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Methodenartikel

Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben

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DOI:

10.3791/55589

⸱

29. Juli 2017

 ,  , 
1Department of Pathology, Leiden University Medical Center, 2Department of Otorhinolaryngology and Head and Neck Surgery, Erasmus University Medical Center, 3Center for Gynecological Oncology Amsterdam, VU Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Multiparameter-Fluoreszenz-Immunhistochemie kann verwendet werden, um die Anzahl, die relative Verteilung und die Lokalisierung von Immunzellpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung zu bestimmen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei oropharyngealen Krebs.

Zusammenfassung

Die vierfarbige Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) -Technik ist eine Methode zur Quantifizierung von Zellpopulationen von Interesse unter Berücksichtigung ihrer relativen Verteilung und ihrer Lokalisierung im Gewebe. Diese Technik wurde intensiv angewendet, um das Immun-Infiltrat in verschiedenen Tumortypen zu untersuchen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an die Tumorstelle angezogen werden. Verschiedene Immunzellenpopulationen wurden gefunden, um unterschiedliche Rollen in der Tumor-Mikroumgebung zu spielen und einen anderen Einfluss auf das Ergebnis der Erkrankung zu haben. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von Multiparameter-Fluoreszenz-IHC auf oropharyngealem Plattenepithelkarzinom (OPSCC) als Beispiel. Diese Technik kann auf andere Gewebeproben und Zelltypen von Interesse erweitert werden. In der vorgestellten Studie analysierten wir das intraepitheliale und stromale Kompartiment einer großen OPSCC-Kohorte (n = 162). Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), immunsuppressive RegulationOry T-Zellen (Tregs, dh FoxP3 + ) und T-Helfer 17 (Th17) -Zellen ( dh IL-17 + CD3 + ) unter Verwendung eines nuklearen Gegenstiftes zur Unterscheidung von Tumorepithel aus Stroma. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Anzahl von T-Zellen mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben bei Patienten mit einer geringen Anzahl von intratumoralen IL-17 + Nicht-T-Zellen korreliert wurde. Dies deutet darauf hin, dass IL-17 + Nicht-T-Zellen mit einer schlechten Immunantwort in OPSCC korreliert werden können, was mit der Korrelation zwischen IL-17 und dem schlechten Überleben bei Krebspatienten übereinstimmt. Derzeit werden neuartige Multiparameter-Fluoreszenz-IHC-Techniken mit bis zu 7 verschiedenen Fluorochromen entwickelt und ermöglichen die präzisere Charakterisierung und Lokalisierung von Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung.

Einleitung

Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome (OPSCCs) sind eine heterogene Gruppe von Plattenepithelkarzinomen, die aus dem Oropharynx stammen. Risikofaktoren für OPSCC umfassen humanes Papillomavirus (HPV) Infektion und Alkohol und Tabakkonsum 1 , 2 . Die Rolle der Immunantwort und wie man sie in einer klinischen Umgebung einsetzt, beginnt erst zu erforschen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an der Krebs-Stelle angezogen werden. Obwohl eine hohe CD8 + zytotoxische T-Zell-Frequenz mit einem verbesserten Überleben bei OPSCC-Patienten 3 korreliert wurde, ist die Rolle anderer T-Zell-Teilmengen, einschließlich Tregs und Th17-Zellen, noch unklar 4 . Während Th1- und Th17-Zellen in der Immunantwort-Targeting-Tumorzellen helfen sollen, sind Tregs für ihre Fähigkeiten bekannt, um die Aktivität anderer T-Zellen zu unterdrücken 5 . Die Anwesenheit von TRegs wurde gefunden, um mit günstigen und ungünstigen Reaktionen in verschiedenen Tumortypen zu korrelieren 6 . Da nicht alle im Blut vorhandenen Immunzellen den Tumor in gleichem Maße infiltrieren, liefert das Studium der lokalen Tumor-Mikroumgebung das zuverlässigste Maß für die gegen das Tumor gerichtete Immunantwort. Das Ziel dieser Studie ist es, die Korrelation zwischen den Zahlen und Arten der Immunzellen und dem klinischen Ergebnis zu bestimmen. Wir verwendeten vierfarbige Fluoreszenz-IHC-Bildgebung, um die Anzahl und Lokalisierung verschiedener T-Zell-Subpopulationen in humanem OPSCC zu analysieren.

Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), Th17-Zellen und immunsuppressive FoxP3 + Tregs, deren Differenzierungsweg eng mit Th17-Zellen verwandt ist. Th17-Zellen zeichnen sich durch die Kombination von CD3 und IL-17 aus. Das Cytokin IL-17 kann auch durch Nicht-T-Zellen 7 hergestellt werden . Wir haben die Verteilung der Intra-Epitierung bestimmtHelialen und stromalen T-Zellen, Tregs, Th17 und IL-17 + Nicht-T-Zellen in einer großen Reihe von OPSCC-Fällen und analysierten die Korrelationen mit dem Überleben des Patienten. Mehrfarbige Fluoreszenz IHC wurde verwendet, um die Expression von CD3, Foxp3 und IL-17 in Kombination mit einem DAPI-Gegenfleck zu identifizieren. Dieser Assay erlaubte die einfache und klare Identifizierung von beiden Tumorzellen (unter Verwendung von DAPI-Kernfärbung) und der infiltrierenden T-Zellpopulationen (unter Verwendung einer Kombination verschiedener Marker). Nach der Probenvorbereitung und der Färbung wurde ein Fluoreszenzmikroskop und eine Imaging-Software verwendet, um die verschiedenen verwendeten Fluoreszenzfarben zu trennen und die Anzahl und den Typ der Zellen zu bestimmen, die sowohl im Tumorepithel als auch im Tumor-assoziierten Stroma vorhanden waren.

Ein alternativer Assay zur Quantifizierung und Phänotypen von Immunzellpopulationen ist die Durchflusszytometrieanalyse oder die Zytometrie nach der Zeit des Fluges (CyTOF) -Analyse von Tumor- oder peripheren Proben ( dh Blut oder Aszites). Mit diesemTechnik, alle Informationen über die Lokalisierung und die relative Verteilung der verschiedenen Zelltypen geht verloren. Die Verwendung und Analyse von peripheren Proben liefert auch keine Information darüber, welche Zellen in der Lage sind, die Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren. Blut- und Ascite-Immunzellenanalysen haben gezeigt, dass sie nicht den Phänotyp und die Häufigkeit der Immunzelleninfiltration des Tumorgewebes 8 , 9 widerspiegeln.

Eine weitere Alternative ist die Verwendung von Hellfeldmikroskopie. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber der Fluoreszenz-Bildgebung ist die Abwesenheit von Gewebe-Autofluoreszenz. Obwohl einige Proben mehr Autofluoreszenz - insbesondere Erythrozyten, aber auch andere Zelltypen enthalten, einschließlich neutrophiler Granulozyten - können diese Bereiche bei der Analyse fast aller Proben leicht entfernt werden. Immunfluoreszenz bietet den Vorteil, mehrere Marker in einer Probe zu analysieren, indem ein Panel mit gezielter Fluoreszenz verwendet wirdNt Wellenlängen. Dies ist derzeit in gleichem Maße für die Hellfeldmikroskopie aufgrund des Fehlens einer ausreichenden Anzahl von Etiketten und handelsüblichen Antikörper-Isotypen für ein bestimmtes Antigen unmöglich.

Die hier beschriebene mehrfarbige Fluoreszenz-IHC-Technik wurde in vielen verschiedenen Krebsarten und Antikörperkombinationen verwendet, um verschiedene Immunzellpopulationen sowie Tumorzell-exprimierte Moleküle wie menschliche Leukozytenantigene (HLA) und PD-L1 10 , 11 , 12 Das Protokoll wurde mit vielen verschiedenen Arten von Proben und Antikörpern etabliert und validiert.

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Protokoll

Patientenproben wurden nach den medizinischen Richtlinien behandelt, die im Verhaltenskodex für die ordnungsgemäße Sekundärnutzung des menschlichen Gewebes des niederländischen Verbandes der biomedizinischen wissenschaftlichen Gesellschaften (www.federa.org) beschrieben sind.

1. Vorlagen vorbereiten

  1. Erhalten Sie reseziertes Gewebematerial (jede Art von Gewebe) aus einer Pathologie-Abteilung, nachdem Sie medizinischen ethischen Ausschuss die Erlaubnis erhalten, reseziertes Material zu verwenden.
    HINWEIS: Für das aktuelle Experiment wurden vor der Behandlung von primären oropharyngealen Tumoren, die in der Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande zwischen 1970 und 2011, ausgewählt wurden, wie zuvor beschrieben (n = 162) 13, diagnostiziert. Die Größe des Gewebes war nur durch die Anforderung für eine ausreichende Menge an Tumorgewebe begrenzt, um zuverlässig 4 mikroskopische Bilder innerhalb des Tumors zu nehmen.
  2. Fix das Gewebe in 4% gepufferten Formalin für mindestens 12 h. Dehydrieren Sie das Gewebe in AgAusgestreckte Reihe von Ethanol. Waschen Sie es in Xylol und legen Sie es in Paraffinwachs mit einem automatisierten Gewebeprozessor ein.
  3. Schneiden Sie 4 μm dicke Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Gewebeschnitten auf Glasrutschen mit einem Mikrotom. Legen Sie den Gewebeblock in den Mikroton-Gewebehalter mit Standardverfahren.
    1. Schneiden Sie Bänder des Gewebes und legen Sie sie auf die Oberfläche eines Wasserbades, das entionisiertes Wasser bei 45 ºC enthält. Verwenden Sie eine Folie, die für die immunhistochemische Färbung geeignet ist, um einen Abschnitt zu fischen, indem Sie die Folie direkt unter den Abschnitt ins Wasser legen. Ziehen Sie den Schieber vorsichtig schräg nach oben, nehmen Sie den Abschnitt aus dem Wasser und kleben ihn auf die Rutsche.
  4. Lassen Sie die Objektträger über Nacht bei 37 ° C trocknen.
  5. Deparaffinieren Sie die FFPE-Folien, indem Sie sie vollständig in frisches 100% Xylol eintauchen, dreimal für jeweils 5 min. Rehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie zweimal in frischem 100% igem Ethanol, 70% Ethanol und 50% Ethanol für jeweils 5 min eintauchen.

2. Antigen Retrieval durchführen

  1. Waschen Sie die Dias in deionisiertem Wasser für 5 min.
  2. Vor dem Erwärmen von Tris-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Puffer (10 mM Tris plus 1 mM EDTA, pH 9,0) auf Siedetemperatur unter Verwendung einer Mikrowelle vorheizen. Führen Sie Antigen-Retrieval durch Tauchen der Folien in den vorgeheizten EDTA-Puffer und halten den Puffer bei dieser Temperatur für 10 min in der Mikrowelle.
    HINWEIS: Jede Mikrowelle mit einer Leistung von 900 W kann verwendet werden.
  3. Lassen Sie die Objektträger 2 Stunden lang im Puffer abkühlen.

3. Flecken Tissue Slides

  1. Die Folien zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für jeweils 5 min waschen.
  2. Zeichnen Sie einen Kreis um das Gewebe mit einem hydrophoben Stift, um zu verhindern, dass die verdünnten Antikörper die Folie verschütten. Mit PBS noch einmal waschen Das ist optional.
  3. Inkubieren des Gewebes mit primären Antikörpern (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 und anti-IL-17 1:50), verdünnt in 1% w / v Rinderserum aLbumin (BSA) in PBS bei Raumtemperatur über Nacht.
    HINWEIS: Das Volumen pro Folie hängt von der Größe des Gewebes ab, aber es ist typischerweise 50 - 150 μl. Ersetzen Sie die primären Antikörper mit Antikörpern der gleichen Isotypklasse mit einer unbekannten Spezifität für die negativen Kontrollrutschen bei der gleichen Verdünnung wie die CD3-, CD8- und FoxP3-Antikörper ( dh Kaninchen-Ig-Isotyp-Kontroll-Antikörper, Maus-IgG1-Isotyp-Kontroll-Antikörper und Ziege IgG-Isotyp-Kontroll-Antikörper).
  4. Waschen Sie die Dias dreimal mit PBS für jeweils 5 min.
  5. Inkubieren Sie das Gewebe mit einer Kombination von fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern, die auf die primären Antikörper-Spezies und / oder Isotypen ( dh 1: 200-Esel-Anti-Ziegen-IgG Alexa 488, Esel-Anti-Kaninchen-IgG A546 und Esel-Anti-Maus A647) 1% BSA in PBS bei Raumtemperatur für 1 h.
    HINWEIS: Das Volumen pro Folie hängt von der Größe des Gewebes ab, beträgt aber typischerweise 50 - 150 μl.
    1. NachHinzufügen des sekundären Antikörpers, halten die Dias so lange wie möglich vor Licht geschützt, indem man sie in einem dunklen Kasten aufbewahrt oder die Schachtel in Aluminiumfolie umwickelt.

4. Aufsatz- und Gegenfärbefolien

  1. Waschen Sie die Dias dreimal in PBS für jeweils 5 min.
  2. Montieren Sie die Objektträger mit einem wässrigen Anti-Fade-Montagemedium mit einem nuklearen Gegenfleck ( zB DAPI). Analysieren Sie die Folien mit einem Fluoreszenzmikroskop so schnell wie möglich (innerhalb von zwei Wochen). Die Dias im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse aufbewahren.

5. Analysieren Sie gefärbte Gewebe-Folien

  1. Erhalten Sie vier Bilder von jeder Folie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20 - 25X Objektiv ausgestattet ist. Nehmen Sie Bilder an zufälligen Orten in der gesamten Tumor-Bereich in der Folie enthalten, um eine repräsentative Fraktion des Tumors zu erfassen.
    HINWEIS: Eine Standardvergrößerung von 250X sollte verwendet werden. Irgendein fluoreszierender oR Laser-Scanning-Mikroskop verwendet werden kann, vorausgesetzt, es hat die Filter und Laser benötigt, um die verwendeten Fluorochrome zu visualisieren.
    1. Zur Visualisierung von Alexa 488 verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 490 und ein Emissionsmaximum von 525; Zur Visualisierung von Alexa 546, verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 556 und ein Emissionsmaximum von 573; Zur Visualisierung von Alexa 647, verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 650 und ein Emissionsmaximum von 665; Und zur Visualisierung von DAPI verwenden Sie ein Erregungsmaximum von 358 und ein Emissionsmaximum von 461.
    2. Speichern Sie die Bilder als Bilddateien (dh, JPEG und TIFF) in der Software dem Benutzer zur Verfügung.
  2. Diskriminieren zwischen Tumorepithel und Tumorstroma Bereichen auf der Grundlage der nuklearen und zellulären Formen der Tumorepithel gegen versromale Zellen nach Rücksprache mit einem Pathologen.
    1. Um die gesamte stromale Oberfläche zu bestimmen, zeichnen Sie eine Linie um alle Bereiche, die von Stromazellen (anstelle von Tumorzellen) und Rekorder besetzt sindD die Oberfläche mit der Bildanalyse-Software des Mikroskopherstellers.
      1. Klicken Sie auf die Registerkarte "Overlay" unter dem Bild. Wähle die "Closed Poly-line" -Form und klicke darauf. Abgrenzung der Grenze zwischen Tumor-Epithel- und Stroma-Feldern durch Anklicken um den Bereich bis zum Erreichen des ersten Punktes wieder; Dies ist eine Maßnahme für diesen Bereich.
        HINWEIS: Sobald die Form geschlossen ist, erscheint neben der Form, die den Oberflächenbereich des ausgewählten Bildes umgibt (A = x μm 2 ), eine Zahl.
    2. Subtrahieren Sie diese Fläche von der Gesamtbildfläche (in den Bildeigenschaften vorgesehen), um die Epithelfläche zu berechnen. Ausschließen von vaskulären, nekrotischen und autofluoreszierenden Bereichen durch Zeichnen einer Linie um sie herum, Aufzeichnen der Größe des vorgesehenen Bereichs und Subtrahieren der von der Epitheloberfläche.
    3. Sichern Sie alle Flächennummern in einer Tabellenkalkulation, um die durchschnittlichen Flächen zu berechnen undZellzahlen pro Folie.
    4. Mit der Bildanalyse-Software bestimmen Sie, ob die Zellen ein-, doppel- oder dreifach positiv sind, indem Sie die Fluoreszenz aller vier Kanäle überprüfen.
      1. Zählen Sie die Einzel-, Doppel- und Dreifach-Positiv-Zellen in jedem Bild mit ImageJ.
        1. Herunterladen ImageJ. Öffnen Sie ein Bild, indem Sie auf "Datei" und "Öffnen" klicken und das zu analysierende Bild auswählen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das "Point Tool" (ein rotes Quadrat in der Mitte von vier Zeilen) und wählen Sie das "Multi-Point Tool". Doppelklicken Sie auf das "Multi-Point Tool" und zählen Sie die Anzahl der verschiedenen Zelltypen im Bild, indem Sie für jeden Zelltyp eine andere Zählernummer auswählen.
          HINWEIS: Zähle alle Zellen jedes einzelnen Zelltyps, wie durch die Anwesenheit von einer, zwei oder allen drei fluoreszierenden Farben identifiziert. DAPI ausschließen, da dieser nukleare Gegenfleck in allen Zellen vorhanden ist und zur Unterscheidung von Tumorzellen aus Immunzellen verwendet wird. Jeder Zellentyp wird gezähltMit einer anderen Zählerzahl. Zählen Sie die Zellzahlen jedes Zelltyps separat in den Tumorepithel- und Stroma-Gebieten, indem Sie jeweils eine andere Zählerzahl wählen. Zählen Sie keine Zellen in Blutgefäßen und weitgehend autofluoreszierenden Bereichen.
        2. Notieren Sie die Anzahl der Zellen, die in jedem Zähler für jedes Bild in einer Tabellenkalkulation analysiert wurden.
        3. Teilen Sie die Gesamtzahl der Zellen für jeden Zelltyp über die Gesamtfläche des Tumorepithels und des Tumorstromas analysiert.

6. Statistische Analyse

ANMERKUNG: Alle statistischen Analysen sollten mit einem Statistiker besprochen werden, um die Qualität der Daten zu gewährleisten. Für allgemeine Statistiken, verwenden Sie alle medizinischen Statistiken Führer 14 .

  1. Testen Sie die Korrelationen zwischen Zellfrequenzen mit einem Spearman-Rangkorrelation rho-Test.
  2. Testen Sie die statistischen Unterschiede in der Anzahl der positiven celZwischen Patientengruppen mit dem Wilcoxon Mann-Whitney-Test.
  3. Testen Sie die Korrelationen zwischen Zellzahlen und krankheitsfreiem Überleben ( dh Zeit von der Diagnose bis zum lokalen oder entfernten Wiederauftreten von Tod oder Krankheit), indem Sie die Patienten in Gruppen auf der Grundlage einer Cut-off-Anzahl von Zellen unter Verwendung der Kaplan-Meier-Kurvenerzeugung und -protokoll teilen Ranganalyse 15
  4. Führen Sie multivariate Analysen mit Cox Proportional Hazard Regression Analyse.

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Ergebnisse

Eine Reihe von FFPE - Proben - Vorbehandlung Tumor aus primären oropharyngealen Tumoren in der Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande zwischen 1970 und 2011 diagnostiziert erhalten, wie zuvor beschrieben ausgewählt wird (n = 162), gefärbt wurde unter Verwendung des Protokolls 13 beschrieben. Ein bis vier zufällige Bilder jeder Folie wurden analysiert ( Abbildung 1 ). Es sind einige autofluoreszierende Zellen angegeben, ...

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Diskussion

Für das beschriebene Protokoll ist eines der kritischsten Schritte, um die korrekte Verdünnung der verwendeten primären Antikörper zu bestimmen. Die Verdünnung der markierten Sekundärantikörper betrug 1: 200, wie vom Hersteller dieser spezifischen Alexa-markierten Antikörper empfohlen. Die Verdünnung der primären Antikörper sollte dann durch eine serielle Verdünnung bestimmt werden, vorzugsweise unter Verwendung von zwei verschiedenen Proben des beabsichtigten Gewebetyps (in diesem Fall OPSCC). Die optimale Arbeitsverdü...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen kommerziellen oder finanziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Simone Punt wurde von der Niederlassung UL2010-4801 von der niederländischen Krebsgesellschaft unterstützt. Wir danken allen Co-Autoren des Originalpapiers, auf denen dieses JoVE-Protokoll basiert: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter und Sjoerd van Der Burg

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Pathos Delta Ultra Rapid Tissue ProcessorMilestone und HistostarAutomatisierter Gewebeprozessor
HistostarThermo ScientificBlockeinbettungsmaschine für Gewebeblöcke
FormaldehydBaker
XylolMerck
EthanolMerck
milliQ WasserElaga Purelab Chorus
Paraffinwachs/ParacleanKlinipath5079A
Mikrotom-GewebehalterLeicaRM225
Flex IHC SeiteDakoGewebe-Objektträger
TrisMerk-Milipore1.083.821.000
EDTABaker1073
PBSBio-RadBUF036A
BSASigmaA9647
Kaninchen Anti-CD3Abcamab828Titrat erforderliche Antikörperverdünnung
Maus IgG1 anti-FoxP3Abcamab20034Titrat erforderlich Antikörperverdünnung
Ziege IgG anti-IL-17R& D SystemsAF-317-NATitrat erforderliche Antikörperverdünnung
Kaninchen Ig-Isotyp-KontrollantikörperAbcamab27472Verwendung in der gleichen Endkonzentration wie der Anti-CD3-Maus-IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper
Abcamab91353Verwendung in der gleichen Endkonzentration wie der Anti-FoxP3-IgG-Isotyp-Kontrollantikörper
ThermoFisher Scientific02-6202in der gleichen Endkonzentration wie Anti-IL-17
Esel Anti-Kaninchen IgG A546ThermoFisher ScientificA10040Verdünnung 1:200 in 1% BSA/PBS
Esel Anti-Maus-A647ThermoFisher ScientificA31571Verdünnung 1:200 in 1% BSA/PBS
Esel Anti-Ziegen-IgG A488ThermoFisher ScientificA11055Verdünnung 1:200 in 1% BSA/PBS
VectaShield mit DAPIVector LaboratoriesH-1200
LSM700 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop Zeiss
LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 ObjektivZeiss420852-9972-720
LSM Zen SoftwareZeissVersion 2009
LSM Image BrowserZeissVersion 4.2.0.121Verfügbar zum Download unter www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.
SPSSIBM Corp.Version 20.0
ImageJVersion 1.50iVerfügbar zum Download unter http://rsb.info.nih.gov/ij.
Verwendung

Referenzen

  1. Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
  2. Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
  3. Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
  4. Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
  5. Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
  6. Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why? Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
  7. Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539(2015).
  8. Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
  9. Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
  10. Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients? Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
  11. van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
  12. Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
  13. Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
  14. Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. Essential Medical Statistics. , 2nd ed, Wiley-Blackwell. (2003).
  15. Kleinbaum, D. G., Klein, M. Survival Analysis: A Self-Learning Text. , 2nd ed, Springer. (2005).
  16. Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
  17. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Formalinfixiertesin Paraffin eingebettetes GewebeMultiparameter Fluoreszenz IHCCD3 positive T LymphozytenFoxP3 positive TregsIL 17 positive Th17 ZellenFluoreszenzmikroskopieBildanalysesoftware
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