Method Article

Gleichzeitige Isolierung von hochwertigen Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten aus einem erwachsenen Rattenherz

DOI:

10.3791/55601

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May 19th, 2017

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1Internal Medicine, Cardiology and Angiology, University Hospital Giessen

In This Article

Summary

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Mehrere Protokolle wurden entwickelt und beschrieben für die Isolierung von verschiedenen Herzzelltypen von einem Rattenherz. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht, wodurch die experimentellen Kosten reduziert werden.

Abstract

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Die Ratte ist ein wichtiges Tiermodell, das in der Herz-Kreislauf-Forschung verwendet wird, und Ratten-Herzzellen werden routinemäßig zur in-vitro- Analyse der molekularen Mechanismen der kardiovaskulären Erkrankung wie Herzhypertrophie, Fibrose und Atherosklerose verwendet. Obwohl mehrere Versuche mit variablem Erfolg gemacht wurden, um immortalisierte Zelllinien aus dem kardiovaskulären System zu entwickeln, um diese zellulären Mechanismen zu verstehen, bieten primäre Zellen eine natürliche und nahe an in vivo Umgebung für solche Studien. Daher haben verschiedene Laboratorien, die an einem bestimmten Zelltyp arbeiten, Protokolle entwickelt, um einzelne Arten von Ratten-Herzzellen von Interesse zu isolieren. Ein Protokoll, das die Isolierung von mehr als einem Zelltyp erlaubt, fehlt jedoch. Hier wird ein optimiertes Protokoll beschrieben, das die Isolierung von hochwertigen Hauptkardiometertypen (Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten) aus einer einzigen Präparation ermöglicht und es ermöglichtEinsatz für zelluläre Analysen. Dies ermöglicht eine effizienteste Nutzung der verfügbaren Ressourcen, die Zeit sparen und die Forschungskosten senken können.

Introduction

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Nagetiermodelle werden seit langem als Werkzeuge verwendet, um unser Verständnis der Herz-Kreislauf-Physiologie in Gesundheit und Krankheit zu erweitern. 1 Obwohl diese Tiermodelle es uns erlauben, die Pathophysiologie einer Erkrankung auf organischer Ebene zu verstehen und die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik verschiedener pharmakologischer Mittel zur Behandlung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, des Verständnisses der molekularen Mechanismen der Entwicklung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen und des Beitrags eines bestimmten zu analysieren Zelltyp erfordert die Verwendung von in vitro Zellkulturmodellen. Zu diesem Zweck wurden verschi....

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Protocol

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Die Untersuchung entspricht dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, veröffentlicht von den US National Institutes of Health (NIH Publikation Nr. 85-23 1985) und wurde vom örtlichen Ethikkomitee der Universität Giessen genehmigt. Erwachsene männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 200 - 250 g wurden in dieser Studie verwendet.

1. Autoklavieren

  1. Mindestens einen Tag vor der Durchführung des Verfahrens müssen alle chirurgischen Instrumente, Pipettenspitzen und Pasteurpipetten im Isolationsverfahren bei 121 ° C für 30 min autoklaviert werden.

2. Vorbereitung von Medien und L....

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Results

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Das Isolationsverfahren führt zu einer Ausbeute von 70 - 80% lebensfähigen, stabförmigen, gestreiften Kardiomyozyten ( Abb. 2A und 2C ), die für geplante Experimente verwendet werden können. In unserem Labor werden Kardiomyozyten routinemäßig zur Analyse der Ca 2+ -Signalisierung verwendet. 5A zeigt intrazelluläre Calcium [Ca 2+ ] i- Oszillationen als Reaktion auf Ischämie / Reperfusion in Kardio.......

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Discussion

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In diesem Artikel wird ein reproduzierbares Protokoll für die Isolierung und Kultur von Herz-Myozyten, Endothelzellen und Fibroblasten beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige und qualitativ hochwertige Isolierung der wichtigsten Zelltypen von Herzgewebe, dh Kardiomyozyten, Endothelzellen und Fibroblasten im Gegensatz zu nur einem Zelltyp. Ein kritischer Schritt in der Isolation ist die richtige Verdauung des Herzgewebes. Wenn die Verdauung unvollständig ist, kann noch eine große Anzahl von My.......

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Disclosures

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Autoren haben nichts zu erklären.

Acknowledgements

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Die technische Unterstützung von L. Rinaldi, S. Schäffer, D. Reitz, H. Thomas und A. Weber ist dankbar anerkannt. Die Autoren danken auch Dr. E. Martinson für umfangreiche Korrekturlesen und Sprachbearbeitung des Manuskripts. Die Studie wurde von der Universität Giessen Anschubsfinanzierung für M. Aslam und D. Gündüz unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-vWFSanta Cruz Biotech.SC-14014
CalciumchloridMerck102378
CarnitinSigma-AldrichC0283
Kollagenase Typ IIWorthingtonLS004176
CreatinSigma-AldrichC0780
D-GlucoseMerck108342
Dil-Ac-LDLThermo ScientificL3484
EDTA-Lösung (0,2 m)Biochrome AGL2113
EinbettlösungCitiflourAF1-25
Endothelzellmedium MV2PromoCellC-22022
Fötales Kälberserum (FCS)Biochrome AGS0615
GentamicinServa Chemicals47991
HEPESSigma-AldrichH0887
IsofluranAbbottTU 061219
Laminin Roche/Sigma11243217001
M199 MediumThermo Scientific11150059
M199 Medium (Pulver)Biochrome AGT061
MagnesiumsulfatSigma-Aldrich63138
Maus Anti-Ratte CD31 Antikörper (TLD-3A12)Thermo ScientificMA1-81051
NaCl Lösung (0,9%), sterilB. Braun
Pan Maus IgG-Kügelchen (Dynabeads)Thermo Scientific11041
Paraformaldehyd (PFA) 4% LösungSanta Cruz Biotech.sc-281692
Penicillin-StreptomycinThermo Scientific15070-063
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) 1x PAN-BiotechP04-36500
Kunststoff-VerbrauchsmaterialienGreiner Bio-One
KaliumchloridMerck4933
KaliumdihydrogenphosphatMerck7873
NatriumchloridMerck6404
Natronlauge (2 N)Merck109136
steril FiltersystemThermo Scientific5660020
TaurinSigma-AldrichT8691
TO-PROThermo ScientificT3605
Trypsin-EDTA Lösung (10x)Sigma-AldrichT4174
Wasser, sterilB. Braun
30820080

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaragoza, C., et al. Animal models of cardiovascular diseases. J Biomed Biotechnol. 2011, 497841(2011).
  2. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristic....

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