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Methodenartikel

Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen

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DOI:

10.3791/55605

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5. Juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dietetics and Nutrition, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Nutrition, Food and Exercise Sciences, Florida State University, 3Center for Advancing Exercise and Nutrition Research on Aging (CAENRA), Florida State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von Polyphenol-reichen Extrakten aus gefriergetrockneten Beerenpulver. Darüber hinaus gibt es eine gründliche Beschreibung der Verwendung dieser Polyphenol-reichen Extrakte in der Zellkultur in Gegenwart des Peptidhormons Angiotensin II (Ang II) unter Verwendung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs).

Zusammenfassung

Epidemiologische Studien zeigen, dass eine erhöhte Flavonoidaufnahme mit einer verminderten Mortalität aufgrund von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) in den USA (USA) und Europa korreliert. Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben einen hohen Polyphenolgehalt. Es wurde gezeigt, dass Polyphenole mit vielen molekularen Targets in Wechselwirkung treten und zahlreiche positive biologische Funktionen ausüben, darunter antioxidative, entzündungshemmende und kardioprotektive Effekte. Polyphenole, die aus Brombeeren (BL), Himbeere (RB) und schwarzer Himbeere (BRB) isoliert wurden, reduzieren den oxidativen Stress und die zelluläre Seneszenz als Reaktion auf Angiotensin II (Ang II). Diese Arbeit liefert eine detaillierte Beschreibung des Protokolls zur Herstellung der Polyphenolextrakte aus gefriergetrockneten Beeren. Polyphenol-Extraktionen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver wurden unter Verwendung von 80% igem wässrigem Ethanol und einem Ultraschall-unterstützten Extraktionsverfahren durchgeführt. Der Rohextrakt wurde weiter gereinigt und mit Chloroform und Ethylacetat fraktioniert,beziehungsweise. Die Effekte von sowohl rohen als auch gereinigten Extrakten wurden an vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in Kultur getestet.

Einleitung

Polyphenole sind Verbindungen, die mindestens einen phenolischen Ring in ihrer Struktur enthalten und im Pflanzenreich reichlich vorhanden sind. Menschen verbrauchen Pflanzen seit Jahrtausenden für medizinische Zwecke, ohne sich der Existenz solcher Verbindungen bewusst zu sein 2 . Viele Früchte und Gemüse haben einige geteilte polyphenolische Verbindungen, wenn auch mit unterschiedlichen Mengen, einschließlich Flavonoide, Stilbene und Phenolsäuren 3 . Obwohl Polyphenole oft mit bunten Früchten und Gemüse verbunden sind, ist dies nicht strikt wahr. Zum Beispiel sind Zeaxanthin und Xanthin in Gemüse, die nicht sehr bunt sind, wie Zwiebeln und Knoblauch, die aus der Familie der Schalotten sind und sind mit zahlreichen gesundheitlichen Vorteile verbunden 4 vorhanden . Abgesehen davon, dass sie mit mehreren gesundheitlichen Vorteilen verbunden sind, dienen Polyphenole auch Pflanzen, indem sie sie vor Insekten schützenD Ultraviolettstrahlung 2 . Polyphenole werden häufig in der menschlichen Ernährung gefunden und gelten als leistungsstarke Antioxidantien, da sie reaktive Sauerstoffspezies (ROS) 6 , 7 , 8 fangen können. Sie haben auch entzündungshemmende 9 , antimikrobielle 10 , antihypertensive 11 und anti-karzinogene 12 , 13 Eigenschaften.

Epidemiologische Studien zeigen eine umgekehrte Assoziation zwischen dem Verzehr von Flavonoiden und Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) Inzidenz 16 , 17 und Mortalität 14 , 15 . Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben hohe Mengen an Polyphenolen, einschließlich Flavonoide. Zum Beispiel, Verbrauch von Brombeere (BL) Saft (300 ML / d) für acht Wochen signifikant den systolischen Blutdruck bei dyslipidämischen Patienten verringert 18 . Jeong et al. 19 berichteten, dass vorhypertensive Männer und Frauen, die 2,5 g schwarze Himbeere (BRB) Extrakt pro Tag verbrauchen, einen niedrigeren 24-Stunden- und Nacht-Blutdruck im Vergleich zu denen hatten, die ein Placebo verbrauchten. Himbeeren (RB) verringerten den Blutdruck bei gleichzeitiger Erhöhung der Expression von Superoxid-Dismutase (SOD) bei spontan hypertensiven Ratten 20 . Es wurde kürzlich gezeigt, dass BL, RB und BRB die Niveaus von ROS und Seneszenz reduzieren, die durch Angiotensin II (Ang II) in vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) induziert werden. Darüber hinaus reduzierte die Anthocyaninfraktion aus BL-Extrakt die Expression der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) und hemmte die Aktivität von Nuklearfaktor kappa B (NF- & kgr; B) und extrazellulärer signalregulierter Kinase (ERK) in Lipopolysaccharid (LPS) -stimuliert J774-ZellenAss = "xref"> 22 BRB-Extrakte verringerten die NF-κB-Aktivierung und die Cyclooxygenase 2 (COX-2) -Expression in vitro 23 , verbesserten das Lipidprofil und verhinderten die Bildung von Atherosklerose-Läsionen bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät versorgt wurden. Anthocyanine, die als die häufigsten Flavonoide in Beeren angesehen werden, modulieren die Entzündungsreaktion in LPS-stimulierten RAW 264.7-Makrophagen durch Verringerung der Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) -Produktion 25 und verringern die Proliferation und Migration von VSMCs 26 .

Da es zunehmendes Interesse am Verständnis der Rolle der Polyphenole in der menschlichen Gesundheit und Krankheit gibt, ist es wichtig, die Extraktionsmethode zu optimieren. Die Lösemittel-Extraktion wird hierfür weit verbreitet, da sie kostengünstig und leicht reproduzierbar ist. In dieser Studie wurde eine Lösungsmittelextraktion mit Ethanol, zusammen mit einem Ultraschall-unterstützten Extrakt, verwendetN-Methode, die von Kim und Lee 27 angepasst wurde. Die Reinigung und Fraktionierung von Rohextrakten (CE) unter Verwendung von Chloroform und Ethylacetat wurde durchgeführt, um die gereinigte Extrakt (PE) -Fraktion zu erhalten, die von Queires et al. 28 angepasst wurde. Weiterhin wurde die Wirksamkeit von rohen versus gereinigten Polyphenol-Extrakten aus BL bei der Verringerung der basalen Phosphorylierung von ERK1 / 2 verglichen und repräsentative Beispiele für die hemmende Wirkung von gereinigtem BL-Polyphenol-Extrakt auf Ang-II-induzierte Signalisierungsreduktionen in VSMCs wurden bereitgestellt.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

  1. Bereiten Sie 80% Ethanol (100 ml) vor, indem Sie 80 ml absolutem Ethanol (Molekularbiologie-Klasse) und 20 ml Zellkultur-sterilem Wasser mischen.
  2. Zur Herstellung von Polyphenol-Extrakt (10 mg / ml) wiegen 10 mg CE oder PE. Füge 1 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) unter einer Zellkultur Kapuze hinzu. Vortex die Lösung. Aliquot in 200-μL-Portionen und bei -20 ° C aufbewahren.
  3. Lysepuffer vorbereiten
    1. Fügen Sie 5 ml 1 M HEPES-Stammlösung (pH 7,4, 50 mM endgültig), 1 ml 5 M NaCl-Stammlösung (50 mM endgültig), 1 ml 0,5 M EDTA-Stammlösung (5 mM endgültig), 2 ml 0,5, hinzu M NaF-Stammlösung (10 mM endgültig), 286 μl 700 mM Na 3 VO 4 Stammlösung (2 mM endgültig), 5 mL 200 mM Na 4 P 2 O 7 Stammlösung (10 mM endgültig) und 5 mL 20% Triton-X-100 Stammlösung in Wasser (1% endgültig) hergestellt. Füge Wasser hinzu, um ein Volumen von 100 ml zu erreichen. Bei 4 ° C aufbewahren.
    2. 10 μl / ml Protease-Inhibitor-Cocktail zugeben. Fügen Sie frisch hinzu, wenn die Zellen zur Lyse bereit sind.
  4. Bereiten Sie Laemmli Probenpuffer (4x) vor.
    1. Füge 31,25 ml 2 M Tris-Stammlösung (pH 6,8), 100 ml Glycerin, 50 ml einer in Wasser hergestellten 20% igen Natriumdodecylsulfat (SDS) -Lösung und 50 ml β-Mercaptoethanol zu. Füge Wasser bis zu 250 ml hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren.
  5. Zur Herstellung von Tris-gepufferten Saline (TBS) -Puffer, wiegen Sie 3 g Tris (25 mM endgültig), 0,18 g KCl (2,5 mM endgültig) und 8,76 g NaCl (150 mM endgültig). Den pH-Wert auf 7,4 einstellen und bis zu 1 L Wasser auffüllen. Bei RT halten.
  6. Zur Herstellung von TBS-T werden 997,5 ml TBS und 2,5 ml einer 20% igen Triton-X-100-Lösung in Wasser zugesetzt. Bei RT halten

2. Vorbereitung von Blackerry-Extrakten

  1. Herstellung von Rohextrakt aus gefriergetrocknetem Beerenpulver.
    1. 10 g gefriergetrocknetes Brombeerpulver (oder 5 g frisches Pulver) wiegen. Wenn gefrorene Früchte verwendet werden, schneide es iNto sehr kleine Stücke vor Beginn der Extraktion.
    2. Mischen Sie das Fruchtpulver mit 100 ml 80% igem wässrigem Ethanol in einem 1 l Rundboden-Erlenmeyerkolben.
    3. Sonde die Mischung für 20 min bei 42 kHz, 135 W mit einem Ultraschallbad bei 25 ° C, ohne jegliches Zeitintervall dazwischen. Führen Sie die Beschallung mit kontinuierlicher Stickstoffspülung in gedämpftem Licht durch. Bei gefrorenen Früchten die Inkubationszeit auf 4 h erhöhen.
    4. Filtriere die Mischung durch ein # 2 Filterpapier unter Verwendung eines gekühlten Buchner-Trichters mit Vakuumsaugung.
      HINWEIS: Am Ende dieses Schrittes erscheinen Reste der Probe auf dem Filterpapier; Das heißt Filterkuchen.
    5. Spülen Sie den Filterkuchen mit 50 ml 100% igem Ethanol ab. Das Filtrat abspülen und den Filterkuchen in einen 1 l Rundkolben geben, der 100 ml 80% iges wässriges Ethanol enthält.
    6. Wiederholen Sie den Extraktionsvorgang für den Rückstand (Schritte 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Kombinieren Sie die beiden Filtrate in einen Rundkolben mit zusätzlichen 50 mlVon 80% igem wässrigem Ethanol.
      HINWEIS: Das Endvolumen sollte ca. 300 ml betragen.
    8. Verwenden Sie einen Rotationsverdampfer bei 62 ° C und 50 U / min, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Setzen Sie diesen Vorgang fort, bis der Ethanol nicht mehr verdunstet.
      HINWEIS: Dieser Vorgang dauert ca. 45 min.
    9. Übertragen Sie die Probe auf ein 50 ml konisches Rohr. Verdampfen des Ethanols durch Einspritzen von Stickstoffgas an der Oberseite des Röhrchens für 10 min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um die vollständige Verdunstung des Ethanols zu gewährleisten. Das Volumen der Probe beträgt bei diesem Schritt etwa 20 ml.
    10. Einfrieren der Probe bei -80 ° C für mindestens 24 h.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, um einen effizienteren Gefriertrocknungsprozess zu ermöglichen.
    11. Gefriertrocknen Sie die Probe bei -50 ° C für ca. 8 h. Die Proben bei -20 ° C aufbewahren.
      HINWEIS: Der Gefriertrockner schafft ein kraftvolles Vakuum bei -50 ° C in der Kammer, um die Proben zu trocknen, aber bewahrt die meisten Verbindungen, wie PolypheNols
  2. Herstellung von gereinigten Polyphenol-Extrakten aus Rohextrakten.
    1. Wiegen der gefriergetrockneten extrahierten Proben.
      HINWEIS: Das Volumen des Extraktes bei diesem Schritt beträgt ca. 10 ml.
    2. Füge dem Rohextrakt zwei Volumina (~ 20 ml) Chloroform zu und schüttele die Lösung 5 min in einer Rührplatte.
    3. Gießen Sie die Mischung in einen Trenntrichter. Man ließ den Rohextrakt 1 h bei RT dekantieren, um die gereinigte Fraktion zu erhalten.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt bildet sich eine zweiphasige Mischung.
    4. Die untere Schicht (Chloroformphase) aus dem Scheidetrichter verwerfen und die wässrige Schicht in einen sauberen Becher geben.
    5. Zugabe von zwei Volumina Ethylacetat zu der wässrigen Fraktion und Verwendung eines Magnetrührers, um das Gemisch 5 min bei RT zu rühren.
    6. Filterung der Mischung durch # 2 Filterpapier unter Verwendung eines gekühlten Buchner-Trichters mit Vakuumsaugung.
    7. Sammeln Sie die gefilterte Probe und übertragen Sie sie zu einem Rundkolben, um uns zu seinMit dem Rotationsverdampfer.
    8. Den Rotationsverdampfer auf 62 ° C und 50 U / min stellen und das Ethylacetat ca. 30 min verdampfen.
    9. Gefriertrocknen Sie die Probe bei -50 ° C für ca. 8 h. Übertragen Sie die Probe auf ein 50 mL konisches Rohr und bewahren Sie es bei -20 ° C auf.

3. Behandlung von VSMCs mit Beerenextrakten

  1. VSMCs Kultur.
    1. Isoliere VSMCs aus den Thorax-Aorta von Sprague-Dawley-Ratten durch die Durchführung einer enzymatischen Verdauung, wie zuvor beschrieben 29 . Kultur die VSMCs wie beschrieben 29 .
    2. Vorbereiten des vollständigen Mediums für die Kultur von VSMCs unter Verwendung von DMEM, enthaltend 1 g / l Glucose und ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin. Das gesamte Medium bei 4 ° C aufbewahren.
  2. Inkubation von VSMCs mit Polyphenol-Extrakten.
    1. Um die VSMCs zu teilen, verwerfe die KultRe mittel und die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Fügen Sie 4 ml PBS und 2 ml Trypsin EDTA 0,25% hinzu. Inkubieren der Zellen für 5 min bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator.
      1. Sammeln Sie die Zellen, mischen Sie sie mit 2 ml Vollmedium in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 1.100 × g für 5 min. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 1 ml PBS resuspendieren. Zähle die Zellen mit einem Hämocytometer.
      2. Samen 50.000 VSMCs pro Vertiefung in 6-Well-Kulturplatten und wachsen sie in komplettem Medium mit 10% FBS, bis sie 90% Konfluenz erreichen (ca. 3 d). Halten Sie die VSMCs bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO 2 Inkubator.
    2. Bereiten Sie das Medium für die Behandlung mit DMEM-Medium mit 1 g / l Glucose, 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 0,5% FBS vor. Das Behandlungsmedium bei 4 ° C aufbewahren.
      HINWEIS: Polyphenol-Extrakte und Ang II werden direkt zu Zellen mit diesem mir hinzugefügtDium
    3. Eine Stammlösung von 10 mg / ml Rohextrakt (CE) oder gereinigtem Extrakt (PE) von Polyphenolen vorbereiten, indem man 10 mg Extrakt in 1 ml DMM-Medium auflöst. Halten Sie den Bestand in 200 μl Aliquots bei -20 ° C.
    4. Inkubieren der VSMCs mit 2 ml Behandlungsmedium, enthaltend 0,5% FBS und fügen entweder CE- oder PE-Extrakte hinzu, um eine Konzentration von 50 - 500 μg / ml zu erreichen. Wechseln Sie das Medium alle 24 Stunden durch Zugabe von frischen Polyphenol-Extrakten. Behandle die Zellen für 3 d.
    5. Zur Behandlung mit Ang II oder anderen Hormonen und Wachstumsfaktoren verhungern die Zellen für mindestens 24 h durch Inkubieren der Zellen mit Behandlungsmedium mit 0,5% FBS vor der Zugabe von Ang II (100 nM).
      ANMERKUNG: Inkubation mit und ohne CE und PE in 0,5% FBS Behandlungsmedium vor der Zugabe von Ang II wird empfohlen.
      1. Nach 24 h Hunger fügen Sie 100 nM Ang II hinzu. Ersetzen Sie das Behandlungsmedium mit frischem CE, PE oder Ang II alle 24 h für 3 d.
  3. Vorbereitung von Zellproben
    1. Die behandelten Zellen zweimal in kaltem PBS waschen und mit 200 μl Lysepuffer auf Eis lysieren.
    2. Sammeln von Zelllysaten unter Verwendung von Zellschabern und übertragen die Lysate auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Inkubieren Sie die Gesamtzelllysate für 20 min auf Eis und verwirbeln Sie alle 5 min.
    3. Sonden Sie die Zellextrakte mit drei Bursts bei 125 W für jeweils 10 s, mit einer 2 s Pause dazwischen. Halten Sie die Proben auf Eis während der Beschallung.
    4. Messen Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Protein-Assay-Reagens bei 595 nm.
    5. Die Proben bei -20 ° C zur Analyse durch Western Blot aufbewahren.
  4. Westlicher Fleck.
    1. Mischen Sie gleiche Mengen an Protein (ca. 50 μg) aus kontrollierten nicht behandelten und mit Polyphenol behandelten oder mit AngII behandelten Proben mit Lysepuffer, um ein maximales Gesamtvolumen von 50 μl zu erhalten. Füge 16 μl eines 4x Laemmli Probenpuffers hinzu. Die Proben 5 Minuten bei 75 ° C erhitzen.
    2. Trennen Sie den SamplEs in 10% SDS-PAGE-Gelen und transferiert sie auf PDVF-Membranen bei 10 V für 75 min in einem halbtrockenen Transfersystem für die Western-Blot-Analyse mit spezifischen Antikörpern.
    3. Blockieren Sie die Membran mit 2% Milch in TBS 0,05% Triton-X100 Puffer (TBS-T) für 20 min.
    4. Entfernen Sie die Milch, indem Sie die Membran mindestens dreimal mit TBS (jeweils 5 min) waschen und mit primären Antikörpern für 1 h bei RT oder O / N bei 4 ° C inkubieren.
    5. Die Membran dreimal, jeweils 10 min, mit TBS-T waschen und mit einem HRP-verknüpften sekundären Antikörper für 45 min inkubieren.
    6. Waschen Sie die Membran dreimal, jeweils 10 min, mit TBS-T und entwickeln Sie durch verbesserte Chemilumineszenz (ECL).

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Ergebnisse

Es wurde zuvor gezeigt, dass Polyphenolextrakte, die aus BL, RB und BRB isoliert wurden, die Seneszenz von VSMCs als Reaktion auf Ang II 21 reduzierten. Es wurde gezeigt, dass diese gereinigten Polyphenolextrakte die Ang II-Signalisierung modulieren, indem sie die Phosphorylierung von Akt, p38 Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK) und ERK1 / 2 reduzieren. BL verhindert die Alterung durch die Verringerung der Expression der NADPH-Oxidase (Nox) 1, eines Enzyms, d...

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Diskussion

Polyphenole, die aus Beeren isoliert sind, enthalten unterschiedliche Kompositionen. Das hier beschriebene Ethanol-basierte Extraktionsprotokoll ermöglichte die Identifizierung verschiedener Phenolsäuren und Flavonoide, die in rohen und gereinigten Polyphenol-Extrakten von BL vorliegen ( Tabelle 1 ). CE wurde mit Gallussäure, Ferulasäure, 4-O-Caffeochininsäure und 5-O-Caffeoylchininsäure angereichert. Der Reinigungsprozess änderte die Mengen an Gallussäure und p-Cumarsäure nicht signifikant. Allerdings ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (14GRNT20180028) und dem Florida State University Council über Forschung und Kreativität (COFRS) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Angiotensin IISigma-Aldrich, Inc.A9525-10MGBehandlung von VSMCs
β-AktinSigma-Aldrich, Inc.A2228Primärer Antikörper (1:5000)
BrombeerfruchtMercer FoodsGefriergetrocknete Brombeerpulver
Katalase Calbiochem219010Primärer Antikörper (1:1000)
ChloroformBiotech Grd, Inc.97064-678Zubereitung von gereinigten Polyphenol-Extrakten
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEMMediatech, Inc.10-014-CVKultur von VSMCs
Ethanol (absolute molekularbiologische Qualität)Sigma-Aldrich, Inc.E7023-500MLZubereitung von Polyphenol-Extrakten
EthylacetatSigma-Aldrich, Inc.439169Herstellung von gereinigten Polyphenol-Extrakten
ERK1/2Cell Signaling Technology, Inc.9102SPrimärer Antikörper (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8,0Teknova, Inc.E0306Lysepuffer
GefriertrocknerLabconcoVirTis Benchtop KAufbereitung von Polyphenolextrakten
Fötales Rinderserum (FBS)Seradigm1400-500Zellkultur
HEPESSigma-Aldrich, Inc.H3375Lyse-Puffer 
NaClEMD Millipore, Inc.7760Lysepuffer
NaFJ.T.Baker, Inc.3688-01 Lyse-Puffer
Na3VO4Sigma-Aldrich, Inc.450243Lysepuffer
Na4P2O7 , DecahydratSigma-Aldrich, Inc.S-9515Lysepuffer
Phospho ERK1/2 Zellsignaltechnologie, Inc.9101SPrimärer Antikörper (1:1000)
Proteaseinhibitor-CocktailSigma-Aldrich, Inc.P8340-5mlLysepuffer
Proteinassay FarbstoffreagenzBio-Rad Laboratories, Inc.500-0006Messung der Proteinkonzentration
PVDF-TransfermembranThermo Scientific, Inc.88518Western Blots
Rotatorischer VerdampferBüchi LabortechnikRotavapor
R3000		Aufbereitung von Polyphenol-Extrakten
SterilwasserMediatech, Inc.25-055-CVAufbereitung von Polyphenol-Extrakten
SonicatorQSonica, LLCQ125Aufbereitung von Zellextrakten
SOD2Enzo Life Sciences, Inc.ADI-SOD-110-FPrimärer Antikörper (1:1000)
Triton-X-100Sigma-Aldrich, Inc.X100Western Blots
Whatman #2 FilterpapierGE Healthcare, Inc.28317-241Zubereitung von Polyphenol-Extrakten
)

Referenzen

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