Methodenartikel

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

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DOI:

10.3791/55609

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31. Mai 2017

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1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen: dreidimensionale mikrometergroße Konstrukte, die aus lang ausgerichteten axonalen Traktaten bestehen, die aggregierte neuronale Populationen umfassen, die in einem tubulären Hydrogel umhüllt sind. Diese lebenden Gerüste können als funktionelle Relais dienen, um neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren oder zu modulieren oder als biofidelische Testbetten, die grau-weiße Materie Neuroanatomie nachahmen.

Zusammenfassung

Die funktionelle Erholung tritt nach der Verletzung oder der krankheitsinduzierten Degeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) aufgrund der hemmenden Umgebung und der begrenzten Neurogenesefähigkeit häufig auf. Wir entwickeln eine Strategie, um gleichzeitig den neuronalen und axonalen Wegverlust innerhalb des beschädigten ZNS zu adressieren. Dieses Manuskript stellt das Herstellungsprotokoll für Mikrogewebe-konstruierte neuronale Netze (Mikro-TENNs) dar, implantierbare Konstrukte, bestehend aus Neuronen und ausgerichteten axonalen Traktaten, die das extrazelluläre Matrix- (ECM-) Lumen eines vorgeformten Hydrogelzylinders umhängen, der Hunderte Mikrometer Durchmesser aufweist, der sich in Zentimeter erstrecken kann in Länge. Neuronale Aggregate sind auf die Extreme der dreidimensionalen Umhüllung abgegrenzt und werden durch axonale Projektionen überspannt. Micro-TENNs sind einzigartig als Strategie für den ZNS-Rekonstruktion, emulieren Aspekte der Gehirn-Connectome-Cytoarchitektur und potenziell Bereitstellung von Mitteln für den Netzaustausch. Die neuRonale Aggregate können mit Wirtsgewebe synapsen, um neue funktionale Relais zu bilden, um fehlende oder beschädigte Schaltkreise wiederherzustellen und / oder zu modulieren. Diese Konstrukte können auch als proregenerative "lebende Gerüste" fungieren, die in der Lage sind, Entwicklungsmechanismen für die Zellmigration und die axonale Pfadfindung zu nutzen, wobei synergistische strukturelle und lösliche Cues auf der Grundlage des Regenerationszustandes vorhanden sind. Mikro-TENNs werden hergestellt, indem flüssiges Hydrogel in eine zylindrische Form gegossen wird, die eine in Längsrichtung zentrierte Nadel enthält. Sobald das Hydrogel geliert ist, wird die Nadel entfernt, wobei eine hohle Mikrosäule zurückbleibt. Eine ECM-Lösung wird dem Lumen zugesetzt, um eine Umgebung bereitzustellen, die für neuronale Adhäsion und axonales Auswachsen geeignet ist. Dissoziierte Neuronen werden für eine präzise Aussaat innerhalb eines oder beider Enden der Mikrosäule mechanisch aggregiert. Diese Methodik produziert zuverlässig selbständige Miniatur-Konstrukte mit langprojektiven axonalen Traktaten, die Merkmale der Hirnneuroanatomie rekapitulieren können. Synaptic immUnauffällige und genetisch codierte Calciumindikatoren deuten darauf hin, dass Mikro-TENNs eine weitgehende synaptische Verteilung und intrinsische elektrische Aktivität besitzen. Folglich stellen Mikro-TENNs eine vielversprechende Strategie für eine gezielte neurochirurgische Rekonstruktion von Gehirnwegen dar und können auch als biofidelische Modelle zur Untersuchung neurobiologischer Phänomene in vitro angewendet werden .

Einleitung

Ein gemeinsames Merkmal von Erkrankungen und Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), wie z. B. traumatische Hirnverletzungen (TBI), Rückenmarksverletzungen (SCI), Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, ist die Trennung von axonalen Bahnen und neuronaler Zelle Verlust 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Zum Beispiel, wenn ein ischämischer Schlaganfall unbehandelt wird, wird geschätzt, dass Axone mit einer Rate von 7 Meilen von Axonen pro Minute 5 verloren gehen. Im Falle von TBI, die etwa 1,7 Millionen Menschen jedes Jahr in den USA alleine erleben, kann die axonale Degeneration auch nach dem Trauma weiter auftreten, da die anfängliche Verletzung einen langfristigen neurodegenerativen Zustand auslöst 4 . Diese schädlichen Wirkungen verschärfen, hat das ZNS eine stark eingeschränkte KapazitätStadt zur Regeneration 1 , 7 , 8 , 9 . Nach der Verletzung entwickelt sich eine hemmende Umgebung, die durch einen Mangel an gerichteter Orientierung an entfernten Targets, die Anwesenheit von Myelin-assoziierten Inhibitoren, die das Auswachsen von Neuriten behindern, und die Bildung einer Glia-Narbe durch reaktive Astrozyten 8 , 10 , 11 , 12 gekennzeichnet ist . Die gliale Narbe dient als biochemische und physikalische Barriere gegen die Regeneration, wobei Moleküle wie Chondroitinsulfat-Proteoglykane das Axonwachstum 8 , 11 behindern. Darüber hinaus, obwohl neuronale Stammzellen in der erwachsenen ZNS gefunden worden sind, ist die Produktion von neuen Neuronen begrenzt, da konsequente Hinweise auf Neurogenese wurde nur in der olfaktorischen Glühbirne, die Hippocampal gefundenSubgranulare Zone, die periventrikuläre Fläche und der zentrale Kanal des Rückenmarks 13 , 14 . Diese Hindernisse verhindern die funktionelle Wiederherstellung von verlorenen Neuronen und der weißen Stoffarchitektur nach Verletzung oder Krankheit, was zu den oft lebensverändernden und verlängerten Wirkungen dieser Bedingungen führt.

Trotz des Mangels an regenerativer Kapazität im adulten ZNS wurde gezeigt, dass eine axonale Regeneration möglich ist, wenn den Wirtsneuronen 15 , 16 , 17 , 18 adäquate Umgebungsmerkmale präsentiert werden. Forscher haben versucht, Wachstumsfaktoren zu liefern und zu manipulieren ( zB Nervenwachstumsfaktor, epidermaler Wachstumsfaktor, glialabhängiger Wachstumsfaktor und neurotrophischer Faktor-3) und andere Leitmoleküle zur Stimulierung von Plastizität und Axonregeneration 14 , </ Sup> 18 , 19 Obwohl diese Studien bestätigt haben, dass erwachsene Axone in der Lage sind, auf Wachstumsfaktoren zu reagieren, sind diese Strategien durch die geringe Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke und die spezifischen räumlichen und zeitlichen Gradienten, die zur Förderung der Regeneration 14 , 18 , 19 erforderlich sind, begrenzt. Andere Ansätze haben sich auf die Hyperaktivierung von regenerationsbedingten Transkriptionsfaktoren in ZNS-Neuronen gestützt. Zum Beispiel stimulierte die Überexpression des Stat3-Transkriptionsfaktors die axonale Regeneration im Sehnerv 20 . Trotzdem ersetzen sowohl die Biomolekülabgabe als auch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren die verlorenen neuronalen Populationen nicht. Zellbasierte Strategien konzentrierten sich vor allem auf die Verpflanzung von neuralen Stammzellen (NSCs) in das ZNS, wobei sie ihre Fähigkeit nutzen, ZNS-Neuronen zu ersetzen, trophische Faktoren freizugeben,Und unterstützen die Neurogeneseversuche, die nach Verletzung auftreten 17 . Trotzdem gibt es immer noch dringende Herausforderungen, die diesen Ansatz behindern, einschließlich der behinderten Fähigkeit, transplantierte neuronale Zellen zu überleben, mit dem Wirt zu integrieren und räumlich auf den verletzten Bereich 6 , 14 , 17 , 21 zu beschränken. Darüber hinaus ist die Zelllieferung allein nicht in der Lage, die Cytoarchitektur von beschädigten oder verlorenen axonalen Wegen wiederherzustellen. Ein alternativer Ansatz, der die Probleme der Zelle und der Arzneimittel- / Chemikalienabgabestrategien anspricht, kombiniert diese Ansätze mit dem Einsatz von Biomaterialien 14 , 22 , 23 . Biomaterialien wie Hydrogele sind in der Lage, die biochemischen und physikalischen Eigenschaften der extrazellulären Matrix (ECM) zu emulieren, wobei sie in der Zellabgabe undD Retention innerhalb des verletzten Bereichs und liefert Wachstumsfaktoren und andere bioaktive Moleküle mit kontrollierter Freisetzung 22 . Die attraktiven Merkmale dieser biomaterialbasierten Strategien haben zu einer Nachweis der in vivo axonalen Regeneration nach der Transplantation von Gerüsten in den Läsionsbereich 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 geführt . Allerdings ersetzen azelluläre Biomaterial-Strategien nicht verlorene neuronale Populationen; Wenn sie als Lieferfahrzeuge für neuronale, gliale oder neuronale Vorläuferzellen verwendet werden, sind Biomaterialien nicht in der Lage, Fern-Axonal-Netzwerke zu rekonstituieren. Die Herausforderung, einen Ansatz zu entwickeln, der sowohl die axonale Wegdegeneration als auch den neuronalen Verlust, der mit der ZNS-Verletzung und der Krankheit verbunden ist, bekämpft, bleibt noch 31.

Unsere Forschungsgruppe berichtete bisher über die Entwicklung von implantierbaren mikrogewebetechnischen neuronalen Netzwerken (Mikro-TENNs), die eine Art von "lebendem Gerüst" sind, bestehend aus neuronalen Zellkörpern, die auf ein oder beide Enden einer Agarose-Hydrogel-ECM-Mikrosäule beschränkt sind Mit ausgerichteten axonalen Traktaten, die sich im gesamten Inneren dieser dreidimensionalen (3D) Umhüllung 1 , 10 , 31 , 32 erstrecken. Einer der Hauptunterschiede zwischen dieser Technik und früheren Ansätzen besteht darin, dass die Cytoarchitektur von Mikro-TENNs vollständig in vitro erzeugt und danach nach 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 . In-vitro- Fertigung bietet eine ausgedehnte räumliche und zeitliche Kontrolle von zellulärem Phänotyp und Orientierung, mechanisch-physikalischen Eigenschaften, biochemischen Cues und exogenen Faktoren, die die Integration dieser Gerüste mit dem Wirt nach der Implantation 41 , 42 zugute kommen . Mikro-TENNs sind anatomisch inspiriert, weil sie die Hirnneuroanatomie emulieren und axonale Traktate zeigen, die denen ähnlich sind, die verschiedene funktionale Bereiche des Gehirns überbrücken (Abbildung 1A ) 1 . Daher kann diese Strategie in der Lage sein, die verlorenen weißen Materie Traktate und Neuronen nach der Implantation in eine läsionierte Region physisch zu ersetzen. Diese Technik wird auch von Entwicklungsmechanismen inspiriert, in denen "natürliche lebende Gerüste", die durch radiale Gliazellen und wegweisende Axone gebildet werden, als Wegweiser für Zelle dienenMigration aus der subventrikulären Zone und axonale Auswüchse bzw. 43 . Diese Mechanismen werden in den ausgerichteten axonalen Traktaten von Mikro-TENNs rekapituliert, die lebende Wege für die neuronale Zellmigration und die axonale Regeneration durch axonvermitteltes axonales Auswachsen darstellen können (Abbildung 1C ) 43 . Darüber hinaus nutzt diese Strategie die synaptische Integration zwischen den Mikro-TENN-Neuronen und nativen Schaltkreisen und bildet neue Relais, die zur funktionellen Wiederherstellung beitragen können (Abbildung 1B ) 43 . Die Fähigkeit zur Synapsenbildung kann auch diesem Ansatz die Möglichkeit geben, das ZNS zu modulieren und auf das Gewebe nach Netzwerkrückmeldung zu reagieren. Zum Beispiel können optogenetisch aktive Neuronen in den lebenden Gerüsten stimuliert werden, um Host-Neuronen durch synaptische Wechselwirkungen zu modulieren (Abbildung 1D ).

Darüber hinaus ist die Biomaterial-basierte RohrkonstruktionDie Vermeidung von Mikro-TENNs bietet eine adäquate Umgebung für die Zelladhäsion, das Wachstum, die Neuritenverlängerung und die Signalisierung, während die Miniaturabmessungen der Konstrukte potentiell eine minimal invasive Implantation ermöglichen und eine teilweise sequestrierte Mikroumgebung für eine allmähliche Integration in das Gehirn bieten. In der Tat haben die jüngsten Veröffentlichungen das Potenzial von Mikro-TENNs nachgewiesen, um neuronale Wege nach der Implantation in das Rattenhirn zu imitieren. Nach der stereotaktischen Mikroinjektion haben wir bisher den Nachweis des mikro-TENN-neuronalen Überlebens, die Aufrechterhaltung der axonalen Traktarchitektur und die Neuritenerweiterung in den Wirtskortex mindestens 1 Monat in vivo 10 , 31 gemeldet. Darüber hinaus lieferte die Markierung mit Synapsin histologische Hinweise auf die synaptische Integration mit dem nativen Gewebe 10 , 31 . Insgesamt können Mikro-TENNs eindeutig geeignet sein, um beschädigt zu rekonstruieren und zu modulierenZNS durch Ersetzen verlorener Neuronen, synaptische Integration mit Host-Schaltungen, Wiederherstellung der verlorenen axonalen Cytoarchitektur und in bestimmten Fällen die Bereitstellung von regenerierenden Axonen mit den entsprechenden Pfadfindungs-Cues.

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Abbildung 1: Grundsätze und Inspirationen hinter der Entwicklung von mikrogewebetechnischen Neuronennetzen (Mikro-TENNs). ( A ) Micro-TENNs imitieren die Cytoarchitektur des Gehirnverbundes (violett), in der funktionell unterschiedliche Bereiche durch lange, ausgerichtete Axonaltrakte in einer unidirektionalen (rot, grün) oder bidirektionalen (blauen) Weise verbunden sind. Beispielsweise könnten Mikro-TENNs verlorene Verbindungen in kortikothalamischen und nigrostriatalen Bahnen oder im perforanten Weg von der entorhinalen Kortex zum Hippocampus (angepasst von Struzyna et al. , 2015) rekonstituieren. ( B ) Diagramm einer UnidirektionaL und bidirektionale Mikro-TENN (rot und blau) synaptisch mit der Host-Schaltkreise (lila) integriert, um als funktionales Relais zwischen beiden Enden einer Läsion zu dienen. ( C ) Schematische Darstellung der axonalen Traktate eines unidirektionalen Mikro-TENN (grün), die als Leitfaden für die axon-erleichterte Regeneration von Wirts-Axonen (violett) zu einem Ziel dienen, mit dem das Mikro-TENN wechselwirkt. ( D ) Konzeptionelle Darstellung der Verwendung von optogenetisch aktiven Mikro-TENNS als Neuromodulatoren unter Ausnutzung der synaptischen Integration mit exzitatorischen oder inhibitorischen Neuronen (unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Das aktuelle Manuskript beschreibt die Methodik, die zur Herstellung von Mikro-TENNs unter Verwendung von embryonal abgeleiteten zerebralen kortikalen Neuronen verwendet wird. Bemerkenswerterweise könnten Mikro-TENNs mit anderen Arten von neuralen Zellen hergestellt werden. Für exReichlich, die ersten Berichte über die erfolgreiche Mikro-TENN-Entwicklung vorgestellten Dorsal Wurzelganglion (DRG) Neuronen 32 . Die Hydrogel-Mikrosäulen können erzeugt werden (Abbildung 2A ) durch Zugabe von flüssiger Agarose zu einer maßgeschneiderten, lasergeschnittenen zylindrischen Kanalanordnung oder zu Kapillarrohren, die beide ausgerichtete Akupunkturnadeln enthalten. Die Nadel bildet das Lumen und bestimmt den Innendurchmesser (ID) der Mikrosäule, während die Kapillarröhren-ID und der Durchmesser der Zylinder in der Laserschneidvorrichtung den Außendurchmesser (OD) der Konstrukte diktieren. Die OD und ID können entsprechend der gewünschten Anwendung gewählt werden, indem man unterschiedliche Durchmesser für die Geräte / Kapillarrohre bzw. die Akupunkturnadeln auswählt. Die Länge der Mikrosäulen kann auch variiert werden; Bisher haben wir den Bau von Mikro-TENNs bis zu 20 mm in der Länge 10 gemeldet und betreiben aktiv noch längere Längen. Nach den Agarosegelen und der Akupunktur nEedles werden entfernt, eine ECM-Lösung, die im allgemeinen aus Kollagen Typ I und Laminin besteht, wird dem Lumen der Konstrukte hinzugefügt ( Fig. 2C ). Der ECM-Kern sorgt für ein Gerüst zur Unterstützung der neuronalen Zelladhäsion und des axonalen Auswuchses. Anfänglich wurden primäre Ratten-kortikale Neuronen in den Mikrosäulen unter Verwendung von dissoziierten Zellsuspensionen 10 , 31 , 32 plattiert. Allerdings hat dieser Ansatz in allen Fällen nicht die Ziel-Cytoarchitektur hervorgebracht, die als die neuronalen Zellkörper definiert wurde, die auf die Enden der Mikrosäulen beschränkt waren, wobei das zentrale Lumen aus reinen, ausgerichteten axonalen Traktaten bestand. Seither hat die Verwendung eines erzwungenen neuronalen Aggregationsverfahrens (basierend auf Protokollen von Ungrin et al .) Eine zuverlässigere und konsistentere Herstellung von Mikro-TENNs mit der idealen Struktur ermöglicht (Abbildung 2B ) 44 . Neben der Beschreibung der aktuellenMethodik, wird dieser Artikel zeigen repräsentative Phasenkontrast und konfokale Bilder von Mikro-TENNs, die die Bildung von axonalen Traktaten im Laufe der Zeit, sowie die finalisierte Ziel-Zytoarchitektur zeigen. Dieses Manuskript wird auch auf bemerkenswerte Aspekte des Protokolls und die verbleibenden Herausforderungen und zukünftigen Richtungen der Mikro-TENN-Technologie erweitern.

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Abbildung 2: Schematische Darstellung des dreistufigen Mikro-TENN-Herstellungsprozesses. ( A ) Entwicklung des Agarose-Hydrogels: (i) Zunächst wird eine kleine Akupunkturnadel ( z. B. 180-350 μm Durchmesser) in die zylindrischen Kanäle einer maßgeschneiderten, lasergeschnittenen Form oder eines Kapillarrohres ( z , Durchmesser von 380-700 μm). Im nächsten Schritt wird flüssige Agarose in DPBS in die zylindrischen Kanäle oder Kapillarrohre eingeführt. (Ii) Nach den Agarosegelen wird die Nadel entfernt undDie Form wird zerlegt, um die hohlen Agarose-Mikrosäulen zu ergeben. (Iii) Diese Konstrukte werden dann sterilisiert und in DPBS gelagert. ( B ) Primäre Neuronenkultur und die Aggregatmethode: (i) Die neuronale Aggregation wird in pyramidenförmigen Mikro-Well-Arrays durchgeführt, die aus 3D-bedruckten Formen gegossen werden, die in die Vertiefungen einer 12-Well-Kulturplatte passen. (Ii) Mikro-TENNs umfassen primäre Rattenneuronen, die von fetalen Gehirnen von Embryon-Tag-18-Ratten dissoziiert sind. Nach der Gewebedissoziation mit Trypsin-EDTA und DNase I wird eine Zelllösung mit einer Dichte von 1,0-2,0 x 10 & sup6; Zelle / ml hergestellt. (Iii) 12 & mgr; l dieser Lösung werden in jede Vertiefung in dem pyramidenförmigen Mikro-Well-Array übertragen. Die Platte, die diese Mikro-Vertiefungen enthält, wird zentrifugiert, um Zellaggregate zu erzeugen. (Iv) Diese werden dann über Nacht vor dem Plattieren in den Mikrosäulen inkubiert. ( C ) ECM-Kernherstellung und Zellseeding: (i) Vor der Zellseedung wurde eine ECM-Lösung mit 1 mg / ml Typ I Kollagen und 1 mg / mlLaminin wird in das Innere der Mikro-TENNs überführt und polymerisiert. (Ii) Abhängig davon, ob unidirektionale oder bidirektionale Mikro-TENNs hergestellt werden, wird ein Aggregat an einem oder beiden Extremen der Mikrosäule platziert. (Iii) Nach einer Inkubationszeit zur Förderung der Adhäsion werden Mikro-TENNs in Petrischalen gezüchtet, die mit einem ergänzten embryonalen neuronalen Basalmedium überflutet sind. (Iv) Nach 3-5 Tagen in Kultur sollte die endgültige Mikro-TENN-Struktur Zelle Aggregate an den Extremen der Mikrosäule zeigen, wobei axonale Traktate ihre Länge überspannen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden von den Institutional Animal Care und Use Committees an der University of Pennsylvania und dem Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und beachteten die Richtlinien, die in der NIH Public Health Service Policy für Humane Care und Use of Laboratory dargelegt wurden Tiere (2015).

1. Entwicklung des Agarose-Hydrogels (Acelluläre Komponente von Mikro-TENNs)

  1. Agarose-Lösungsvorbereitung
    1. In einem Biosicherheitsschrank werden Reservoirs für die Mikrosäulen vorbereitet, indem 20 ml Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in jede von zwei 10-cm-Petrischalen überführt werden. Sterilisieren Sie feine Zangen und Mikroskalpelle mit einem heißen Wulst-Sterilisator.
    2. 3 g Agarose wiegen und in ein steriles Becherglas im Biosicherheitsschrank überführen. 100 ml DPBS für eine Endkonzentration von 3% Gewicht / Volumen (w / v) zugeben. Füge einen sauberen Magnetstab ein und decke den Becher mit Alumi abNum folie
    3. Mit einer Heißplatte / Rührer den Becher bei 100 ° C erwärmen und bei 120-200 U / min umrühren, um die Agarose vollständig aufzulösen (die Lösung wird von bewölkt zu klar). Halten Sie das Erhitzen und rühren danach, um die Gelierung zu verhindern und die Heiztemperatur nach Bedarf zu ändern, um die Verbrennung der Agarose zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Fertigung mit dem Laserschnitt und den Kapillarrohren ist nachfolgend in den Abschnitten 1.2 bzw. 1.3 dargestellt. Fahren Sie mit dem Unterabschnitt 1.4 fort, nachdem Sie die in beiden Unterabschnitten beschriebenen Schritte beendet haben. Für beide Mikro-Säulen-Herstellungsverfahren, fügen Sie die flüssige Agarose schnell, wie Agarose verfestigt sich schnell, wie es abkühlt. Bei der Sterilisation mit einem Autoklaven in einem der folgenden Schritte, verwenden Sie die Standardbedingungen für Glaswaren.
  2. Mikro-Säulen-Zubereitung mit einem Laserschnitt
    HINWEIS: Die Lasergeschnittene Vorrichtung wird aus transparentem Acryl mit einem handelsüblichen CO 2 -Laserschneider geschnitten. Das fabriKation von Strukturen und Geräten durch Laserschneiden ist für eine Reihe von Ingenieur- und Forschungsanwendungen 45 , 46 , 47 gut dokumentiert. Diese Form ( Figur 3 ) besteht aus einer Anordnung von fünf zylindrischen Kanälen mit jeweils einem Durchmesser von 398 μm und einer Länge von 6,35 mm. Diese zylindrischen Arrays werden entlang ihrer Länge um zwei Stücke gebildet: eine untere Hälfte (Länge: 25,4 mm, Breite: 6,35 mm, Höhe: 6,0 mm) und eine obere Hälfte (Länge: 31,5 mm, Breite: 6,35 mm, Höhe: 12,7 mm ), Wie in den Fig. 3A und 3B gezeigt . Die beiden Hälften können durch die in Abbildung 3C beobachteten vorderen und hinteren Kappen (Länge: 31,5 mm, Breite: 6,35 mm, Höhe: 12,7 mm) zusammengeklemmt werden, die vier Ausrichtungslöcher aufweisen, die mit zwei Löchern jeweils oben und unten zusammenfallen Stücke und das hilft, alle Teile bei der Verschraubung zu sichern. Diese Caps auch incLügen Sie fünf Löcher, konzentrisch zu den zylindrischen Kanälen, in die die Akupunkturnadeln eingefügt werden können, um das Lumen der Mikrosäulen zu bilden.
    1. Sterilisieren Sie die in Abbildung 3 dargestellte Vorrichtung, indem Sie sie mit Aluminiumfolie und Autoklavieren abdecken. Montieren Sie das Gerät wie in Abbildung 3D gezeigt, indem Sie die vorderen und hinteren Kappen mit nur dem unteren Halbstück ausrichten und die drei Teile mit zwei # 4-40 Schrauben und Muttern (Gewindedurchmesser: 3,05 mm) in den unteren Ausrichtungslöchern befestigen.
    2. Führen Sie eine Akupunkturnadel (Durchmesser: 180 μm, Länge: 30 mm) vollständig in die Nadellöcher an der vorderen oder hinteren Kappe des Gerätes ein (Abbildung 3D ). Mit einer Mikropipette gießen Sie genug flüssige Agarose (~ 1 ml für die fünf Kanäle) auf das untere Halbstück, um alle zylindrischen Kanalhälften vollständig zu füllen.
    3. Setzen Sie das Oberteil des Gerätes sofort auf die untere Hälfte und wenden Sie den Druck bis zum Anschlag festPlatz, um die zylindrischen Kanäle zu vervollständigen (Reibung zwischen den Kappen und dem Oberteil hält diese an Ort und Stelle). Warten Sie ~ 5 min bei Raumtemperatur nach Agarose-Zugabe, um die Gelierung innerhalb der Kanäle des Gerätes zuzulassen.
    4. Manuell die Nadel aus jedem der Löcher auf die Kappen des Gerätes herausziehen. Entfernen Sie die Schrauben und trennen Sie die beiden Kappen und die obere Hälfte manuell von der unteren Hälfte, wo die letzteren die Hydrogel-Mikrosäulen halten werden.
    5. Verwenden Sie eine feine Zange, um die Mikrosäulen vorsichtig aus den Kanälen auf dem unteren Halbstück zu entfernen und in die zuvor hergestellte Petrischale mit DPBS zu legen (Schritt 1.1.1). Wiederholen Sie das Gerät für eine weitere Runde der Mikrosäulenfertigung. Weiter mit Unterabschnitt 1.4.
  3. Mikrosäulenfertigung mit Kapillarrohren
    1. Übergangsglas-Kapillarrohre (Durchmesser: 398,78 μm, Länge: 32 mm) zur Innenseite des Biosicherheitsschrankes. Manuell brechenLange Röhrchen in 2,0-2,5-cm-Fragmente geben und eine Akupunkturnadel (Durchmesser: 180 μm, Länge: 30 mm) vollständig in jedes Fragment einfügen (Abbildung 2A ).
    2. 1 ml flüssige Agarose aus dem Becher auf die Oberfläche einer leeren Petrischale geben. Halten Sie das Kapillarrohr und die eingeführte Nadel, legen Sie ein Ende des Röhrchens in Kontakt mit dem flüssigen Agarose-Pool, um es durch Kapillarwirkung zu füllen. Bewegt die Tube, um den Kapillaraufstieg zu fördern.
      HINWEIS: Füllen Sie die Kapillarrohre mit flüssiger Agarose so hoch wie die Kapillarwirkung erlaubt ist. Danach können diese Mikrosäulen je nach gewünschter Länge in kleinere Konstrukte geschnitten werden. Der 1-mL-Agarose-Pool wird typischerweise nur für ein Röhrchen verwendet, da sich die Agarose schnell abkühlt und sich schnell risst und eine weitere Kapillarwirkung verhindert.
    3. Wenn die Flüssigkeit aufhört zu steigen, entfernen Sie das Kapillarrohr aus dem Pool und legen Sie es waagerecht auf die Oberfläche einer Petrischale. Warten Sie 5 min, um das Agarosegel in die Röhrchen zu lassen.
    4. Setzen Sie den Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten des Rohres und drücken Sie dagegen. Benutze die andere Hand, um schnell die Nadel herauszuziehen, während du den Daumen und den Zeigefinger benutzt, um zu verhindern, dass die Mikrosäule selbst aus dem Rohr herausrutscht. Setzen Sie eine 30-Gauge-Nadel in das Kapillarrohr ein, um die Mikrospalte langsam in eine Schale zu bringen, die DPBS enthält (Schritt 1.1.1).
  4. Micro-Säulen-Trimmen und Sterilisation
    1. Zutritt eine Mikrospalte von DPBS auf eine leere Schale mit feiner Pinzette übertragen. Füge 10 μl DBPS an die Spitze der Mikrosäule mit einer Mikropipette hinzu, um ein Trocknen zu verhindern. Legen Sie das letztere Gericht unter ein Stereoskop zur visuellen Führung.
      ANMERKUNG: Während des Protokolls bezieht sich die Mikrosäulentrocknung oder -trocknung auf den Erwerb einer zerknüllten Struktur, die visuell von dem typischen, hydratisierten Aussehen dieser Konstrukte unterscheidbar ist. Dehydrierte Mikrosäulen fest an der Oberfläche von Petrischalen und cAnnot kann leicht bewegt werden, während hydratisierte Konstrukte dazu neigen, über die Oberfläche zu gleiten, nachdem sie mit einer Pinzette manipuliert wurden. Ein Phasenkontrastbild einer vollständig getrockneten Mikrosäule ist in Fig. 8A gezeigt .
    2. Die Mikrospalte mit einem Mikroskalpel abschneiden, um sie auf die gewünschte Länge zu verkürzen (hier 2-5 mm). Transportieren Sie die getrimmte Mikrosäule mit feiner Pinzette zu der anderen in Schritt 1.1.1 hergestellten DPBS-Petrischale.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 und 1.4.2 für jede gefertigte Mikrosäule.
    4. Sterilisieren der Mikrosäulen in den DPBS-haltigen Petrischalen unter UV-Licht für 1 h. Die Petrischalen bei 4 ° C vor der ECM-Zugabe und der Zellbeschichtung aufbewahren.

2. Primäre Neuronenkultur und erzwungene Zellaggregationsmethode

  1. Vorbereitung des pyramidenförmigen Mikro-Well-Arrays
    HINWEIS: Dieser Abschnitt verwendet eine 3D-bedruckte Form, die aus einer zylindrischen Basis (Durchmesser: 2,2 cm, Höhe: 7,0 mm) a bestehtNd neun quadratische Pyramiden oben (Seitenlänge: 4,0 mm, Neigungswinkel: 60 °), organisiert in einem 3 x 3 Array, wie in Abbildung 3E gezeigt . Das Additiv-Herstellungsverfahren mit handelsüblichen 3D-Druckern ist gut dokumentiert. Computergestützte Design-Software kann verwendet werden, um die Form zu entwerfen. Die daraus resultierende Designdatei kann dann digital in einen Werkzeugweg für einen 3D-Drucker umgewandelt werden. Jeder Drucker hat unterschiedliche Spezifikationen, und die Anweisungen zum Einrichten und Betreiben eines 3D-Druckers variieren entsprechend.
    1. Verwenden Sie einen 3/32 "Bohrer, um 16 Löcher in einem 4 x 4 Array zu punktieren (Seitenlänge: 4 cm, Lochtrennung: 1 cm), zentriert in den Deckel einer 10 cm Petrischale. Im Inneren einer chemischen Dunstabzugshaube verwenden Das untere Stück der Petrischale, um 27 g Polydimethylsiloxan (PDMS) und 3 g Härtungsmittel (für ein Verhältnis von 1:10) zu wiegen. Mit einem Mikrospatel rühren, um das Mittel gleichmäßig zu verteilen.
    2. Decken Sie das PDMS / Härtungsmittel mit dem punktierten Deckel ab. Verbinden Sie ein Ende eines Schlauches mit dem VakuumM Port der Dunstabzugshaube und stecke das andere Ende in den Stamm eines Trichters ein (Munddurchmesser: 10 cm, Stammlänge: 3 cm, Stammdurchmesser: 1,5 cm).
    3. Machen Sie eine Öffnung mit einem 3/32 "Bohrer an der Oberseite einer 1 mL Pipette Glühbirne und legen Sie eine 1000 μL Mikropipettenspitze in die Öffnung (mit dem spitzen Ende nach oben) ein. Legen Sie die Lampe und die Spitze in den Schlauch und ziehen Sie sie Der Schlauch nach oben, bis die Lampe den Schlauch in den Stamm des Trichters abdichtet.
    4. Setzen Sie den Trichter auf den Lochblechdeckel und sichern Sie den Schlauch mit einer stabilen Stütze. Das Vakuumventil für 5 min zum Ansaugen öffnen und die Luftblasen an die Oberfläche bringen.
    5. Schließen Sie das Ventil, entfernen Sie den Trichter und schlagen Sie die Petrischale gegen die Oberfläche der Dunstabzugshaube ~ 3 mal, um alle verbleibenden Luftblasen zu platzen.
    6. Legen Sie eine pyramidenförmige 3D-bedruckte Form in jede der Vertiefungen in einer 12-Well-Kulturplatte, wobei die Pyramiden nach oben zeigen. Gießen Sie das PDMS / Härtungsmittel oben auf die Formen, bis jede Vertiefung von tEr ist gefüllt Die 12-Well-Platte mit dem Deckel bedecken und 1 h bei 60 ° C in einen Ofen geben, um zu trocknen.
    7. Entfernen Sie vorsichtig jedes PDMS-Mikro-Well-Array (Abbildung 3F ) von der Platte mit einem Mikrospatel. Die PDMS-Arrays mit Aluminiumfolie abdecken und durch Autoklavieren sterilisieren. Innerhalb eines Biosicherheitsschranks ein Mikro-Well-Array in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte einführen (Abbildung 2B ).
  2. Kortikale Neuronisolation aus Rattenföten
    1. Füge ~ 20 ml Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS) zu jedem von vier bis sechs 10 cm Petrischalen (eine für jedes seziertes Gewebe) in einem Biosicherheitsschrank hinzu. Übertragen Sie diese Gerichte zu einer Dissektionshaube und legen Sie sie auf Eis. Sterilisieren Sie Dissektionsinstrumente, wie Mikroskalpelle, Scheren und Pinzetten, mit einem heißen Wulst-Sterilisator.
    2. Vorwarmes embryonales Neuron basales Medium + 2% serumfreies Supplement + 0,4 mM L-Glutamin (hier als "Kulturmedium" bezeichnet)R) und 0,25% Trypsin + 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei 37 ° C. Tau-Desoxyribonuklease (DNase) I durch Platzieren bei Raumtemperatur. Vorbereiten von 1,5 ml einer 0,15 mg / ml DNAse I-Lösung in HBSS und Aufrechterhalten der Lösung auf Eis.
    3. Euthanasieren Sie eine zeitlich schwangere Embryon-Tag-18-Ratte durch Kohlendioxid-Inhalation und bestätigen Sie den Tod durch Enthauptung. Übertragen Sie die Karkasse zu einer sterilen Dissektionshaube und legen Sie sie ventral nach oben. Spülen Sie den Bauch gründlich mit 70% Ethanol.
    4. Öffnen Sie den Uterus und entfernen Sie die Föten (meist ~ 11) aus den Fruchtwassersäcken mit einer Schere und übertragen Sie sie mit einer Pinzette zu einer Petrischale mit kaltem HBSS, wie beschrieben 48 . Legen Sie einen gekühlten (-20 ° C) Granitblock unter das Stereoskop. Legen Sie die Petrischale auf die Oberfläche dieses kalten Blocks, um die niedrige Temperatur des HBSS während des Dissektionsprozesses zu erhalten.
    5. Spülen Sie die Welpen, indem Sie die HBSS herumschwingen und dann auf das nächste saubere Teller übertragenHBSS enthalten. Mit Hilfe des Stereoskops und der Sektionsinstrumente entfernen Sie nacheinander die Köpfe, die zerebralen Hemisphären und die Kortizes der Föten und übertragen jedes Gewebe mit einer Pinzette nach jeder Sektion auf eine neue HBSS-gefüllte Schale.
    6. Aspirieren Sie nur die Cortices mit einer Pasteurpipette und legen Sie das Gewebe in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Verwerfe die anderen zerlegten Gewebe. Spülen Sie die Cortices dreimal durch sequentielles Hinzufügen und Entfernen von ~ 5 ml HBSS mit einer serologischen Pipette. Legen Sie den Schlauch auf Eis, wenn nicht in Gebrauch.
    7. Übertragen Sie die Cortices mit einer Pasteurpipette auf ein 15-ml-Röhrchen, das vorgewärmtes Trypsin-EDTA (4-6 Cortices pro 5 ml Trypsin-EDTA) enthält. Manuell das Röhrchen einmal rühren und auf 37 ° C stellen. Umkehren Sie die Tube alle 3 min, um zu verhindern, dass das Gewebe verklumpt wird.
    8. Stoppen Sie die Exposition gegenüber Trypsin nach ~ 10 min, indem Sie das Gewebe mit einer Pasteurpipette entfernen und auf eine saubere 15-ml-Zentrifuge übertragenTube. Füge die 0,15 mg / ml DNase I-Lösung (1,5 ml) mit einer Pipette zum Röhrchen hinzu.
    9. Verwenden Sie eine Pasteurpipette, um Gewebeklumpen manuell aufzubrechen und dann vorzuräumen (~ 30 s), bis die Lösung homogen erscheint und es keine verbleibenden Gewebefragmente in der Flüssigkeit gibt. Wenn es nicht möglich ist, die Lösung vollständig zu homogenisieren, extrahieren Sie die unlöslichen Fragmente, indem Sie sie in die Spitze einer Pasteurpipette ziehen.
    10. Zentrifugieren der in Schritt 2.2.9 erhaltenen homogenen Zelllösung bei 200 xg für 3 min. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pasteurpipette und achten Sie darauf, die pelletierten Zellen nicht zu stören. Füge 2 ml Kulturmedium mit einer serologischen Pipette hinzu und verwirre, um die Zellen zu resuspendieren.
    11. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in der in Schritt 2.2.10 hergestellten Lösung unter Verwendung eines Hämocytometers; Die erwartete Ausbeute beträgt 3,0-5,0 x 10 6 Zellen / kortikale Hemisphäre. 1 ml oder mehr Zellsuspension im Kulturmedium mit einer Dichte von 1,0-2,0 x 10 & sup6; Zellen / ml zubereiten.
  3. Bildung von neuronalen Zellaggregaten
    1. Mit einer Mikropipette fügen Sie 12 μl der 1,0-2,0 x 10 6 / mL Zellsuspension in jede Mikro-Vertiefung des PDMS-Arrays hinzu (das in Schritt 2.1.7 in die Platte gelegt wurde).
      HINWEIS: Die Zellkonzentration kann in Abhängigkeit von der Mikrosäulen-ID und der gewünschten Zell-Aggregat-Größe eingestellt werden, da höhere Konzentrationen größere Aggregate ergeben.
    2. Zentrifugieren der Platte bei 200 xg für 5 min, um die Aggregation von Zellen an der Unterseite der Mikro-Vertiefungen zu zwingen ( 2B ). Sorgfältig fügen Sie ~ 2 ml Kulturmedium an die Spitze jedes PDMS-Arrays, um alle geimpften Mikro-Brunnen zu decken, wobei darauf geachtet wird, dass die aggregierten Zellen nicht gestört werden.
    3. Wenn die Zellen nicht mit einem viralen Vektor transduziert werden, inkubieren Sie die Platte für 12-24 h bei 37 ° C und 5% CO 2 und gehen dann weiter zu Abschnitt 3. Wenn die Aggregate transduziert werden, überspringen Sie die Inkubation und fahren Sie mit Abschnitt 2.4 fort .
  4. TranSduktion mit einem viralen Vektor zur Beobachtung der Kalziumsignalisierung
    Anmerkung: Diese Schritte werden durchgeführt, um Neuronen mit einem viralen Vektor zu transduzieren, der einen genetisch codierten Calciumindikator (GECI) enthält. Die in diesem Artikel gezeigten Ergebnisse wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Adeno-assoziierten Virus (AAV) (Serotyp 1) mit GCaMP6f, einem GECI mit schneller Kinetik bestehend aus grünem Fluoreszenzprotein (GFP), Calmodulin (CaM) und dem M13-Peptid, Angetrieben durch den menschlichen Synapsin I-Promotor. Die virale Vektorlösung kann eine Verdünnung in sterilem DPBS vor der Transduktion erfordern, abhängig von der Konzentration der Stammlösung. Zell-Gesundheit / Morphologie und GCaMP6f Signalstärke muss im Laufe der Zeit für eine Reihe von Vektor-Konzentrationen beobachtet werden. Diese Optimierungsprozedur muss von jedem Forscher durchgeführt werden, um den geeigneten Titer für ihre eigenen Zellkulturen zu bestimmen. Die typische GCaMP6f-Expressionszeit beträgt 7-8 Tage nach der Transduktion, die während der Inkubation in stEp 2.4.2.
    1. Mit einer Mikropipette fügen Sie das erforderliche Volumen der viralen Vektorlösung (für eine Endkonzentration von ~ 3,0 x 10 9 genomischen Kopien pro Aggregat) dem Kulturmedium hinzu, das die Aggregate bedeckt. Langsam Pipettieren nach oben und unten, um sicherzustellen, dass die Vektorlösung homogen im gesamten Kulturmedium verteilt ist.
    2. Inkubieren Sie die Platte mit den seedierten pyramidenförmigen Mikro-Vertiefungen für 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2 , um die virale Transduktion von GCaMP6f zu ermöglichen.

3. Entwicklung der zellulären Komponente von Mikro-TENNs

  1. ECM Kernfertigung
    1. Nach der aggregierten Inkubation fügen Sie Typ I Kollagen und Laminin dem Kulturmedium (für eine Konzentration von jeweils 1 mg / ml) in einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, um die ECM-Lösung herzustellen. Führen Sie die Schritte 3.1.2-3.1.4 bei Raumtemperatur durch, aber pflegen Sie das Röhrchen mit ECM auf Eis, wenn es nicht benutzt wird, um eine vorzeitige Gelierung zu verhindern.
      HINWEIS: Der typische Aufwand beträgt 4 μl ECM-Lösung für jede Mikrosäule (Länge: 5 mm, ID: 180 μm).
    2. Den pH-Wert der ECM-Lösung durch Übertragen von 1-2 & mgr; l auf Lackmuspapier einstellen, um den anfänglichen pH-Wert zu verifizieren, wobei 1 & mgr; l 1 N Natriumhydroxid (NaOH) und / oder 1 N Salzsäure (HCl) Und wiederholen, bis der pH-Wert 7,2-7,4 ist. Sicherstellen einer Homogenisierung der ECM-Lösung durch Pipettieren auf und ab, während die Bildung von Luftblasen vermieden wird.
    3. Übertragen Sie die Mikrosäulen mit sterilisierter Pinzette aus dem Geschirr in Schritt 1.4.3, um 35- oder 60-mm-Petrischalen zu entleeren. Arbeiten Sie an 4-5 Mikrosäulen zu einer Zeit, um Austrocknung zu verhindern. Befestigen Sie eine 10-μl-Spitze, die an einer 1000-μL-Spitze an einer Mikropipette befestigt ist. Mit dem Stereoskop zur visuellen Führung legen Sie die Spitze an einem Ende der Mikrosäulen und saugen, um restliche DPBS und Luftblasen aus dem Lumen zu extrahieren.
    4. Schnelles Auftragen von 4-5 μl ECM in einer Mikropipette. Beobachtung unter einem steReoscope, platzieren Sie die Spitze der Mikropipette an einem der Enden der Mikrosäulen und entladen Sie genug ECM, um das Lumen zu füllen. Bestätigen Sie die Abwesenheit von Luftblasen im Lumen, da diese das axonale Auswachsen durch das ECM hemmen können. Wenn Luftblasen vorhanden sind, entfernen Sie das ECM, wie in Schritt 3.1.3 erläutert, und fügen Sie das ECM erneut hinzu.
    5. Um eine Dehydratation zu verhindern, fügen Sie ~ 2 μl ECM um jede Mikrosäule hinzu. Inkubieren der Hydrogel / ECM-Mikrosäulen in den Petrischalen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 25 min. Gehen Sie sofort nach der Inkubation zur Zellseedingung.
      HINWEIS: Die Inkubationszeit in Schritt 3.1.5 soll die Zeit für die Polymerisation von Kollagen und Laminin innerhalb der Mikrosäulen ermöglichen.
  2. Neuronale Zellsäen in den Mikrosäulen
    HINWEIS: Um das Kulturmedium der transduzierten Aggregate zu wechseln, neigen Sie die Platte, verwenden Sie eine Mikropipette, um das Medium zu entfernen, das an der Wand des Brunnens blinkt, und fügen Sie dann langsam ~ 1 ml gegen die(Um die Aggregate in den pyramidenförmigen Mikro-Brunnen zu stören). Wiederholen Sie diese Mitteländerung ein zweites Mal.
    1. Nach der Inkubationszeit in Schritt 3.1.5 übergeben Sie etwa 10-20 μl Kulturmedium auf zwei freie Bereiche in den Petrischalen, die die Mikrosäulen halten. Verwenden Sie eine Mikropipette, um die Aggregate einzeln auf die Petrischale zu übertragen, die die Konstrukte enthält, und verschieben Sie sie mit einer Pinzette zu einem der kleinen Becken des Kulturmediums, um die Zellgesundheit zu erhalten.
    2. Bei der Beobachtung unter einem Stereoskop ein Aggregat an jedem Ende der Mikrosäulen für bidirektionale Mikro-TENNs oder an einem Ende für eine unidirektionale Architektur (wie gewünscht) mit Pinzette einfügen. Bestätigen Sie die Platzierung der Aggregate innerhalb der Mikrosäulen mit dem Stereoskop. Verwenden Sie Pinzette, um die geimpften Mikro-Säulen in den anderen kleinen Pool von Kulturmedium zu bewegen, um Austrocknung zu vermeiden und die gesundheitliche Gesundheit zu bewahren.
    3. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 45 min zu aLlow die Aggregate, um das ECM zu halten. Vergewissern Sie sich, dass die Aggregate an den Enden der Mikrosäulen mit dem Stereoskop verbleiben; Die Zelle Aggregate wieder einführen und den Inkubationsschritt nach Bedarf wiederholen.
    4. Die Petrischalen, die die Mikro-TENNs enthalten, sorgfältig mit Kulturmedium (3 oder 6 ml für eine 35 bzw. 60 mm Petrischale) mit einer serologischen Pipette überschwemmen. Legen Sie das Geschirr in einen Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 für Langzeitkultur.
    5. Führen Sie Halbmedienwechsel alle 2 Tage mit Kulturmedium durch. Entfernen Sie die Hälfte des alten Mediums vorsichtig mit einer Pipette und verwenden Sie das Stereoskop zur visuellen Führung, um ein Absaugen der Mikro-TENNs zu vermeiden. Ersetzen Sie durch langsames Hinzufügen von frischem, vorgewärmtem Medium mit einer Pipette.
    6. Zur Wiederverwendung der PDMS-Mikro-Well-Arrays, entfernen Sie das Kulturmedium, kochen die Arrays in deionisiertem Wasser für 30 min und sterilisieren in einem Autoklaven für eine weitere Runde der Aggregatbildung und Kultur.
      HINWEIS: Zu den gewünschten ZeitpunktenDie Cytoarchitektur von Mikro-TENNs kann mittels Phasenkontrastmikroskopie nachgewiesen werden. Hier wurde eine Belichtungszeit von 5-8 ms und 10X (0,64 μm / pixel) und 20X (0,32 μm / pixel) Ziele verwendet, um die Phasenkontrastbilder zu erfassen. Die Fluoreszenz, die mit den Calciumkonzentrationsveränderungen in viral transduzierten Mikro-TENNs assoziiert ist, wurde unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskops mit einer Belichtungszeit von 50 ms, einem 10fachen Objektiv (0,64 & mgr; m / Pixel) und einem Festkörperlicht mit Bandpassfiltern von 480 aufgenommen Nm und ~ 510 nm zur Anregung bzw. Emission, um das GCaMP6f-Fluoreszenzsignal zu visualisieren.

4. Immunzytochemie für In-Vitro- Studien

Hinweis: Für die hier gezeigten Bilder wurden folgende primäre Antikörper verwendet: Maus-Anti-Tuj-1 / beta-III-Tubulin (1: 500) und Kaninchen-Anti-Synapsin-1 (1: 500) für die Markierung von Axonen und Pre -synaptische Boutons. Die sekundären Antikörper waren Esel anti-Mouse 568 (1: 500) und Esel Anti-Kaninchen 488 (1: 500). Die erforderlichen Volumina der vorbereiteten primären und sekundären Antikörperlösungen sowie die Volumina des Formaldehyds, des Pferdeserums und der Detergenslösungen hängen von dem Volumen ab, das zur vollständigen Bedeckung der Konstrukte erforderlich ist. Diese Volumina können unter Verwendung eines hydrophoben Barrierestiftes minimiert werden, um den Bereich zu umgeben, der jede Mikrosäule umgibt.

ACHTUNG: Dieser Abschnitt verwendet Formaldehyd und Hoechst. Formaldehyd ist eine toxische Verbindung, von der bekannt ist, dass sie krebserzeugend ist, und Hoechst ist ein bekanntes Mutagen. Daher müssen diese Verbindungen in einem geeigneten Abfallbehälter entsorgt werden. Behandeln Sie sie immer in einer chemischen Dunstabzugshaube, während Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung verwenden, wie zB ein Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe.

  1. Bereiten Sie eine 4,0% Volumen / Volumen (v / v) Formaldehydlösung in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer chemischen Dunstabzugshaube vor.
  2. Das Kulturmedium aus den Petrischalen entfernenNg die Mikro-TENNs mit einer Mikropipette. Fügen Sie genügend Volumen der Formaldehyd-Lösung zu den Gerichten, um die Mikro-TENNs vollständig zu bedecken. Die Mikro-TENNs in der Formaldehydlösung für 35 min bei 18-24 ° C einweichen, um die Zellen innerhalb der Mikrosäulen zu fixieren.
  3. Entfernen Sie die 4,0% ige Formaldehydlösung aus den Petrischalen mit einer Pipette und entsorgen Sie sie nach den entsprechenden Richtlinien für gefährliche Stoffe.
  4. Führen Sie zwei schnelle Spülungen durch, indem Sie genug PBS hinzufügen, um die festen Mikro-TENNs vollständig zu bedecken und dann das PBS mit einer Pipette zu entfernen. Führen Sie eine dritte lange Spülung durch Einweichen der Konstrukte in der PBS für 10 min.
    ACHTUNG: Das PBS, das zum Spülen verwendet wird, verwerfen, das möglicherweise Spuren von Formaldehyd enthält.
  5. Vorbereitung einer 0,3% v / v Lösung von nichtionischem Detergens in 4% v / v Pferdeserum in PBS. Entfernen Sie das PBS aus den Petrischalen, die die festen Mikro-TENNs enthalten, und fügen Sie ein ausreichendes Volumen der 0,3% Detergenslösung hinzu, um die Konstrukte zu bedecken. Einweichen für 60 min bei 18-24 & #176, C, um die Zellen zu permeabilisieren.
  6. Entfernen Sie die Waschmittellösung mit einer Pipette. Führen Sie zwei schnelle Spülungen durch Hinzufügen und anschließend Entfernen der PBS. Danach drei längere Spülungen durch Einweichen der Konstrukte in PBS für 5 min bei jedem Spülen durchführen.
  7. Primäre Antikörper in 4% Pferdeserum verdünnen Entfernen Sie die PBS aus den Petrischalen, die die fixierten und permeabilisierten Mikro-TENNs enthalten. Fügen Sie genügend primäre Antikörperlösung zu den Mikrosäulen hinzu, um sie vollständig zu bedecken. Die Petrischalen mit Parafilm versiegeln, um Verdunstung zu verhindern und über Nacht (12-16 h) bei 4 ° C zu inkubieren.
  8. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung aus dem Geschirr und spülen Sie, wie in Schritt 4.6 erläutert. Im Dunkeln die sekundäre Antikörperlösung in 4,0% Pferdeserum vorbereiten. Fügen Sie genügend sekundäre Antikörperlösung hinzu, um die Konstrukte vollständig zu bedecken, die Schalen mit Aluminiumfolie zu bedecken und für 2 h bei 18-24 ° C zu inkubieren.
  9. Bereiten Sie die Hoechst-Lösung (1: 10.000) in PBS vor, um die Kerne zu färben.
  10. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und inkubieren Sie die Mikro-TENNS in der Hoechst-Lösung für 10 min bei 18-24 ° C. Führen Sie fünf Spülungen mit PBS, jeweils für 5-10 min. Die Petrischale mit PBS abdecken, um die gefärbten Mikro-TENNs zu bedecken, die Schale in Aluminiumfolie zu wickeln und bei 4 ° C zu lagern, bis die Bildgebung durchgeführt wird.
    HINWEIS: Bilder für die immunolierten Mikro-TENNs wurden mit einem Laser-konfokalen Mikroskop mit einer Auflösung von 2.048 (~ 8 s / Rahmen), einer 10fachen Objektiv- (0,64 μm / Pixel), 487-nm-Anregung und ~ 525 nm Emissionswellenlängen aufgenommen Grüne Fluoreszenz, 561 nm Anregung und ~ 595 nm Emissionswellenlängen für rote Fluoreszenz und ~ 3,22 μm / Scheibe mit ~ 60 Scheiben im Durchschnitt für die z-Stacks.

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Ergebnisse

Mikro-TENNs wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie zur Bewertung ihrer Cytoarchitektur und des axonalen Auswuchses untersucht (Abbildung 4 ). Innerhalb unidirektionaler, 2 mm langer Mikro-TENNs wurden neuronale Aggregate auf ein Ende der Mikrosäule beschränkt und ein Bündel von Axonen durch den inneren Kern projiziert. Axone überspannten die gesamte Länge der Säule um 5 Tage in vitro (DIV) ( Abbildung 4A ). Es gab eine größere anfängliche axon...

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Diskussion

ZNS-Verletzungen und Erkrankungen führen typischerweise zu einem Verlust oder einer Dysfunktion der Langstrecken-Axonalwege, die das Gehirn-Verbund umfassen, mit oder ohne begleitende neuronale Degeneration. Dies wird durch die begrenzte Kapazität des ZNS ergänzt, um die Neurogenese und Regeneration zu fördern. Trotz der Verfolgung von Reparaturstrategien wie Wachstumsfaktor, Zelle und Biomateriallieferung als einzelne oder kombinatorische Ansätze scheitern diese Techniken gleichzeitig sowohl für die Degeneration von ne...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die finanzielle Unterstützung wurde von den National Institutes of Health U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) und F31-NS090746 (Katiyar)), der Michael J. Fox Foundation (Therapeutic Pipeline Program # 9998 (Cullen)), Die Penn Medicine Neuroscience Center Pilot Award (Cullen), die National Science Foundation (Graduate Research Fellowships DGE-1321851 (Struzyna und Adewole)), die Abteilung für Veteranen Angelegenheiten (RR & D Merit Review # B1097-I (Cullen)), die American Association Der neurologischen Chirurgen und des Kongresses der neurologischen Chirurgen (2015-2016 Codman-Stipendium in Neurotrauma und Critical Care (Petrov)) und der US Army Medical Research und Materiel Command (# W81XWH-13-207004 (Cullen) und W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
LaserschneiderUniversal Laser SystemsPLS4.75Wird zur Herstellung der lasergeschnittenen Mikrokanalform verwendet.
Lasergeschnittene Vorrichtung zur Herstellung von MikrosäulenSonderanfertigung--------------Kontaktieren Sie unsere Forschungsgruppe, wenn Sie interessiert sind. Abmessungen und Blaupausen, die im Manuskript bereitgestellt werden.
Schrauben----------------------------#4-40 mit einem Gewindedurchmesser von 3,05 mm
Muttern----------------------------#4-40 mit einem Gewindedurchmesser von 3,05 mm
Akupunkturnadel (180 & Mikro; m Durchmesser)Lhasa Medicalsj.16X40Der Durchmesser kann je nach gewünschter Größe für das Mikrosäulenlumen variiert werden.
PetrischaleFisher08772B
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)Invitrogen14200075
Polystyrol serologische EinwegpipetteFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Kapillarröhrchen (398 & Mikro; m Durchmesser)Fisher21170DDer Durchmesser kann je nach gewünschter Größe für die Mikrosäulenschale variiert werden.
HeizplatteFisherSP88857200
MagnetstabFisher1451352
MikropipetteSigmaZ683884-1EA
25 mm Gauge NadelFisher14-826-49
MikroskalpellRoboz SurgicalRS-6270
SchereFine Science Tools14081-09
PinzetteWorld Precision Instruments501985
HeißperlensterilisatorSigmaZ378550-1EA
StereoskopNikonSMZ800NWird für alle Dissektionsschritte und für die Mikro-TENN-Fertigung verwendet.
Rattenschwanz Typ I KollagenCorning354236bei 4 º C und nur bei Bedarf entfernen.  Verwenden Sie Eis, um die Temperatur während des Gebrauchs zu erhalten.
MikrozentrifugenröhrchenFisher02-681-256
Maus LamininCorning354232Beibehalten bei 4 & ordm; C und nur bei Bedarf entfernen.  Verwenden Sie Eis, um die Temperatur während des Gebrauchs zu erhalten.
Neurobasales MediumInvitrogen21103049Basalmedium für die Kultivierung von pränatalen und embryonalen neuronalen Zellen. Bei 4& ordm lagern; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
Natriumhydroxid (NaOH)FisherSS2661
Salzsäure (HCl)FisherSA48-1
LackmuspapierFisher09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)Invitrogen14170112Bei 4 & ordm;C lagern.
0,25 % Trypsin-EDTAInvitrogen25200056Lagern bei -20 & ordm; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
Pankreas-Desoxyribonuklease (DNase) bei Rinderpankreas ISigma10104159001lagern bei -20 º C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
B-27 SupplementInvitrogen12587010Supplement zu Neurobasalem Medium für die Kultur von hippokampalen und kortikalen Neuronen. Bei -20 € lagern; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
L-Glutamin Invitrogen35050061Lagern bei -20 & ordm; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
Sprague Dawley embryonaler Tag 18 RattenCharles RiverStamm 001
Pasteur-PipetteFisher22-042816
15 mL ZentrifugenröhrchenEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
ZentrifugeFisher05-413-115
HämozytometerFisher02-671-6
Objet30 3D-DruckerStratasys --------------Wird zur Herstellung der pyramidenförmigen Mikrowell-Formen verwendet.
3D-gedruckte pyramidenförmige Well-FormMaßanfertigung--------------Kontaktieren Sie unsere Forschungsgruppe, wenn Sie interessiert sind. Abmessungen und Blaupausen, die im Manuskript bereitgestellt werden.
Polydimethylsiloxan (PDMS) und HärterFisherNC9285739Kommt als Kit mit Elastomer und Härter. Verwendung in einem chemischen Abzug.
TrichterFisher10-348C
1 ml PipettenbirneSigmaZ509035
MikrospatelFisherS50821
12-Well-KulturplatteEMESCO1194-353043
OfenFisher11-475-154
InkubatorFisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373Bei -80°C lagern. Kommerziell erhältliches Adeno-assoziiertes Virus (AAV) mit dem GCaMP6f-Calciumindikator.
Formaldehyd 40%FisherF77P-4Formaldehyd ist eine giftige Verbindung, die als krebserregend bekannt ist und in einem separaten Behälter entsorgt werden muss.
Triton X-100SigmaT8787Nichtionisches Tensid zur Permeabilisierung von Zellmembranen.
PferdeserumGibco16050-122
Maus Anti-Tuj-1/beta-III Tubulin PrimärantikörperSigmaT8578-200ULBei -20°C lagern.
Kaninchen Anti-Synapsin 1 primärer AntikörperSynaptic Systems106-001Bei -20°C lagern.
Donkey anti-mouse 568 SekundärantikörperInvitrogenA10037Bei 4&C lagern.
Donkey anti-rabbit 488 SekundärantikörperInvitrogenA21206Bei 4&C lagern.
Hoechst 33342, TrihydrochloridInvitrogenH3570Lagern bei 4&C.  Hoechst ist ein bekanntes Mutagen, das als krebserregend behandelt werden sollte. Daher muss es in einem separaten Behälter entsorgt werden.
A1RSI Konfokales Laserscanning-Mikroskop Nikon--------------Wird für die Aufnahme von konfokalen Rekonstruktionen von immunmarkierten Konstrukten verwendet.
Eclipse Ti-S Mikroskop Nikon--------------Wird für die Aufnahme von Phasenkontrastbildern verwendet. Bei der digitalen Bilderfassung mit einer QiClick-Kamera, die mit der Nikon Elements Basic Research Software (4.10.01) verbunden ist.
Hochgeschwindigkeits-FluoreszenzmikroskopNikon--------------Nikon Eclipse Ti Mikroskop gepaart mit einer ANDOR Neo/Zyla Kamera für die Kalziumbildgebung.
NIS Elements AR 4.50.00 SoftwareNikon Instruments--------------Wird verwendet, um Kalziumtransienten aus den Aufnahmen zu identifizieren, die mit dem Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden. 

Referenzen

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