Extraktion und Reinigung von Polyphenolen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver zur Behandlung von vaskulären glatten Muskelzellen<em&gt; In vitro</em

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Herstellung von Polyphenol-reichen Extrakten aus gefriergetrockneten Beerenpulver. Darüber hinaus gibt es eine gründliche Beschreibung der Verwendung dieser Polyphenol-reichen Extrakte in der Zellkultur in Gegenwart des Peptidhormons Angiotensin II (Ang II) unter Verwendung von vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs).

Zusammenfassung

Epidemiologische Studien zeigen, dass eine erhöhte Flavonoidaufnahme mit einer verminderten Mortalität aufgrund von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) in den USA (USA) und Europa korreliert. Beeren sind in den USA weit verbreitet und haben einen hohen Polyphenolgehalt. Es wurde gezeigt, dass Polyphenole mit vielen molekularen Targets in Wechselwirkung treten und zahlreiche positive biologische Funktionen ausüben, darunter antioxidative, entzündungshemmende und kardioprotektive Effekte. Polyphenole, die aus Brombeeren (BL), Himbeere (RB) und schwarzer Himbeere (BRB) isoliert wurden, reduzieren den oxidativen Stress und die zelluläre Seneszenz als Reaktion auf Angiotensin II (Ang II). Diese Arbeit liefert eine detaillierte Beschreibung des Protokolls zur Herstellung der Polyphenolextrakte aus gefriergetrockneten Beeren. Polyphenol-Extraktionen aus gefriergetrocknetem Beerenpulver wurden unter Verwendung von 80% igem wässrigem Ethanol und einem Ultraschall-unterstützten Extraktionsverfahren durchgeführt. Der Rohextrakt wurde weiter gereinigt und mit Chloroform und Ethylacetat fraktioniert,beziehungsweise. Die Effekte von sowohl rohen als auch gereinigten Extrakten wurden an vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) in Kultur getestet.

Einleitung

Polyphenole sind Verbindungen, die mindestens einen phenolischen Ring in ihrer Struktur enthalten und im Pflanzenreich reichlich vorhanden sind. Menschen verbrauchen Pflanzen seit Jahrtausenden für medizinische Zwecke, ohne sich der Existenz solcher Verbindungen bewusst zu sein ² . Viele Früchte und Gemüse haben einige geteilte polyphenolische Verbindungen, wenn auch mit unterschiedlichen Mengen, einschließlich Flavonoide, Stilbene und Phenolsäuren ³ . Obwohl Polyphenole oft mit bunten Früchten und Gemüse verbunden sind, ist dies nicht strikt wahr. Zum Beispiel sind Zeaxanthin und Xanthin in Gemüse, die nicht sehr bunt ....

Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

1. Bereiten Sie 80% Ethanol (100 ml) vor, indem Sie 80 ml absolutem Ethanol (Molekularbiologie-Klasse) und 20 ml Zellkultur-sterilem Wasser mischen.
2. Zur Herstellung von Polyphenol-Extrakt (10 mg / ml) wiegen 10 mg CE oder PE. Füge 1 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) unter einer Zellkultur Kapuze hinzu. Vortex die Lösung. Aliquot in 200-μL-Portionen und bei -20 ° C aufbewahren.
3. Lysepuffer vorbereiten
   1. Fügen Sie 5 ml 1 M HEPES-Stammlösung (pH 7,4, 50 mM endgültig), 1 ml 5 M NaCl-Stammlösung (50 mM endgültig), 1 ml 0,5 M EDTA-Stammlösung (5 mM endgültig), 2 ml 0,5, hinzu M NaF-Stammlösung (1....

Ergebnisse

Es wurde zuvor gezeigt, dass Polyphenolextrakte, die aus BL, RB und BRB isoliert wurden, die Seneszenz von VSMCs als Reaktion auf Ang II ²¹ reduzierten. Es wurde gezeigt, dass diese gereinigten Polyphenolextrakte die Ang II-Signalisierung modulieren, indem sie die Phosphorylierung von Akt, p38 Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK) und ERK1 / 2 reduzieren. BL verhindert die Alterung durch die Verringerung der Expression der NADPH-Oxidase (Nox) 1, eines Enzyms, d.......

Diskussion

Polyphenole, die aus Beeren isoliert sind, enthalten unterschiedliche Kompositionen. Das hier beschriebene Ethanol-basierte Extraktionsprotokoll ermöglichte die Identifizierung verschiedener Phenolsäuren und Flavonoide, die in rohen und gereinigten Polyphenol-Extrakten von BL vorliegen ( Tabelle 1 ). CE wurde mit Gallussäure, Ferulasäure, 4-O-Caffeochininsäure und 5-O-Caffeoylchininsäure angereichert. Der Reinigungsprozess änderte die Mengen an Gallussäure und p-Cumarsäure nicht signifikant. Allerdings .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Angiotensin II	Sigma-Aldrich, Inc.	A9525-10MG	Behandlung von VSMCs
β-Aktin	Sigma-Aldrich, Inc.	A2228	Primärer Antikörper (1:5000)
Brombeerfrucht	Mercer Foods		Gefriergetrocknete Brombeerpulver
Katalase	Calbiochem	219010	Primärer Antikörper (1:1000)
Chloroform	Biotech Grd, Inc.	97064-678	Zubereitung von gereinigten Polyphenol-Extrakten
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM	Mediatech, Inc.	10-014-CV	Kultur von VSMCs
Ethanol (absolute molekularbiologische Qualität)	Sigma-Aldrich, Inc.	E7023-500ML	Zubereitung von Polyphenol-Extrakten
Ethylacetat	Sigma-Aldrich, Inc.	439169	Herstellung von gereinigten Polyphenol-Extrakten
ERK1/2	Cell Signaling Technology, Inc.	9102S	Primärer Antikörper (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8,0	Teknova, Inc.	E0306	Lysepuffer
Gefriertrockner	Labconco	VirTis Benchtop K	Aufbereitung von Polyphenolextrakten
Fötales Rinderserum (FBS)	Seradigm	1400-500	Zellkultur
HEPES	Sigma-Aldrich, Inc.	H3375	Lyse-Puffer
NaCl	EMD Millipore, Inc.	7760	Lysepuffer
NaF	J.T.Baker, Inc.	3688-01	Lyse-Puffer
Na3VO4	Sigma-Aldrich, Inc.	450243	Lysepuffer
Na4P2O7 , Decahydrat	Sigma-Aldrich, Inc.	S-9515	Lysepuffer
Phospho ERK1/2	Zellsignaltechnologie, Inc.	9101S	Primärer Antikörper (1:1000)
Proteaseinhibitor-Cocktail	Sigma-Aldrich, Inc.	P8340-5ml	Lysepuffer
Proteinassay Farbstoffreagenz	Bio-Rad Laboratories, Inc.	500-0006	Messung der Proteinkonzentration
PVDF-Transfermembran	Thermo Scientific, Inc.	88518	Western Blots
Rotatorischer Verdampfer	Büchi Labortechnik	Rotavapor R3000	Aufbereitung von Polyphenol-Extrakten
Sterilwasser	Mediatech, Inc.	25-055-CV	Aufbereitung von Polyphenol-Extrakten
Sonicator	QSonica, LLC	Q125	Aufbereitung von Zellextrakten
SOD2	Enzo Life Sciences, Inc.	ADI-SOD-110-F	Primärer Antikörper (1:1000)
Triton-X-100	Sigma-Aldrich, Inc.	X100	Western Blots
Whatman #2 Filterpapier	GE Healthcare, Inc.	28317-241	Zubereitung von Polyphenol-Extrakten

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