Methodenartikel

Wiederholte Messung der Atemmuskelaktivität und Ventilation in Mausmodellen von neuromuskulären Erkrankungen

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DOI:

10.3791/55599

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17. April 2017

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati, 2Department of Biological Sciences, Wright State University, 3Division of Neurosurgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Papier stellt ein Verfahren zur wiederholten Messungen der Belüftung und Atmungsmuskelaktivität in einem frei amyotrophe Lateralsklerose (ALS) Mausmodell im gesamten Fortschreiten der Krankheit mit Ganzkörper-Plethysmographie und Elektromyographie über eine implantierte Telemetrieeinrichtung verhält.

Zusammenfassung

Atemhilfsmuskulatur helfen Belüftung zu halten, wenn Blendenfunktion beeinträchtigt wird. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur wiederholten Messungen über Wochen oder Monate aktivität Atemmuskulatur bei gleichzeitiger Belüftung in einer nicht-narkotisierten Messung frei verhaltenen Maus. Die Technik beinhaltet die chirurgische Implantation eines Funksenders und die Einfügung von Elektrodenleitungen in den scalene und Trapezius die Elektromyogramm Aktivität dieser Inspirationsmuskeln zu messen. Ventilation wird durch Ganzkörper-Plethysmographie gemessen und Tierbewegung wird durch Video bewertet und mit Elektromyogramm Aktivität synchronisiert. Messungen der Muskelaktivität und Belüftung in einem Mausmodell der amyotrophen Lateralsklerose, um zu zeigen vorgestellt, wie dieses Werkzeug verwendet werden kann, wie Atemmuskelaktivität Veränderungen im Laufe der Zeit zu untersuchen und die Auswirkungen der Muskelaktivität auf Belüftung zu beurteilen. Die beschriebenen Verfahren können easily angepasst werden, um die Aktivität von anderen Muskeln zu messen oder Atemhilfsmuskelaktivität in zusätzlichen Mausmodellen von Krankheiten oder Verletzungen zu beurteilen.

Einleitung

Accessory Atemmuskulatur (ARM) erhöht Belüftung während Zeiten hoher Nachfrage ( zum Beispiel Bewegung) und hilft Belüftung aufrechtzuerhalten , wenn Membranfunktion 1 nach der Verletzung oder Krankheit beeinträchtigt ist, 2. Obwohl Veränderungen in der Membranfunktion haben in der amyotrophen Lateralsklerose (ALS) -Patienten und Mausmodellen 3, 4, 5, 6, gut beschrieben worden Viel weniger ist über die Aktivität oder Funktion von Arm in ALS bekannt. Eine Studie vorgeschlagen , jedoch, dass ALS - Patienten , den Arm haben eine bessere Prognose als solche mit ähnlichem Zwerchfell Dysfunktion rekrutiert , die nicht 7 tun. Weiterhin ist ARM Aktivität ausreichend für die Atmung in Fällen von Membran Paralyse 8. Diese Studien zeigen, dass Strategien ARM-Funktion erweitern breathi verbessernng in Patienten, die an neuromuskulären Erkrankungen, Rückenmarksverletzung leidet, oder anderen Zuständen, bei denen Membranfunktion beeinträchtigt wird. Allerdings sind die Mechanismen steuern ARM Rekrutierung für die Atmung weitgehend unbekannt. Methoden Atemfunktion und Veränderungen in der ARM-Aktivität im Laufe der Zeit in Tiermodellen von Krankheiten oder Verletzungen nötig ist, um zu untersuchen, wie Arm rekrutiert, sowie zu bewerten Therapien zu messen ARM Rekrutierung und Belüftung zu verbessern. Darüber hinaus kann die erhöhte Aktivität von Armen mit dem fortschreitenden Verlust der Membranfunktion zusammenfällt , kann den neuromuskulären Krankheiten wie ALS 7, 9, 10 ein nützlicher Biomarker für Fortschreiten der Krankheit sein.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum nicht-invasiv (nach der ersten Operation) und wiederholt die Aktivität der Atemmuskeln messen und Belüftung in wach, verhaltenen Mäusen. Synchronisierte Aufnahmen von Elektromyogrammy (EMG), Ganzkörper-Plethysmographie (WBP) und Video ermöglichen es dem Untersucher, wie Veränderungen in der ARM-Aktivität Auswirkungen Belüftung zu bewerten und zu bestimmen, wenn das Subjekt in Ruhe ist oder sich bewegt. Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens ist , dass es in wach, verhaltenen Mäusen durchgeführt werden, während einiger alternativen Methoden erfordern EMG zu messen , die Anästhesie und / oder endständige Verfahren 11, 12, 13. Die Aufzeichnung der EMG - Aktivität in Mäusen wach im Laufe der Zeit auch durch die chronische Implantation von EMG erreicht werden kann , führt, wo die Maus durch Drähte mit dem Erfassungssystem gebunden ist 14, 15. Da eine Maus Anbinden mit normaler Bewegung oder Verhalten stören könnte und nicht mit einer Standard-Plethysmographie Kammer kompatibel ist, verwendet das beschriebene Verfahren Telemetriegeräte drahtlos das EMG-Signal an das Erfassungssystem zu senden. Der Sender kanngedreht wird mit einem Magneten an oder ausgeschaltet, um Energie zu sparen und ermöglicht Messungen von EMG-Aktivität über mehrere Monate wiederholt. Dieses Protokoll kann leicht die Aktivität von zusätzlichen respiratorischen oder nicht-respiratorischen Muskeln zu messen, indem die EMG Einsetzen führt in verschiedene Muskeln. Alternativ kann eine der beiden Leitungen kann verwendet werden EEG - Aktivität zu messen Schlafzustand zu beurteilen oder Anfallsaktivität 16 zu identifizieren. Diese Technik wird erfolgreich verwendet worden , in einem Mausmodell der ALS Veränderungen in ARM - Aktivität in Ruhe im gesamten Krankheitsverlauf zu messen und wichtige Neuronen Antriebsarm Aktivität in gesunden Mäusen 10 zu identifizieren.

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Protokoll

Experimentelle Verfahren wurden von der Cincinnati Children Hospital Medical Center Institutional Animal Care und Use Committee und durchgeführt in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.

1. Vorbereitung für Telemetrieeinrichtung Implantatchirurgie

  1. Setzen Sie auf persönliche Schutzausrüstung (dh, Peelings, Überschuhe, Kittel, Haarnetz, Maske und OP - Handschuhe).
    HINWEIS: Diese Operation erfordert einen sterilen Bereich.
  2. Schalen Sie den Inkubator (servogesteuerten Befeuchter / Säuglingsinkubators bis 29 ° C eingestellt) und Linie mit trockenen, weißen Handtücher richtige Erwärmung für die Wiederherstellung zu ermöglichen.
  3. Vor der Operation sterilisiert alle chirurgischen Instrumente mit Ethylenoxid sterilisieren und den Sender mit einem enzymatischen Reinigungsmittel und chemischen Sterilisierungsmitteln (oder, wie vom Hersteller angegeben) vor der Verwendung.
    HINWEIS: Chirurgische Instrumente sollten # 2 Laminektomie Zangen (Standardspitzen / gerade / 12 cm) (x4) umfassen, schmalMuster Zange (geriffelt / gebogene / 12 cm), Gewebe-Trennschere (gerade / blunt-blunt / 11,5 cm) und ein Skalpellträger und Klinge. Es wird empfohlen, einen separaten Satz von sterilisierten Instrumenten zu haben (zwei # 2 Pinzette und Schere) reserviert ausschließlich die Drähte des Senders für die Handhabung der chirurgischen Werkzeuge in gutem Zustand zu halten.
  4. Sterilisiert alle Oberflächen innerhalb des Operationsfeldes mit einem akzeptablen Desinfektionsmittel. Positionieren Sie einen Stereo - Präpariermikroskop, Isofluran Anästhesiegerät, chirurgische Instrumente und Klipper im Operationsfeld (siehe die Tabelle der Materialien).
  5. Um die Maus Körpertemperatur beizubehalten, während die Narkose, legt ein Heizkissen oder Wasser Decke unter dem sterilen Tuch vor dem Stereo Dissektionsmikroskop.
  6. Stellen Sie sicher, dass der Sender vor voll funktionsfähig ist, zu verwenden.
    HINWEIS: Ein kleiner Magnet innerhalb 2 in dem Sender platziert wird das Gerät ein- und ausschalten. Wenn der Sender auf und hielt nahe einem raDio bei 500 Hz AM-Frequenz eingestellt ist, wird es einen kontinuierlichen, schrillen Summton emittiert. So speichern Sie die Lebensdauer der Batterie, schalten Sie den Akku aus, bevor es in das Tier implantiert wird.
  7. Bereiten Sie die Elektrode vor der Operation führt durch die distalen Leitungen mit der Schere Beschneiden reserviert für Drähte Handhabung , so dass es etwa 3 cm von Blei ist (genug , um den Zielmuskel zu erreichen) (1A). Alternativ kann die Spule um die Drähte proximal zu der Vorrichtung und binden sie zusammen mit Nähten, so dass es etwa 3 cm von abgewickelten Blei ist.
    HINWEIS: Speicher der beschnittene-off Teil der Elektrode führt, um die „lead caps“ (kunststoffisolierten Gehäuse) herzustellen, wie in Schritt 1.9 beschrieben. In Schritt 3 werden die Sendeleitungen durch den Muskel eingeführt wird, so, und der distale, freiliegenden Teil der Leitungen muß an ihrem Platz gehalten werden, und die isolierte Leitung Kappen verwendet.
  8. Verwenden eines Skalpells 0,5 cm von der Kunststoffhülle zu trimmen, ohne den Draht selbst zu schneiden. Verwenden Sie die Werkzeuge reserviert for Drahthandhabungs die Enden der Zuleitungen 4 strecken - ihre ursprüngliche Länge 5x so dass sie passen leicht in einer 25-Gauge - Nadel (1B-B ‚‘). Schneiden Sie die freiliegenden Draht der Leitungen, so dass sie 0,5 cm lang sind.
  9. Bereiten Blei Kappen (Kunststoffrohre die Drahtenden abzudecken) vor der Operation. Verwenden eines Skalpells zu trimmen 0,25 cm langen Rohren aus dem Kunststoffgehäuse mit den Segmenten Elektrode umgibt führt von Schritt 1.7 gespeichert.
    HINWEIS: Vier Bleikappen sind für jede Maus benötigt, die Implantation unterzogen werden, aber es ist am besten zweimal die erforderliche Menge von Kappen vorzubereiten. zusätzlichen steril vorbereitet Bleideckel zu haben, ist hilfreich bei einer Bleikappe Sicherung beim ersten Versuch nicht erfolgreich ist.
  10. Notieren Sie die Seriennummer des eingesetzten Senders und die Originalverpackung mit den kalibrierten Informationen speichern. Jeder Sender verfügt über verschiedene Frequenzkalibrierungen für die EMG-Aufzeichnung; geben diese in die Erfassungssoftware auf akzeptable EMG zu erhaltenAufnahmen.

2. Vorbereitung der Maus für Chirurgie

  1. Wählen Sie die gewünschte Maus für die Implantation (dh SOD1 (G93A) oder die Kontrolle) und das Tier wiegen.
    HINWEIS: Das empfohlene Alter und Gewicht für eine Maus (männlich oder weiblich), um diese Operation unterziehen ist P56 - P120 und ≥ 24 g.
  2. Anesthetize die Maus unter 3,5% Isofluran mit 2 L / min Sauerstoffströmungsrate. Führen Sie eine Zehe Prise und einen Schwanz Prise, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist.
  3. Sobald anästhesiert, entfernen Sie die Maus aus der Drop-Box und aufrechtzuerhalten Anästhesie über einen Nasenkegel durch das Isofluran Niveau auf 1,5% festgelegt und die Sauerstoffdurchflussrate 1 L / min. Führen Sie eine Zehe Prise und / oder Schwanz Prise, um sicherzustellen, dass die Narkose gehalten wird.
  4. Anwenden Schmiermittel Augensalbe, die Augen vor dem Austrocknen während der Operation zu verhindern.
  5. Shave die Maus eine Operationsstelle zwischen dem Ohr und der Schulter (1C) zu belichten.
  6. Clip die Fußnägel ipsilateral zur Operationsstelle die Chance, die Maus, um die Leitungen herausziehen oder Wunden während des Heilungsprozesses durch Kratzen verursacht zu verringern.
  7. Alternate Abtupfen die Operationsstelle, zunächst mit Desinfektionsmittel und dann mit Isopropanol. Wiederholen Sie 2 weitere Male.

3. Das Implantieren der Telemetriegerät auf Aufnahme Scalene und Trapezius EMG-Aktivität

  1. Legen Sie das Tier unter einem Dissektionsmikroskop, auf seiner Seite auf der Spitze eines sterilen Wattebausches ein Heizkissen und befestigen den Bugkonus an der Stelle mit Klebeband. Beachten Sie, dass es am besten ist es, die rechte Seite zu implantieren EKG-Signal zu reduzieren, aus dem Herzen stammen.
    HINWEIS: Überwachen der Atmung und stellen Sie die Isofluran-Ebene, falls erforderlich, eine regelmäßige Atemfrequenz und geeignete chirurgische Ebene der Anästhesie aufrecht zu erhalten.
  2. Ziehen Sie den vorderen Gliedmaßen in Richtung des ipsilateralen Fuß entlang des Rumpfes.
    HINWEIS: Diese Position verschiebt das Schulterblatt kaudal, chirurgischen Zugang zu dem s bereitstelltCalene und Trapezius.
    1. Nimmt die stumpfe gebogene Pinzette, hält die Vorderpfote ipsilateral zur Operationsstelle zurück und Band der Pfote in Position (Abbildung 1C). Verwenden Sie starkes Klebstoff -Verband, um sicherzustellen, dass die Pfote für die Dauer des Verfahrens sicher.
  3. Setzen Sie auf ein frisches Paar Operationshandschuhe. Verwenden Sie das Skalpell einen schrägen Einschnitt zu machen, etwa 2 cm lang, zwischen der Schulter und dem Ohr (rote Linie in Abbildung 1C).
  4. Unter Verwendung von zwei # 2 Laminektomie Zange, ein in jeder Hand, zurückziehen , das Fettpolster und die Ausbreitung der Trapezius und platysma Muskeln auseinander , um die Fascia zu belichten und dem sternocleidomastoid scaleni Belag (Figur 1D und E).
  5. Verwenden Sie den bleichen Kopfnickers und Zwerchfellnerv als Landmarken , die scaleni zu identifizieren. Beachten Sie, dass der Phrenikus zu dem scaleni parallel verläuft, während die sternocleidomastoid InFE liegtrior. Die scaleni läuft schräg von dem Halswirbel zu den Rippen unter dem Trapezius. Biopotential führt , wird in den vorderen scalene Muskel eingeführt werden, die als den Muskel identifiziert werden können, die den Phrenikus benachbart verläuft (Figur 1F und G).
    HINWEIS: Vorsicht. Dieser Bereich ist gefäß, und darauf zu achten, Schneiden der Subclavia vermieden wird. Vermeiden Sie den Zwerchfellnerv und Plexus brachialis zu beschädigen.
  6. Sobald die scalene und Trapezius identifiziert (1G), auf dem Rücken des Tieres eine subkutane Tasche für die Sender bilden, zwischen den Schulterblättern.
    1. Verwenden , um die Gewebe-Trennschere, legt die stumpfen Spitzen der Schere unmittelbar unter der Haut und verteile sie , bis eine Taschenöffnung, die ca. 1,25x die Breite des Senders gebildet wird (Abbildung 1 H).
      HINWEIS: Der Sender sollte mit minimalem Widerstand eingesetzt werden, aber die Pockenet sollte nicht so groß sein, dass der Sender auf eigenem bewegen kann. Wenn die Tasche zu klein ist, könnte der Sender reiben auf der Haut, Reizungen verursachen, die das Tier veranlassen kann, die Haut zu kratzen und / oder die Leitungen herausziehen. Wenn die Tasche zu groß ist, könnte Serome bilden, oder der Sender zu einer ungünstigen Position wandern könnte.
  7. Bündig mit warmer, steriler Kochsalzlösung und legen den Sender mit der flacheren Seite gegen den Muskel. Positionieren des Senders , so dass er flach liegt und die Drähte ergeben sich aus der Tasche, die parallel zueinander und nicht verdrillt (1I). Kräuseln überschüssige Länge des Drahtes unter dem Gerät und legt es flach.
  8. Führt die Leitungen von dem Sender an die scalene Trapezius und so, dass die beiden Sätze von Leitungen Bipotential flach und parallel zueinander liegen.
  9. Verwenden Sie die Laminektomie Zange die anteriore scalene von den umgebenden Muskeln zu trennen, und eine 25-Gauge-Nadel durch die scalene Mus einfügenCLE, die senkrecht zu den Muskelfasern.
    1. Eine Führung in die Spitze der Nadel einlegen und dann die Nadel herausziehen des Muskels, hinter dem in der Isolation des Drahtes in den Muskel eingesetzt up Blei verlassen (Abbildung 1 J und K). Nehmen Sie die farbigen Leitungen in den Muskel eingeführt werden.
  10. Legen Sie einen kleinen Tropfen Cyanacrylat - Klebstoffs auf das freiliegende Ende des Drahtes, in der Nähe des Muskel , wo die Führung eingesetzt ist, und schiebt schnell die Führung Kappe über den Draht so , dass kein Draht zwischen der Leiterkappe und dem Muskel (2A ausgesetzt ist , und B).
    Hinweis: Obwohl es eine akzeptierte Praxis ist EMG zu sichern führt mit Cyanoacrylat 17, 18, ein alternatives Verfahren ist die Führungskappe an ihrem Platz zu sichern , indem eine Seidennaht Knoten um sie zu binden.
  11. Schneiden Sie die überschüssigen Draht distal die Kappe und einen Tropfen Cyanacrylat-Klebstoff auf das Ende der Leitungskappe / Drahtes. Geben Sie den KleberZeit zu polymerisieren , bevor die Freigabe (2C und D).
  12. Folgen die gleichen Schritte (Schritte 3.10-3.12) die entgegengesetzte Polarität Führung parallel zur ersten in der gleichen Muskel einzuführen, 1 - 2 mm weg von der ersten Leitung.
  13. Wiederholen Sie die Schritte 3,10-3,12 führt in die Trapezius einzufügen, befand vordere gerade zum scalene Muskel (Figur 1L und M).
  14. Stellen Sie sicher, dass die Drahtleitungen an Ort und Stelle befestigt sind, und dass es nur genügend Spielraum in den Zuleitungen für die Tierkörperbewegungen auszuführen, ohne auf den Leitungen zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass jede Überlänge der Leitung drücken nicht gegen die Haut, da dies zu Reizungen führen können, die das Tier zu veranlassen können Kratzer oder die Leitungen herausziehen. Positionieren Sie die Leitungen, falls erforderlich, um mögliche Beschwerden zu verhindern.
  15. Vorsichtig das Band entfernen Sie die forelimb gedrückt gehalten wird. Ziehen Sie die Fettpolster wieder über den Muskel und es verwenden, die eingelegten Leitungen abzudecken. Schließen Sie den Schnitt mit Cyanoacrylatklebstoffs durch Neckendie Hautlappen wieder zusammen, so daß die Schnittlinien auf. Pinch einen Teil der Hautlappen mit der gebogenen Pinzette und anzuwenden entlang dieser Linie eine kleine Linie von Cyanoacrylat-Klebstoff.
  16. Injizieren 0,1 ml Carprofen subkutan postoperative Schmerzen zu lindern, während das Tier noch unter Narkose ist.
    HINWEIS: Weiter 0,1 ml Carprofen für 1 einmal täglich zu verabreichen - 2 Tage nach der Operation, und dann nach, dass je nach Bedarf.
  17. Entfernen Sie das Tier aus der nosecone und legen Sie sich in einen sauberen Käfig im vorgewärmten Inkubator, bis das Tier wach ist und freiwillig um den Käfig zu bewegen. Halten Sie das Tier in den Inkubator für danach mindestens 15 Minuten, die Überwachung seiner Bewegungen und Wachsamkeit.

4. Nachsorge

  1. Haustiere nach der Operation getrennt. Geben Sie Tiere mit einer Diät Gel und einer Wasserflasche zu heilen.
  2. Überwachen Sie das Tier für die ersten 30 min nach der Operation. Schauen Sie auf das Tier mindestens jede Stunde foder 5 Stunden nach der Operation. In den Tagen nach der Operation überprüft zweimal täglich mindestens.
  3. Achten Sie auf Nekrose, Infektion entlang des Einschnitts und in der Körperhöhle , das Implantat enthält (dh Wärme, Schwellung und Rötung) und Serombildung.
    HINWEIS: Diese Zeichen innerhalb der ersten Woche nach der Operation auftreten. Ein gesundes Tier geheilt ein Monat nach der Operation ist in Abbildung 1 N gezeigt. Obwohl EMG-Aufnahmen können sofort nach der Implantation durchgeführt werden, werden die Tiere mindestens eine Woche vor der Aufnahme gegeben EMG und Plethysmographie zu heilen, wie EKG-Signale hoher unmittelbar nach der Implantation sein kann.

5. Der Erwerb Gleichzeitige Elektromyographie und Plethysmographie Signale

  1. Schalten Sie alle Erfassungsgeräte, einschließlich Bias-Flow.
    HINWEIS: Die Flussrate für Mäuse wird typischerweise bei 1,0 l / min eingestellt.
  2. Kalibrieren des Plethysmographie Kammer (n) unter Verwendung eines Durchflussmessers.
    HINWEIS: Prüfen Sie regelmäßig die Plethysmographie chambers, um sicherzustellen, dass die Dichtungen nicht rissig oder gebrochen ist. Coat die Gummidichtungen mit einem Schmiermittel, wie beispielsweise Vakuumfett einmal pro Woche ihren guten Zustand zu halten.
  3. Eingang Transmitterkalibration, wie vom Hersteller angegeben.
  4. Platzieren Sie die Maus in der Plethysmographie Kammer für mindestens 1 h, es zu akklimatisieren, bevor EMG und Plethysmographie an der Aufnahme. Verwendung von mehreren Kammern ist es möglich, von einer Maus zu erfassen, während die nächste Maus wird in einer zweiten Kammer akklimatisieren. Schalten Sie nicht auf den Sender während der Eingewöhnungszeit , um die Batterieleistung (Abbildung 1O) zu erhalten.
  5. Vor der Aufzeichnung (aber nach der Kalibrierung), schalen die Sender durch einen starken Magneten auf 1 in dem implantierten Tiere platziert; ein rotes Licht auf der Vorderseite des Empfängers zeigt an, wenn der Sender eingeschaltet ist.
  6. Beginnen Erwerb mit dem Pull-Down-Menü mit der Bezeichnung „Acquisition“ und wählen Sie „Acquisition starten.“ Obwohl die Aufzeichnungsdauer kannändern sich je nach Experiment dauert ein typisches Plethysmographie und EMG-Aufzeichnung von 1 bis 3 h.
    HINWEIS: Der Sender hat eine intrinsische Abtastrate von 240 Hz. Eine schnellere Rate von 500 Hz wird in der Software eingestellt zwischen Punkten zu interpolieren und eine glattere Wellenform zu liefern. Das Tiefpassfilter (der dazu dient, als ein Anti-Alias-Filter) und das Hochpassfilter in dem Implantat geben die 1- bis 50-Hz-Bandbreite für diese Telemetrieeinrichtung. 60 Hz-A / C-Interferenz trägt nicht zur überschüssigen Rauschen im Signal EMG, weil die Implantate batteriebetrieben und das Tier schirmt das Implantat und führt von elektrischen Feldern sind. Plethysmographie, EMG und Video werden in Echtzeit über Erfassungs - Software automatisch synchronisiert.
  7. Wenn Akquisition abgeschlossen ist, schalten Sie den Sender mit einem Magneten und entfernen Sie das Tier aus der Kammer aus.
  8. Wenn eine weitere Aufnahme starten, Reinigen Sie die Kammer, in den neuen Sender Kalibrierungen aus dem nächsten Tier geben, und die zweite Aufnahme beginnen. wenn finished mit Erwerb für den Tag, schalten Sie den Sender, reinigen Sie die Plethysmographie Kammer, und schalten Sie alle Erfassungsgeräte und die Bias-Flow aus.

figure-protocol-1
Abbildung 1. Implantierung von Telemetrieeinrichtung zum Messen der Atemmuskulatur EMG. (A) Telemetriesender mit zwei Paaren von Biopotential führt EMG zu messen. Leitungen können auf die gewünschte Länge zugeschnitten werden (unten) oder aufgerollt und unter den Sendern (oben) versteckt. (B) Sender führt. (B‘) führt mit getrimmten-off Kunststoff - Isolierung um die Drähte freizulegen , und zu Bleikappen (kleines Bild) zu machen. (B ‚‘) führt mit Drähten 4 gereckt - ihre ursprüngliche Länge 5x. Leads sollte beschnitten werden, so dass sie 0,5 cm lang sind (nicht dargestellt). (C) Maus bereit für die Operation, mit der rasierten Operationsstelle und richtigforepaw positioniert. Die rote gepunktete Linie zeigt die Inzisionsstelle. (D) Oberflächliche unterhalb dem Fettpolster angeordnet Muskeln und Faszien, nach dem ersten Schnitt gesehen. T = trapezius. S = sternocleidomastoid. P = platysma. Gelber Pfeil = Zwerchfellnervs. (E) Cartoon Diagramm der Muskeln und des Zwerchfellnervs in (D) gezeigt. Pinzetten sollte die trapezius und Platysma Muskeln auseinander spreizen verwendet werden, um die tiefere scalenus zu erreichen, in (F) gezeigt, und (G). (F) Wahrzeichen verwendet , um die Position des scalene und der Trapezius zu identifizieren. Dieses Bild zeigt den A. subclavia (weißer Pfeil), den Zwerchfellnerv / Plexus brachialis (schwarzer Pfeil), und den blassen Kopfnickers (gelber Pfeil). (G) Cartoon Darstellung der Position der tieferen Muskeln (dh mittlere scalene, scalene anterioren und SCM), Arteria subclavia, und Zwerchfellnervs. Der posteriore scalene ist nicht sichtbar. Diese können nur erreicht werden, wenn die superficial Muskeln (in D und E) auseinander gespreizt. (H) eine Tasche für den Sender Herstellung der stumpfen Spitze-Schere. (I) Eingefügt Sender in der subkutanen Tasche mit den parallel liegenden Leitungen von der Tasche entstehen. (J) Die Insertion der 25-Gauge - Nadel in die scalene, die senkrecht zu den Muskelfasern, einen Tunnel für den Draht führen zu machen. (K) Die beiden Leitungen in den scalene Muskel eingesetzt. Blei Kappen sind an dem Ende und verleimt einrastet positioniert. (L) Insertion der 25-Gauge - Nadel in die Trapezius, die senkrecht zu den Muskelfasern, einen Tunnel für den Draht führen zu machen. (M) Alle vier Leitungen in die Trapezius und scaleni eingesetzt und flach vor der Inzision auf die Schließung liegt. (N) vollständig erholt Maus, mit dem Sender positioniert subkutan auf dem Rücken. (O) gleichzeitiges Aufzeichnen Plethysmographie, Muskel - EMG - Aktivität, einnd eine Video-Plethysmographie Kammer (gelber Pfeil), Telemetrie- Auffangkissen (roter Pfeil) und Kamera (schwarzer Pfeil) verwendet wird. Ein Multifunktions - Biasstrom wird über einen Kunststoffschlauch (blauer Pfeil) an die Plethysmographie Kammer verbunden ist Sauerstoff an die Maus zu liefern. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Die Sicherung Blei Caps mit Cyanacrylatkleber. (A) Tragen Sie einen kleinen Tropfen Cyanacrylat (lila Kreis) auf den freiliegenden Draht der Elektrodenleitung (E) Draht proximal zu dem Muskel. (B) schnell die vorbereitete Leiterkappe (LC) auf den freiliegenden Draht über den Cyanoacrylat - Klebstoff gleitet , so dass die Leitungskappe auf den Muskel direkt benachbart positioniert ist. (CTrim off) einen kleinen Teil des distalen Endes der Zuleitungsdrahtkappe und so, daß es keine freiliegenden Elektrode vorhanden ist, die nicht mit Kunststoff isoliert ist. (D) die Anwendung eines kleinen Tropfen Cyanacrylatklebstoff auf das Ende der Leitung Kappe. Entfernen Sie die getrimmte-off distalen Ende der Leitung Kappe vom Tier. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

6. Analyse von ARM EMG und Plethysmographie

  1. Öffnen Sie die Analysesoftware und überprüfen Sie die Datei von Interesse (gehen Sie auf „Datei“ und wählen Sie „Öffnen Überprüfung Datei“). Filtern Sie die EMG-Signale über eine 30-Hz-Hochpassfilter mit der rechten Maustaste auf das EMG-Trace verwenden, wählen Sie „Analysieren Attribute“, Hervorhebung der „Advanced Attribute 1“ Register und das Ändern des Hochpassfilters auf 30 Hz.
    HINWEIS: Dieser Filterschritt entfernt nicht-diskriminieren niederfrequente Information.
  2. Sie liegen Bereiche der Maus Inaktivität durch visuelle Inspektion auf der Grundlage des Mangel an Bewegung in der synchronisierten Videodatei und der Mangel an großen, unregelmäßigen Druckänderungen aufgrund der Bewegung in der Plethysmographie trace (rotes Feld in 3A); Inaktivität tritt auf, wenn die Maus schläft oder wach ist, aber immer noch.
  3. Identifizieren EMG Kämpfe unabhängig für jeden Muskel.
    1. Zu und integrieren das gefilterte Signal EMG über 30 ms (Abbildung 4).
      Hinweis: Da Mäuse mit einer Rate von 3 Hz atmen, jeder Atemzug um etwa 11 integrierte Werte repräsentiert wird.
    2. Bestimmen Sie die Basislinie EMG - Amplitude durch die gleichgerichtete und integrierte Werte gemittelt mit dem EMG - Signal zugeordnet ist, um eine Zeitdauer von 3 s , wenn die Maus nicht aktiv ist und die Plethysmographie Spur zeigt eupnea (normale Atmung) (Abbildung 4).
    3. Identifizieren „Anfälle“ Aktivitäts definiert durch mindestens 3 aufeinanderfolgende gleichgerichtet und integrierte Werte, die mindestens ein 5 sind0% Erhöhung über der Basislinie EMG Signals (ermittelt in Schritt 6.3.2).
      HINWEIS: Drei aufeinanderfolgende Werte stellen ein 90-ms-Fenster, aber einige Kämpfe werden mehr als 3 Werte über dem Schwellenwert enthalten und werden länger dauern als 90 ms.
    4. Verwenden des synchronisierten Video- und Plethysmographie trace Anfällen auszuschließen , die während Sighs (3B) auftreten; Schnüffeln (3C); oder willentliche Mausbewegungen, wie beispielsweise Drehen des Kopfes oder Pflege.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 6.3.1 - 6.3.4 für den zweiten Muskel.
  4. Berechnen Sie die Bout Frequenz für jeden Muskel. Nehmen Sie a) die Anfangszeit und Endzeit jeder inaktiven Periode und b) die Zeit jede Runde der oben genannten Kriterien aufgetreten verwenden. Summe den Gesamt inaktive Zeit. Teilen Sie die Gesamtzahl der Kämpfe durch die Gesamt min inaktive Zeit über den Verlauf der Aufnahmesession den Kampf Frequenz zu berechnen.
  5. Festzustellen, ob Änderungen in der Belüftung mit der Aktivierung des aufgenommenen m zugeordnet sind,uscles.
    1. Die Atmungsparameter auswählen (zB Spitzeninspirationsfluss, Atemvolumen, Minutenvolumen und Atemzüge pro Minute) gemessen werden.
      HINWEIS: Alle möglichen Optionen können in dem P3-Setup-Pulldown-Menü zu finden unter „Abgeleitete Parametern.“
    2. Identifizieren der Atemzüge , die während der EMG Bout Aktivität und die Atemzüge auftreten , die während der EMG Grundaktivität (Abbildung 4) auftreten.
    3. Erstellen Parser Segmente Spanning Plethysmographie Atemzüge, die mit EMG Kampf Aktivität assoziiert sind und erstellen unabhängige Parser Segmente, die mit Baseline-EMG-Aktivität assoziiert sind. Achten Sie auf die Art der Analyse setzen „Parser Seg.“
      HINWEIS: Diese Auswahl wird in dem P3-Setup-Pulldown-Menü unter gefunden "Data Reduction Setup".
    4. Markieren Sie den Anfang jedes Parser-Segment mit einem Ereignis mit der rechten Maustaste auf die Plethysmographie Spur. Geben Sie einen Kampf Parser Segmente als „Ereignis 1“ in dem Dropdown-Menü und specify die Baseline-Parser Segmente als „Ereignis 2“ die beiden Klassen von Segmenten zu unterscheiden.
    5. Unter dem Menü „Funktionen“, speichern Sie die „Marks Section“ und „Marks Abgeleitete Daten.“ Unter dem Menü Daten Parser, speichern Sie die „Analysierte Bewertung Datei“ und „Analysiert Abgeleitete Daten.“
      HINWEIS: Die ausgewählten Atmungsparameter für jeden einzelnen Atemzug in der Marks Abgeleitet Datenblatt in der Registerkarte mit der Bezeichnung gefunden „Derivations.“
    6. Vergleichen der Atmungsparameter für Atemzüge, die während der ARM Anfällen (markiert als Ereignis 1) gegenüber der Atemzüge auftreten, die während der Grundlinienaktivität (markiert als Ereignis 2) auftreten, um zu bestimmen, ob die Muskelaktivität mit Veränderungen in der Ventilation verbunden ist.

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Ergebnisse

Das beschriebene Protokoll wurde verwendet, um eine Telemetrieeinrichtung zu implantieren und scalene Trapezius und EMG, WBP und Video einer SOD1 (G93A) als Maus-Modell zu erfassen. Perioden , in denen das Tier ist inaktiv waren ( zum Beispiel bewegt sich nicht) identifizieren die Videoaufzeichnung verwendet und durch die fehlende bewegungsbezogenen Aktivität in der WBP trace (3A) bestätigt. Inaktive Perioden umfassen verbrachte Zeit in REM oder nicht-REM - Schl...

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Diskussion

Das Verfahren hier gezeigt, ermöglicht die nicht-invasive (nach dem anfänglichen chirurgischer Implantation des Senders) Messung der Atmungsmuskelaktivität und Belüftung über viele Monate im gleichen Tiere. Diese Technik hat mehrere Vorteile gegenüber Standard-EMG-Techniken bei narkotisierten Mäusen: 1) die Versuche weniger Mäuse benötigen und bieten die Möglichkeit, Daten aus dem gleichen Ort in einer einzigen Maus über Krankheitsstadien aufzeichnen (statt mehrere Mäuse bei verschiedenen Krankheitsstadien verwendet wir...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Unterstützung für diese Arbeit wurde von einem Cincinnati Kindern Hospital Medical Center Treuhänder Award SAC und einer NIH Ausbildungsbeihilfe (T32NS007453) zu VNJ bereitgestellt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
B6.Cg-TG (SOD1*G93A)1 Gur/JJackson Laboratory4435
Plethysmographie-KammerBuxco Respiratory Products/ Data Sciences International601-1425-001
Telemetrie-Empfänger (Modell RPC-1)Data Sciences International272-6001-001
Bias-Durchflusspumpe (Modell BFL0500)Data Sciences International601-2201-001
ACQ-7000 USBData Sciences InternationalPNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange MatrixData Sciences International271-0117-001
Neu Ponemah Analysis SystemData Sciences InternationalPNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acqusition software v5.20Data Sciences InternationalPNM-P3P-520
Ponemah uneingeschränktes Plethysmographie-Analysepaket für den ganzen Atem v5.20Data Sciences InternationalPNM-URP100W
konfiguriert Ponemah Software System DataSciences InternationalPNM-P3P-CFG
Analysis Module (URP)Data Sciences InternationalPNM-URP100W
Universal AmplifierData Sciences International13-7715-59
Sync BoardData Sciences International271-0401-001
Sync CableData Sciences International274-0030-001
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