Methodenartikel

Ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell mit Zunahme im Effekt-Speicher T-Zellen in Augapfel-Gewebe

DOI:

10.3791/55592

⸱

7. Juni 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Bericht beschreibt eine Methode, um chronisches experimentelles Autoimmun-Trockenauge in Lewis-Ratten durch Immunisierung mit einer Emulsion von Ratten-Tränendrüsenextrakt, Ovalbumin und komplettem Freund-Adjuvans zu induzieren, gefolgt von der Injektion von Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin in die Forniceal-Subconjunctiva und Tränendrüsen Sechs Wochen später.

Zusammenfassung

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Trockene Augenkrankheit ist eine sehr häufige Erkrankung, die Morbidität und Gesundheitspflege verursacht und die Lebensqualität verringert. Es besteht ein Bedarf für ein geeignetes Trockenaugen-Tiermodell, um neue Therapeutika zu testen, um die Autoimmun-Trockenaugenbedingungen zu behandeln. Dieses Protokoll beschreibt ein chronisches Autoimmun-Trockenaugen-Rattenmodell. Lewis-Ratten wurden mit einer Emulsion mit Tränendrüsenextrakt, Ovalbumin und komplettem Freund-Adjuvans immunisiert. Eine zweite Immunisierung mit den gleichen Antigenen in unvollständigem Freund-Adjuvans wurde zwei Wochen später verabreicht. Diese Immunisierungen wurden subkutan an der Basis des Schwanzes verabreicht. Um die Immunantwort an der Augenoberfläche und den Triumphdrüsen zu verstärken, wurden in den Forniceal Subconjunctiva und in den Tränendrüsen 6 Wochen nach der ersten Immunisierung Triumphdrüsenextrakt und Ovalbumin injiziert. Die Ratten entwickelten trockene Augenmerkmale, einschließlich reduzierte Tränenproduktion, verringerte Reißstabilität und erhöhte Hornhautschäden. Immune proDie Einreichung durch Durchflusszytometrie zeigte ein Übergewicht von CD3 + -Effektor-Speicher-T-Zellen im Augapfel.

Einleitung

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Trockene Augenkrankheit (DED) ist eine multifaktorielle Erkrankung der Tränen und der Augenoberfläche, die zu Symptomen von Unbequemlichkeit, Sehstörungen und Tränenfilminstabilität führt, die zu einer Beschädigung der Augenoberfläche führen können. Es begleitet von einer erhöhten Osmolarität des Tränenfilms und einer Entzündung der Augenoberfläche 1 . Symptome, die mit DED verbunden sind, sind Brennen, Stechen, Korn, Fremdkörpergefühl, Reißen, Augenmüdigkeit und Trockenheit 2 , 3 . Die beiden Hauptursachen von DED sind die Tränenproduktion durch die Tränensekretionsdrüse und die übermäßige Verdunstung des Tränenfilms 4 . Bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen wie Sjogren-Syndrom, systemischem Lupus erythematodes und rheumatoider Arthritis-Immunschwäche an den Meibomdrüsen reduziert die Expression von Lipiden, die für die Reißstabilität essentiell sind. Auch die Immunschädigung der Augenoberfläche verringert die ProduktivitätAuf Mucins, die für die Oberflächenbenetzbarkeit wichtig sind. Gemeinsam verursachen diese Prozesse kumulativ chronisches trockenes Auge 5 , 6 , 7 .

Tränenersatz und entzündungshemmende Therapie sind die Standbeine der Therapie. Allerdings sind aktuelle entzündungshemmende Therapien für DED ( dh Kortikosteroide und Cyclosporin) weitgehend immunsuppressiv, was zu schwerwiegenden Nebenwirkungen 8 , 9 , 10 führt . Es besteht die Notwendigkeit für ein geeignetes Tiermodell, um neue immunomodulatorische Mittel zu testen, um das Autoimmun-Trockenauge zu behandeln.

Mäuse mit spezifischen genetischen Defekten 11 , 12 , 13 , Mäuse ohne spezifische Gene 14 , 15 und transgene Mäuse, die Immunoregulat überexprimierenOry-Gene wurden als Modelle der Autoimmun-Trockenauge verwendet 16 , 17 . Antigen-induzierte Autoimmun-Tiermodelle wurden auch bei Mäusen 18 , Kaninchen 19 und Ratten 20 , 21 beschrieben. Hier beschreiben wir ein Antigen-induziertes Modell des chronischen Autoimmun-Trockenauges. Dieses Modell ist eine Modifikation von zwei früheren Modellen; Eine verwendete Tränendrüsenextrakte, und die zweite verwendete ein Autoantigen ( dh klk1b22) aus den Tränendrüsen 20 , 21 .

Die Erkrankung wurde durch die subkutane Immunisierung von 6 bis 8 Wochen alten weiblichen Lewis-Ratten mit Ovalbumin, komplettem Freund-Adjuvans und einer Emulsion mit Tränendrüsen-Extrakten aus Sprague-Dawley-Ratten induziert (Abbildung 1 ). Eine zweite Immunisierung mit demselben Antigen in unvollständigem Freundschen Adjuvans warZwei Wochen später verabreicht. Um Antigen-spezifische Immunzellen an die Tränendrüse und die Augenoberfläche zu rekrutieren, wurde die Mischung aus Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin (1 mg / ml) in die forniceale Subconjunctiva und die Tränendrüsen an der 6. bis 7. Woche injiziert (Abbildung 1 ). Mehr als 85% der Ratten entwickelten charakteristische Merkmale des trockenen Auges 70 Tage nach der ersten Immunisierung. Diese Merkmale beinhalten eine reduzierte Tränenproduktion (Abbildung 2 ), eine erhöhte Hornhautfluoresceinfärbung (Abbildung 3 ) und eine verminderte Reißstabilität (Abbildung 4 ). Die Immunprofile der T-Zellen in den Augäpfeln der normalen Ratten durch die Durchflusszytometrie zeigen ein Übergewicht von CD3 + -Effektor-Speicher-T-Zellen ( 5 und 6 ). Ratten mit autoimmunem DED zeigen eine Zunahme der CD3 + Effektor-Speicher-T-Zellen und eine entsprechende Abnahme der naiven und zentralen Speicher-T-Zellen (Abbildung 6 ).

Protokoll

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Die Tiere wurden nach den institutionellen Richtlinien und der ARVO-Erklärung zur Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie und der Sehforschung behandelt. Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee von SingHealth genehmigt.

1. Vorbereitung des Tränendrüsenextraktes

HINWEIS: Die Ratten wurden mit der intraperitonealen Injektion von Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) betäubt. Die korrekte Anästhesierung wurde durch Zehenkneifen und Heckklemmen bestätigt. Ophthalmisches Gel wurde auf die Rattenaugen aufgetragen, um die Trockenheit nach jedem Verfahren zu verhindern. Die anästhesierten Ratten wurden unter fernen Infrarotlampen platziert, um die Tiere warm zu halten, bis sie sich vollständig erholten. Während der Prozeduren und der Erholungszeit wurden die Tiere von Forschern genau beobachtet. Alle Materialien und Chirurgie Werkzeuge waren steril vor Gebrauch. Am Ende des Experiments wurden die Ratten durch die intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (80 mg / kg) euthanasiert.Vollständige Sterbehilfe wurde durch Mangel an Herz-Puls und kein Blink-Reflex durch Berühren der Augapfel verifiziert. Ratten wurden unter Standardbedingungen untergebracht: Raumtemperatur, 21-23 ° C; Relative Feuchtigkeit, 30-70%; Hell-Dunkel-Zyklus, abwechselnd 12 h (7 Uhr bis 19 Uhr).

  1. Lege die euthanasierten weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (Altersgruppe von 8 Wochen bis 16 Wochen) flach, mit einem Ohr gegen den Tisch und das andere nach oben. Machen Sie einen 10-mm-Einschnitt überlegen-inferior unter dem exponierten Ohr mit einem Paar Frühling Schere. Entfernen Sie die Tränendrüse, indem Sie sie aus dem umgebenden Bindegewebe und aus dem Drainagekanal zerlegen.
    1. Lagern Sie die Drüsen bei -80 ° C bis erforderlich. Tauen Sie die Drüsen auf Eis. Hacke so fein wie möglich auf Eis mit Schere. Füge 150 μl PBS mit 1x Protease-Inhibitor pro Tränendrüse hinzu.
  2. Sonden Sie die Proben auf Eis für 5 min bei 20 kHz, wobei der Beschallungsgerät auf 10 s eingestellt ist, 10 s aus bei 30% Amplitude. Zentrifugiere den SohnProben für 20 min bei 13.000 xg und 4 ° C.
  3. Den Überstand pipettieren und auf ein neues Röhrchen übertragen. Aliquotieren Sie den Überstand auf 1,5 ml Röhrchen und lagern Sie sie bei -80 ° C. Messen Sie die Proteinkonzentration mit einem Bicinchoninsäure-Assay 22 nach den Anweisungen des Herstellers.

2. Herstellung von Emulsion und Pertussis-Toxin

  1. Emulsion
    1. Füge 40 mg Hitze-getötete Mycobacterium tuberculosis H37Ra in 10 ml vollständiges Freund's Adjuvans hinzu, das 1 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra enthält und gut vermischt.
      HINWEIS: Der letzte Komplett-Freund-Adjuvans enthält 5 mg / ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
    2. Wiegen Sie das Ovalbumin, lösen Sie es in PBS auf und bereiten Sie eine Antigenmischung mit 2 mg / ml Ovalbumin und 10 mg / ml Lacrimaldrüsenextrakt vor. Für ein Injektionsvolumen von 200 μl für jedes Tier wird eine Mastermischung b vorbereitetAuf die Tierzahlen
    3. Übertragen Sie unvollständigen Freund-Adjuvans oder vollständigen Freund-Adjuvans zu einem 50-ml-Röhrchen, wobei sichergestellt wird, dass das Volumen des Adjuvans zur Antigenmischung im Verhältnis 1: 1 liegt. Fügen Sie die Antigen-Mischung tropfenweise dem Adjuvans hinzu, während Sie mit der höchsten Geschwindigkeit vortexen, die nicht zu Verschütten führt. Fortsetzen Sie das Vortexen für 5 min, nachdem alle Antigen hinzugefügt worden sind.
    4. Übertragen Sie die Emulsion auf eine 5-ml-Spritze und verknüpfen Sie sie mit einer weiteren 5-ml-Spritze durch einen Spritzenanschluss. Schieben Sie die Emulsion von einer Spritze auf die andere, um sie zu mischen.
      HINWEIS: Die Emulsion ist bereit, wenn ein einzelnes Tröpfchen als Kugel bleibt, wenn es in Wasser gelegt wird. Es sollte nur frisch zubereitete Emulsion oder Emulsion, die über Nacht bei 4 ° C gelagert wurde, verwendet werden.
  2. Pertussis-Toxin
    1. 50 μg Pertussistoxin in 500 μl Wasser rekonstituieren, um eine Endkonzentration von 100 ng / μl zu erhalten. Votex den Behälter für 30 s, um sicherzustellen, dass die tOxin löst sich vollständig auf.
      HINWEIS: Sterilisieren Sie nicht durch Filtration, da dies zu einem Materialverlust führen wird. Nicht einfrieren. Diese Lösung bleibt für mindestens 6 Monate bei 4 ° C aktiv.
    2. Verdünnen Sie 100 ng / μl Pertussistoxin auf 3 ng / μl unter Verwendung von PBS. Übertragen Sie 100 μl des verdünnten Pertussistoxins auf eine 1 mL Luer-Lock-Injektionsspritze mit einer 27 G-Nadel.

3. Immunisierung der Lewis-Ratten

  1. Am Tag 0, mischen Sie die Emulsion ein paar Mal. Verteilen Sie 200 μl der Emulsion, die 1 mg Tränendrüsenextrakt und 200 μg Ovalbumin in komplettem Freund-Adjuvans enthält, in 1-mL Luer-Lock-Spritzen mit 27G-Nadeln. Injektion der Emulsion subkutan an der Basis der Rattenschwänze ohne Anästhesie.
    HINWEIS: Der Schwanz muss vor der Injektion nicht vorgewärmt werden. Jede Ratte wird mit 1 mg Tränendrüsenextrakt und 200 μg Ovalbumin in komplettem Freund-Adjuvans-Witz immunisiertH 500 & mgr; g Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
  2. Am Tag 14 injizieren Sie 200 μl der Emulsion, die 1 mg Tränendrüsenextrakt und 200 μg Ovalbumin in unvollständigem Freund-Adjuvans enthält, in gleicher Weise wie am Tag 0. Intraperitoneal in 300 μl Pertussistoxin in 100 μl PBS injizieren Pro Ratte am selben Tag.

4. Injektion der Antigenmischung in die Forniceal Subconjunctiva und Lacrimal Gland zur Rekrutierung von Antigen-spezifischen Immunzellen und Ursache lokaler Entzündung

  1. Berechnen Sie die Menge an Ovalbumin und Tränendrüsenextrakt, basierend auf der Anzahl der Ratten im Experiment. Wiegen Sie die erforderliche Menge an Ovalbumin und kombinieren Sie sie mit dem in Schritt 1 hergestellten entfrostten Tränendrüsenextrakt, wodurch eine Antigenlösung mit 1 mg / ml Ovalbumin und 1 mg / ml Tränendrüsenextrakt hergestellt wird.
  2. Anästhesieren der Ratten mit Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion. KneifenEs von Ratten, um sicherzustellen, dass eine ordnungsgemäße Anästhesie erreicht wurde ( dh keine reaktionsschnelle Bewegung wird nach der Prise beobachtet). 5 μl Antigen in die forniceale Subconjunctiva des Auges injizieren. 20 μl Antigen in die Tränendrüse injizieren.

5. Bewertung der trockenen Augenmerkmale

HINWEIS: Für die Schritte 5.1-5.3 sollten die anästhesierten Ratten sanft von einer Handschuhhand in einer aufrechten Position auf einer ebenen Fläche gehalten werden, um Bewegung zu vermeiden.

  1. Messen Sie das Tränenvolumen mit Phenol-Rotfaden.
    1. Benutze eine Pinzette, um den Faden zu halten und einen anderen, um das untere Augenlid der Ratte zu ziehen. Setzen Sie den Faden in die proximale Ecke des unteren Fornix für 1 min und entfernen Sie dann den Faden.
      HINWEIS: Tränen machen den benetzten Teil des Fadens rot in Farbe.
    2. Nehmen Sie ein Bild von der Länge des benetzten Teils des Fadens neben einem Lineal mit Millimeter-Markierungen. Messen Sie die benetzte Länge bis zum zehnten oFa Millimeter mit einer Bildsoftware ( zB ImageJ).
  2. Hornhaut / Reißfestigkeit messen.
    1. Legen Sie die Ratte unter ein Stereomikroskop mit einem Ring-Illuminator und einer Kamera ausgestattet. 5 μl Kochsalzlösung auf die Rattenhornhaut auftragen. Passiv blinzeln, indem man die oberen und unteren Augenlider mit behandschuhten Fingern bewegt ~ 5 mal, um die Kochsalzlösung zu verbreiten.
    2. Fokussiere die Ringbeleuchtung auf die Mitte der Hornhautoberfläche unter 1,6facher Vergrößerung. Erwerben Sie fotografische Bilder nach 10 s.
      HINWEIS: Die Ringbeleuchtung projiziert zwei kreisförmige Reihen von Punktbildern auf den Hornhäuten des Tieres. Der regelmäßige Abstand der unverzerrten Punkte deutet auf eine glatte Hornhaut / Tränenschicht hin.
  3. Messen Sie Hornhautschäden mit Fluorescein-Färbung.
    1. Füge 2 μl 0,2% Fluorescein zur Rattenhornhaut hinzu. Passiv öffnen und schließen Sie die Ratte Augenlider 3 mal mit einem behandschuhten Finger, um den Fluorescein-Farbstoff auf der Oberfläche des Auges zu verbreiten.
    2. Nach 1 min 1 ml Kochsalzlösung mit einer 3-ml-Spritze (ohne Nadelbefestigung) auftragen, die Spritze ca. 2-3 mm vor der Hornhaut positionieren und vorsichtig Salz auf das Auge legen.
    3. Erfassen von Bildern unter dem Kobaltblau-Filter ( dh ~ 400 nm) eines Okular-Imaging-Mikroskops mit abgeschalteten Hintergrundlichtern.
      HINWEIS: Die Bilder wurden anschließend durch ein von früheren Publikationen modifiziertes Sortiersystem analysiert. Die Bilder wurden dann analysiert, indem man die Anzahl, den Bereich und die Intensität der grünen Flecken von 0 bis 2 subjektiv abgrenzte, wobei 0 ihr Fehlende anzeigt, 1 eine punktförmige Färbung von weniger als 50 Flecken anzeigt und 2 eine punktförmige Färbung von mehr als 50 Flecken anzeigt.
  4. Euthanisieren Sie die Ratten durch die intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (80 mg / kg). Entfernen Sie die oberen und unteren Augenlider mit einer Schere. Fix und Prolaps die Augäpfel, indem sie auf die periokulären Gewebe mit Pinzette. Befreien Sie den Globus, indem Sie t trennenEr extraokulare Muskeln, der Sehnerv und die Forniceal-Konjunktiva.
  5. Fixieren Sie die Position des Ratten-Augapfels mit einer Pinzette und öffnen Sie sie mit einem umlaufenden Schnitt entlang des Äquators. Entfernen Sie das Objektiv und glasig. Setzen Sie die zerlegten Augäpfel in 1,5 ml Röhrchen auf Eis.
  6. Sammeln Sie die Tränendrüsen, wie in Schritt 1.1 beschrieben. Vermeiden Sie sofort die seziertes Augapfelgewebe und die lakralen Drüsen in das Labor, um sich auf die Durchflusszytometrieanalyse vorzubereiten.
  7. Isoliert die Immunzellen mit Kollagenase und Dispase II Verdauung Methoden 24 , 25 . Gehen Sie dazu vor, die Durchflusszytometrie zu verwenden, um die T-Zell-Subpopulation im Augapfelgewebe 26 zu profilieren.
    ANMERKUNG: Die Tafel der Antikörper sind: anti-CD45APC-Cyanin7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanin7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22), anti -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50) und Lebensfähigkeitszellfarbstoff 7-AAD. Unter den CD45 + CD3 + 7AAD - Population, naïve (CD3 + CD45RC + ), Effektorgedächtnis (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ) und zentrale Speicher (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) T-Zellen wurden gated .

Ergebnisse

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Abbildung 1 veranschaulicht das Experimentdesign. Bei beiden Tag 48 und Tag 70 werden in den immunisierten Ratten trockene Augen klinische Merkmale beurteilt. Das Tränenvolumen wird durch die Länge des nassen Teils des Phenolrotfadens dargestellt. Fig. 2 zeigt repräsentative Bilder von Phenolrotfäden aus Kontroll- und DED-Ratten. Die Länge der Phenolrotfäden in der DED-Gruppe ist kürzer als die Kontrollgruppe, was auf weniger Tränenvolumen hindeutet.

Fluorescein bindet an beschädigtes Hornhautepithel. So wird die Hornhautschädigung durch Hornhautfluoresceinfärbung gemessen. Fluoresceinflecken auf der Hornhautoberfläche von DED-Ratten wurden von 0 bis 2 abgestuft und mit Kontrollratten verglichen. Ratten mit DED haben mehr Fluorescein-Färbung als Kontrollratten (Abbildung 3 ), was auf Hornhautschäden hindeutet.

Die HornhautglätteIn DED und Kontroll-Ratten wurde von der Ring-Illuminator beurteilt. Wenn die Hornhautoberfläche glatt ist, mit hoher Reißfestigkeit ist das Bild des Beleuchtungsringes auf der Augenoberfläche rund und perfekt. Die Verzerrung des Bildes zeigt eine verminderte Hornhautglätte und einen instabilen Tränenfilm an. Der Verzerrungsgrad des Rings wurde von 0 bis 2 abgestuft. In der DED-Gruppe wurde ein höherer Ringverzerrungsgrad festgestellt (Abbildung 4 ), was auf eine geringere Reißstabilität hinweist.

Ratten sind definiert als mit trockenem Auge, wenn mindestens zwei klinische Merkmale des trockenen Auges abnormal sind. Unter den 24 immunisierten Ratten entwickelten 21 Ratten am Tag 48 DED. Die Ergebnisse waren bei der Bewertung am Tag 70 konsistent.

Die Durchflusszytometrieanalyse zeigt, dass die vorherrschende T-Zell-Untergruppe in normalen Ratten-Augapfelgeweben Effektorspeicher-T-Zellen sind (Abbildung 5 ). In den Augäpfeln von DED Ratten, ~ 70% der CD3+ T-Zellen sind Effektor-Speicher-T-Zellen, während bei Kontroll-Ratten diese Zahl ~ 50% beträgt. Augäpfel von DED-Ratten haben signifikant höhere Effektor-Speicher-T-Zellen als die von Kontroll-Ratten (Abbildung 6 ).

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Abbildung 1: Schema des experimentellen Designs. LG: Tränendrüse; DED: trockene Augenkrankheit; CFA: Komplettes Freund's Adjuvans; IFA: unvollständig Freund's Adjuvans. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Phenol-Rot-Faden misst das Tear-Volumen. Phenol-Rotfaden wird an der proximalen Ecke der beiden Rattenaugen für 1 min platziert und dann entfernt. RepräsentativE Bilder des Phenolrotfadens, zusammen mit einem Lineal, sowohl von Kontroll- als auch von DED-Gruppen gezeigt. ImageJ wurde verwendet, um die Länge des nassen Teils des Phenolrotfadens zu messen. Maßstab = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Repräsentative Bilder des Hornhaut-Epithelschadens gemessen durch Fluorescein-Färbung. Jede Rattenhornhaut wurde mit 0,2% Fluorescein für 1 min gefärbt und mit mindestens 1 ml Kochsalzlösung gespült. Bilder wurden unter einem Augenbild-Mikroskop mit kobaltblauem Licht aufgenommen. Die erste Spalte zeigt repräsentative Bilder von Kontrollhornhäuten. Die zweite Spalte enthält repräsentative Bilder der Hornhautfärbung von Ratten mit DED-Merkmalen. Die grünen fluoreszierenden Flecken zeigen Hornhautepithelien an L Schaden Alle Bilder wurden in der gleichen Farbskala produziert. Die Quantifizierung der Fluorescein-Färbung erfolgte nach der Fläche und Dichte der grünen Flecken. Maßstab = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4: Repräsentative Hornhautbilder, die die Reflexion des Ring Illuminators zeigen. Rattenhornhaut / Reißfestigkeit wurde durch eine Ringbeleuchtung gemessen. Der Verzerrungsgrad des Rings in den aufgenommenen Bildern ist ein Maß für die relative Reißstabilität. Die linke Spalte zeigt die repräsentativen Bilder in Kontrolltieren, und die rechte Spalte zeigt repräsentative Bilder nach der Induktion des trockenen Auges. Maßstab = 1 mm.Ank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Dot-Plots aus der Durchflusszytometrie-Analyse abgeleitet. T-Zellen, die aus Augapfelgeweben isoliert wurden, wurden mit einer Tafel von Antikörpern gefärbt. In der CD45 + CD3 + 7AAD - Population wurden CD3 + 7-AAD - T-Zellen gated. Unter den CD3 + 7-AAD - T-Zellen wurden die naiven, zentralen Speicher- und Effektor-Speicher-T-Zellpopulationen bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6: T-Zell-Subpopulationsprofil in den Augäpfeln. CD3 + CD45RC+ Naive T-Zellen, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - Effektorspeicher T (T EM ) Zellen und CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + Zentralspeicher T (T CM ) Zellen werden als Prozentsatz der CD3 + T Zellen dargestellt. Ergebnisse sind von 3 Kontrollratten und 6 DED Ratten. Ähnliche Ergebnisse wurden aus der Analyse von T-Zellen aus isolierten Tränendrüsen (Daten nicht gezeigt) erhalten. Der ungeplante Student's t-Test wurde für den statistischen Vergleich verwendet. Die Fehlerbalken repräsentieren den SD. * P <0,05, ** p <0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

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Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Gewährleistung der Homogenität der Emulsion. In gut vorbereiteten Emulsionen sind die Antigene vollständig mit Öl beschichtet, was die langsame Freisetzung des injizierten Antigens und die kontinuierliche Immunstimulation sicherstellt. Ein weiteres kritisches Merkmal dieses Protokolls ist die Verwendung von Lewis-Ratten. Lewis-Ratten sind empfindlicher für die Entwicklung von Autoimmunkrankheiten als andere Stämme 27 .

Dieses Protokoll wurde von zwei zuvor veröffentlichten Protokollen modifiziert, die entweder nur Tacrimaldrüsenextrakt oder rekombinante Klk1b22 20 , 21 verwenden. In dem aktuellen Protokoll werden Ovalbumin plus Tränendrüsenextrakt als Antigen verwendet, und antigenspezifische Immunzellen werden von der Augenoberfläche und der Tränendrüse angezogen, wodurch lokale Gewebeschäden verursacht werden. Trockenes Auge entwickelt sich langsam und erreicht nach der anfänglichen Immunisierung ~ 85% pro Tag 48. Antigene Herausforderung an dieAuge und Tränendrüse am Tag 48 verschärft das trockene Auge und sorgt für ihre Chronizität bis zum Tag 70.

Im Vergleich zum rekombinanten Klk1b22 im Klk-induzierten DED-Modell sind der im aktuellen Modell verwendete Tränendrüsenextrakt und Ovalbumin billiger und leichter zu erreichen. Der Tränendrüsenextrakt enthält auch andere Proteine, abgesehen von Klk, die Autoimmunität induzieren können, so dass dieser Extrakt theoretisch stärker ist als die Klk-Methode bei der Induktion von DED. Wir haben auch versucht, die Ratten nur mit Tränendrüsenextrakt zu immunisieren; Obwohl diese immunisierten Ratten DED entwickelten, gab es keine signifikante Zunahme der Effektor-Speicher-T-Zellen in Augapfelgeweben im Vergleich zu Kontrollen.

Die Begrenzung dieser Technik ist, dass es 70 Tage dauert, um das Modell zu erreichen. Effektor-Speicher-T-Zellen sind die Haupt-T-Zell-Teilmengen im normalen Rattenauge. In diesem Modell führt Autoimmun-DED zu einer Erhöhung der CD3 + -Effektor-Speicher-T-Zellen im Augapfel. Drogen, die prefErzielung von Effektor-Speicher-T-Zellen, wie selektive Inhibitoren des Kv1.3-Kaliumkanals, können daher einen therapeutischen Nutzen für die Autoimmun-DED 28 haben .

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte. LT erhielt vorherige Finanzierung und / oder Geschenke von Alcon, Allergan, Santen, Bausch und Lomb, Eyelens und Eyedetec.

Danksagungen

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Die Autoren danken Frau Zinn Min Qi und Dr. Veluchamy Amutha Barathi und ihr Team für ihre Hilfe beim Umgang mit den Tieren. Diese Arbeit wurde von NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 und NMRC / CSA / 045/2012 unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ReagenzienProteaseinhibitor-Cocktail
Sigma-AldrichP2714-1BTL
Pierce BCA Protein Assay KitThermal Scientific23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Becton, Dickinson und Konsortenvervollständigen 231141
Freund's AdjuvansBecton, Dickinson & Co.231131
OvalbuminSigma-AldrichA5503-10G
unvollständig Freund's AdjuvansSigma-AldrichF5506-6X10ML
Pertussis-ToxinSigma-AldrichP7208-50UG
Fluorescein-Natrium-LösungBausch & Lomb U.K LimitedNA
strong>NameCompany<>KatalognummerKommentare
Ausrüstung
SonicatorSonics Vibra-Cell
Phenol roter FadenTianjin Jingming Neue Technologische Entwicklung Co. LTD.
Stereomikroskop mit Ringlichtbeleuchtung und KameraCarl ZeissNA
Micro IV Mikroskop Phoenix Research LabsNA
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Referenzen

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