezeigt.
Einleitung
Reverse genetische Ansätze erlaubt haben Wissenschaftler die Auswirkungen von spezifischen Veränderungen im Genom auf der Zelle oder ganzen Organismus aufzuklären. Zum Beispiel kann die Expression eines bestimmten Gens durch Knock-Down 1, 2 (teilweise Reduktion) oder Gen - Knockout - 3, 4 (vollständige Ablation), um den Effekt zu bestimmen , abgeschwächt wird , dass diese auf der Funktion der Zelle oder auf der Entwicklung des Organismus.
Gen-Knockout-Versuche haben sich einfacher, da die Einführung von sequenzspezifischen....
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Protokoll
1. Gewinnung CRISPR / Cas9-bezogene Einzelzellklone
- Seed HepG2-Zellen auf einer 6-Well-Platte bei 500.000 Zellen pro Vertiefung in 2 ml antibiotikafreien Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Inkubieren für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Transfizieren von Zellen mit Plasmid-co-exprimierenden Cas9 und spezifische sgRNA gegen das Gen von Interesse ein geeignetes Transfektions-Reagenz nach den Angaben des Herstellers.
HINWEIS: Zum Beispiel kann in den sgRNA pSpCas9 (BB) -2a-GFP - Vektor geklont wird, wie zuvor beschrieben , 4. - Ersetzen des Kulturmediu....
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Ergebnisse
Die fluoreszierende PCR-Kapillargelelektrophorese hier beschriebene Technik wird erwartet, zu jedem Ziel ausrichtbare Region in dem Genom in praktisch jede Zelllinie anwendbar zu sein, der fremden DNA-Lieferung zugänglich ist. Wir haben zuvor gezeigt , durch seine Anwendung 12 drei Gene in einer kolorektalen Krebszelllinie Targeting. Hier zeigen wir seine Wirksamkeit eine hepatozelluläres Karzinom-Zelllinie in Genotypisierung, HEPG2, mit einem CRISPR gezielten / C.......
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Diskussion
Das Ausschlagen eines spezifischen Gens in einem Modell-Zelllinie der Wahl ist zur Routine geworden, die Rolle für die Aufklärung, dass das Gen in diesem bestimmten zellulären Kontext spielt. In der Tat sind einige genomweite Bildschirme zur Zeit zur Verfügung , die die CRISPR / Cas9 System verwenden nahezu alle bekannten menschlichen Genen in das Genom 14 zielen, 15, 16. Mit diesen großflächigen Bildschirmen (oder sogar kleinr.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich Frau Tan Shi Min, Frau Helen Ong, und Dr. Zhao Yi für die Hilfe bei der Kapillar-Elektrophorese-Experimente danken. Diese Arbeit wurde von NMRC / IRG gewährt NMRC / 1314/2011 und MOE ACRF Tier-2-Fonds Zuschuss MOE2011-T2-1-051 unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HEPG2-Zellen | ATCC | HB-8065 | |
| HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | SH30022.01 | |
| HyClone Fötales Rinderserum | Thermo Fisher Scientific | SV30160.03 | |
| pSpCas9(BB)-2A-GFP | Plasmid Addgene | PX458 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trypsin-EDTA (0,25 %), Phenolrot | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Trypsin-EDTA (0,5 %), kein Phenolrot | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 HyClone-Wasser | |
| , Molekularbiologie-Qualität | GE Healthcare | SH30538,02 | |
| CRISPR sgRNA-Insert-Oligonukleotid (Sense) | AITbiotech | None Sequenz | : 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR |
| sgRNA Insert-Oligonukleotid (Anti-Sense) | AITbiotech | None | Sequenz: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3' |
| Unmarkierter PCR-Amplifikations-Forward-Primer | AITbiotech | None | Sequenz: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; Dieser Primer wird auch zur Sequenzierung von PCR-amplifizierten Allelen verwendet |
| 6-FAM-markierter fluoreszierender PCR-Forward-Primer | AITbiotech | None Sequenz | : 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX-markierter |
| fluoreszierender PCR-Forward-Primer | AITbiotech | None | Sequenz: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3' |
| Unmarkierter PCR-Reverse-Primer | AITbiotech | None | Sequenz: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq |
| PCR Core Kit | QIAGEN | 201223 | |
| Hi-Di Formamid | Thermo Fisher Scientific | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ Farbstoffgröße Standard | Thermo Fisher Scientific | 4322682 | |
| MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte | Thermo Fisher Scientific | 4306737 | |
| 3500xL Genetic Analysator | Thermo Fisher Scientific | 4405633 | |
| 3500 Serie 2 Programm | Thermo Fisher Scientific | 4476988 | |
| Gene Mapper 5 Programm | Thermo Fisher Scientific | 4475073 | |
| Gentra Puregene Cell Kit | QIAGEN | 1045696 | |
| Wizard SV Gel und PCR Clean-Up System | Promega | A9282 | |
| NAP1L1 Antikörper ( N-term) | Abgent | AP1920b | |
| Nuclear Matrix Protein p84 Antikörper [5E10] | GeneTex | GTX70220 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Kaninchen | IgG Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | |
| Peroxidase AffiniPure Schafe Anti-Maus IgG | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 |
Referenzen
- Chang, H., et al. CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo. Sci. Rep. 6, 22312(2016).
- O'Connell, M. R., et al. Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 516, 263-266 (2014). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
