Multiparameter-Fluoreszenz-Immunhistochemie kann verwendet werden, um die Anzahl, die relative Verteilung und die Lokalisierung von Immunzellpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung zu bestimmen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei oropharyngealen Krebs.
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Methodenartikel
Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die vierfarbige Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) -Technik ist eine Methode zur Quantifizierung von Zellpopulationen von Interesse unter Berücksichtigung ihrer relativen Verteilung und ihrer Lokalisierung im Gewebe. Diese Technik wurde intensiv angewendet, um das Immun-Infiltrat in verschiedenen Tumortypen zu untersuchen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an die Tumorstelle angezogen werden. Verschiedene Immunzellenpopulationen wurden gefunden, um unterschiedliche Rollen in der Tumor-Mikroumgebung zu spielen und einen anderen Einfluss auf das Ergebnis der Erkrankung zu haben. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von Multiparameter-Fluoreszenz-IHC auf oropharyngealem Plattenepithelkarzinom (OPSCC) als Beispiel. Diese Technik kann auf andere Gewebeproben und Zelltypen von Interesse erweitert werden. In der vorgestellten Studie analysierten wir das intraepitheliale und stromale Kompartiment einer großen OPSCC-Kohorte (n = 162). Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), immunsuppressive RegulationOry T-Zellen (Tregs, dh FoxP3 + ) und T-Helfer 17 (Th17) -Zellen ( dh IL-17 + CD3 + ) unter Verwendung eines nuklearen Gegenstiftes zur Unterscheidung von Tumorepithel aus Stroma. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Anzahl von T-Zellen mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben bei Patienten mit einer geringen Anzahl von intratumoralen IL-17 + Nicht-T-Zellen korreliert wurde. Dies deutet darauf hin, dass IL-17 + Nicht-T-Zellen mit einer schlechten Immunantwort in OPSCC korreliert werden können, was mit der Korrelation zwischen IL-17 und dem schlechten Überleben bei Krebspatienten übereinstimmt. Derzeit werden neuartige Multiparameter-Fluoreszenz-IHC-Techniken mit bis zu 7 verschiedenen Fluorochromen entwickelt und ermöglichen die präzisere Charakterisierung und Lokalisierung von Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung.
Einleitung
Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome (OPSCCs) sind eine heterogene Gruppe von Plattenepithelkarzinomen, die aus dem Oropharynx stammen. Risikofaktoren für OPSCC umfassen humanes Papillomavirus (HPV) Infektion und Alkohol und Tabakkonsum 1 , 2 . Die Rolle der Immunantwort und wie man sie in einer klinischen Umgebung einsetzt, beginnt erst zu erforschen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an der Krebs-Stelle angezogen werden. Obwohl eine hohe CD8 + zytotoxische T-Zell-Frequenz mit einem verbesserten Überleben bei OPSCC-Patienten 3 korreliert wurd....
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Protokoll
Patientenproben wurden nach den medizinischen Richtlinien behandelt, die im Verhaltenskodex für die ordnungsgemäße Sekundärnutzung des menschlichen Gewebes des niederländischen Verbandes der biomedizinischen wissenschaftlichen Gesellschaften (www.federa.org) beschrieben sind.
1. Vorlagen vorbereiten
- Erhalten Sie reseziertes Gewebematerial (jede Art von Gewebe) aus einer Pathologie-Abteilung, nachdem Sie medizinischen ethischen Ausschuss die Erlaubnis erhalten, reseziertes Material zu verwenden.
HINWEIS: Für das aktuelle Experiment wurden vor der Behandlung von primären oropharyngealen Tumoren, die in der Leiden Universit....
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Ergebnisse
Eine Reihe von FFPE - Proben - Vorbehandlung Tumor aus primären oropharyngealen Tumoren in der Leiden University Medical Center, Leiden, Niederlande zwischen 1970 und 2011 diagnostiziert erhalten, wie zuvor beschrieben ausgewählt wird (n = 162), gefärbt wurde unter Verwendung des Protokolls 13 beschrieben. Ein bis vier zufällige Bilder jeder Folie wurden analysiert ( Abbildung 1 ). Es sind einige autofluoreszierende Zellen angegeben, .......
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Diskussion
Für das beschriebene Protokoll ist eines der kritischsten Schritte, um die korrekte Verdünnung der verwendeten primären Antikörper zu bestimmen. Die Verdünnung der markierten Sekundärantikörper betrug 1: 200, wie vom Hersteller dieser spezifischen Alexa-markierten Antikörper empfohlen. Die Verdünnung der primären Antikörper sollte dann durch eine serielle Verdünnung bestimmt werden, vorzugsweise unter Verwendung von zwei verschiedenen Proben des beabsichtigten Gewebetyps (in diesem Fall OPSCC). Die optimale Arbeitsverdü.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keinen kommerziellen oder finanziellen Interessenkonflikt.
Danksagungen
Simone Punt wurde von der Niederlassung UL2010-4801 von der niederländischen Krebsgesellschaft unterstützt. Wir danken allen Co-Autoren des Originalpapiers, auf denen dieses JoVE-Protokoll basiert: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter und Sjoerd van Der Burg
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone und Histostar | Automatisierter Gewebeprozessor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Blockeinbettungsmaschine für Gewebeblöcke | |
| Formaldehyd | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ Wasser | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffinwachs/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Mikrotom-Gewebehalter | Leica | RM225 | |
| Flex IHC Seite | Dako | Gewebe-Objektträger | |
| Tris | Merk-Milipore | 1.083.821.000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Kaninchen Anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrat erforderliche Antikörperverdünnung |
| Maus IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrat erforderlich Antikörperverdünnung |
| Ziege IgG anti-IL-17 | R& D Systems | AF-317-NA | Titrat erforderliche Antikörperverdünnung |
| Kaninchen Ig-Isotyp-Kontrollantikörper | Abcam | ab27472 | Verwendung in der gleichen Endkonzentration wie der Anti-CD3-Maus-IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper |
| Abcam | ab91353 | Verwendung in der gleichen Endkonzentration wie der Anti-FoxP3-IgG-Isotyp-Kontrollantikörper | |
| ThermoFisher Scientific | 02-6202 | in der gleichen Endkonzentration wie Anti-IL-17 | |
| Esel Anti-Kaninchen IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Verdünnung 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Esel Anti-Maus-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Verdünnung 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Esel Anti-Ziegen-IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Verdünnung 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield mit DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 Objektiv | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | Version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | Version 4.2.0.121 | Verfügbar zum Download unter www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | Version 20.0 | |
| ImageJ | Version 1.50i | Verfügbar zum Download unter http://rsb.info.nih.gov/ij. |
Referenzen
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
