Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Summary

Dieses Manuskript beschreibt die Herstellung von mikrogewebetechnischen neuronalen Netzen: dreidimensionale mikrometergroße Konstrukte, die aus lang ausgerichteten axonalen Traktaten bestehen, die aggregierte neuronale Populationen umfassen, die in einem tubulären Hydrogel umhüllt sind. Diese lebenden Gerüste können als funktionelle Relais dienen, um neuronale Schaltkreise zu rekonstruieren oder zu modulieren oder als biofidelische Testbetten, die grau-weiße Materie Neuroanatomie nachahmen.

Abstract

Die funktionelle Erholung tritt nach der Verletzung oder der krankheitsinduzierten Degeneration im zentralen Nervensystem (ZNS) aufgrund der hemmenden Umgebung und der begrenzten Neurogenesefähigkeit häufig auf. Wir entwickeln eine Strategie, um gleichzeitig den neuronalen und axonalen Wegverlust innerhalb des beschädigten ZNS zu adressieren. Dieses Manuskript stellt das Herstellungsprotokoll für Mikrogewebe-konstruierte neuronale Netze (Mikro-TENNs) dar, implantierbare Konstrukte, bestehend aus Neuronen und ausgerichteten axonalen Traktaten, die das extrazelluläre Matrix- (ECM-) Lumen eines vorgeformten Hydrogelzylinders umhängen, der Hunderte Mikrometer Durchmesser aufweist, der sich in Zentimeter erstrecken kann in Länge. Neuronale Aggregate sind auf die Extreme der dreidimensionalen Umhüllung abgegrenzt und werden durch axonale Projektionen überspannt. Micro-TENNs sind einzigartig als Strategie für den ZNS-Rekonstruktion, emulieren Aspekte der Gehirn-Connectome-Cytoarchitektur und potenziell Bereitstellung von Mitteln für den Netzaustausch. Die neuRonale Aggregate können mit Wirtsgewebe synapsen, um neue funktionale Relais zu bilden, um fehlende oder beschädigte Schaltkreise wiederherzustellen und / oder zu modulieren. Diese Konstrukte können auch als proregenerative "lebende Gerüste" fungieren, die in der Lage sind, Entwicklungsmechanismen für die Zellmigration und die axonale Pfadfindung zu nutzen, wobei synergistische strukturelle und lösliche Cues auf der Grundlage des Regenerationszustandes vorhanden sind. Mikro-TENNs werden hergestellt, indem flüssiges Hydrogel in eine zylindrische Form gegossen wird, die eine in Längsrichtung zentrierte Nadel enthält. Sobald das Hydrogel geliert ist, wird die Nadel entfernt, wobei eine hohle Mikrosäule zurückbleibt. Eine ECM-Lösung wird dem Lumen zugesetzt, um eine Umgebung bereitzustellen, die für neuronale Adhäsion und axonales Auswachsen geeignet ist. Dissoziierte Neuronen werden für eine präzise Aussaat innerhalb eines oder beider Enden der Mikrosäule mechanisch aggregiert. Diese Methodik produziert zuverlässig selbständige Miniatur-Konstrukte mit langprojektiven axonalen Traktaten, die Merkmale der Hirnneuroanatomie rekapitulieren können. Synaptic immUnauffällige und genetisch codierte Calciumindikatoren deuten darauf hin, dass Mikro-TENNs eine weitgehende synaptische Verteilung und intrinsische elektrische Aktivität besitzen. Folglich stellen Mikro-TENNs eine vielversprechende Strategie für eine gezielte neurochirurgische Rekonstruktion von Gehirnwegen dar und können auch als biofidelische Modelle zur Untersuchung neurobiologischer Phänomene in vitro angewendet werden .

Introduction

Ein gemeinsames Merkmal von Erkrankungen und Erkrankungen des Zentralnervensystems (ZNS), wie z. B. traumatische Hirnverletzungen (TBI), Rückenmarksverletzungen (SCI), Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, ist die Trennung von axonalen Bahnen und neuronaler Zelle Verlust ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Zum Beispiel, wenn ein ischämischer Schlaganfall unbehandelt wird, wird geschätzt, dass Axone mit einer Rate von 7 Meilen von Axonen pro Minute

Protocol

Alle Verfahren, die Tiere betreffen, wurden von den Institutional Animal Care und Use Committees an der University of Pennsylvania und dem Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center genehmigt und beachteten die Richtlinien, die in der NIH Public Health Service Policy für Humane Care und Use of Laboratory dargelegt wurden Tiere (2015).

1. Entwicklung des Agarose-Hydrogels (Acelluläre Komponente von Mikro-TENNs)

1. Agarose-Lösungsvorbereitung
   1. In einem Biosicherheitsschrank werden Reservoirs für die Mikrosäulen vorbereitet, indem 20 ml Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) in jede ....

Results

Mikro-TENNs wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie zur Bewertung ihrer Cytoarchitektur und des axonalen Auswuchses untersucht (Abbildung 4 ). Innerhalb unidirektionaler, 2 mm langer Mikro-TENNs wurden neuronale Aggregate auf ein Ende der Mikrosäule beschränkt und ein Bündel von Axonen durch den inneren Kern projiziert. Axone überspannten die gesamte Länge der Säule um 5 Tage in vitro (DIV) ( Abbildung 4A ). Es gab eine größere anfängliche axon.......

Discussion

ZNS-Verletzungen und Erkrankungen führen typischerweise zu einem Verlust oder einer Dysfunktion der Langstrecken-Axonalwege, die das Gehirn-Verbund umfassen, mit oder ohne begleitende neuronale Degeneration. Dies wird durch die begrenzte Kapazität des ZNS ergänzt, um die Neurogenese und Regeneration zu fördern. Trotz der Verfolgung von Reparaturstrategien wie Wachstumsfaktor, Zelle und Biomateriallieferung als einzelne oder kombinatorische Ansätze scheitern diese Techniken gleichzeitig sowohl für die Degeneration von ne.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laserschneider	Universal Laser Systems	PLS4.75	Wird zur Herstellung der lasergeschnittenen Mikrokanalform verwendet.
Lasergeschnittene Vorrichtung zur Herstellung von Mikrosäulen	Sonderanfertigung	--------------	Kontaktieren Sie unsere Forschungsgruppe, wenn Sie interessiert sind. Abmessungen und Blaupausen, die im Manuskript bereitgestellt werden.
Schrauben	--------------	--------------	#4-40 mit einem Gewindedurchmesser von 3,05 mm
Muttern	--------------	--------------	#4-40 mit einem Gewindedurchmesser von 3,05 mm
Akupunkturnadel (180 & Mikro; m Durchmesser)	Lhasa Medical	sj.16X40	Der Durchmesser kann je nach gewünschter Größe für das Mikrosäulenlumen variiert werden.
Petrischale	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrol serologische Einwegpipette	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Kapillarröhrchen (398 & Mikro; m Durchmesser)	Fisher	21170D	Der Durchmesser kann je nach gewünschter Größe für die Mikrosäulenschale variiert werden.
Heizplatte	Fisher	SP88857200
Magnetstab	Fisher	1451352
Mikropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm Gauge Nadel	Fisher	14-826-49
Mikroskalpell	Roboz Surgical	RS-6270
Schere	Fine Science Tools	14081-09
Pinzette	World Precision Instruments	501985
Heißperlensterilisator	Sigma	Z378550-1EA
Stereoskop	Nikon	SMZ800N	Wird für alle Dissektionsschritte und für die Mikro-TENN-Fertigung verwendet.
Rattenschwanz Typ I Kollagen	Corning	354236	bei 4 º C und nur bei Bedarf entfernen.  Verwenden Sie Eis, um die Temperatur während des Gebrauchs zu erhalten.
Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher	02-681-256
Maus Laminin	Corning	354232	Beibehalten bei 4 & ordm; C und nur bei Bedarf entfernen.  Verwenden Sie Eis, um die Temperatur während des Gebrauchs zu erhalten.
Neurobasales Medium	Invitrogen	21103049	Basalmedium für die Kultivierung von pränatalen und embryonalen neuronalen Zellen. Bei 4& ordm lagern; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
Natriumhydroxid (NaOH)	Fisher	SS2661
Salzsäure (HCl)	Fisher	SA48-1
Lackmuspapier	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Bei 4 & ordm;C lagern.
0,25 % Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Lagern bei -20 & ordm; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
Pankreas-Desoxyribonuklease (DNase) bei Rinderpankreas I	Sigma	10104159001	lagern bei -20 º C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
B-27 Supplement	Invitrogen	12587010	Supplement zu Neurobasalem Medium für die Kultur von hippokampalen und kortikalen Neuronen. Bei -20 € lagern; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
L-Glutamin	Invitrogen	35050061	Lagern bei -20 & ordm; C und warm bei 37 ° C; C vor Gebrauch.
Sprague Dawley embryonaler Tag 18 Ratten	Charles River	Stamm 001
Pasteur-Pipette	Fisher	22-042816
15 mL Zentrifugenröhrchen	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Zentrifuge	Fisher	05-413-115
Hämozytometer	Fisher	02-671-6
Objet30 3D-Drucker	Stratasys	--------------	Wird zur Herstellung der pyramidenförmigen Mikrowell-Formen verwendet.
3D-gedruckte pyramidenförmige Well-Form	Maßanfertigung	--------------	Kontaktieren Sie unsere Forschungsgruppe, wenn Sie interessiert sind. Abmessungen und Blaupausen, die im Manuskript bereitgestellt werden.
Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter	Fisher	NC9285739	Kommt als Kit mit Elastomer und Härter. Verwendung in einem chemischen Abzug.
Trichter	Fisher	10-348C
1 ml Pipettenbirne	Sigma	Z509035
Mikrospatel	Fisher	S50821
12-Well-Kulturplatte	EMESCO	1194-353043
Ofen	Fisher	11-475-154
Inkubator	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Bei -80°C lagern. Kommerziell erhältliches Adeno-assoziiertes Virus (AAV) mit dem GCaMP6f-Calciumindikator.
Formaldehyd 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyd ist eine giftige Verbindung, die als krebserregend bekannt ist und in einem separaten Behälter entsorgt werden muss.
Triton X-100	Sigma	T8787	Nichtionisches Tensid zur Permeabilisierung von Zellmembranen.
Pferdeserum	Gibco	16050-122
Maus Anti-Tuj-1/beta-III Tubulin Primärantikörper	Sigma	T8578-200UL	Bei -20°C lagern.
Kaninchen Anti-Synapsin 1 primärer Antikörper	Synaptic Systems	106-001	Bei -20°C lagern.
Donkey anti-mouse 568 Sekundärantikörper	Invitrogen	A10037	Bei 4&C lagern.
Donkey anti-rabbit 488 Sekundärantikörper	Invitrogen	A21206	Bei 4&C lagern.
Hoechst 33342, Trihydrochlorid	Invitrogen	H3570	Lagern bei 4&C.  Hoechst ist ein bekanntes Mutagen, das als krebserregend behandelt werden sollte. Daher muss es in einem separaten Behälter entsorgt werden.
A1RSI Konfokales Laserscanning-Mikroskop	Nikon	--------------	Wird für die Aufnahme von konfokalen Rekonstruktionen von immunmarkierten Konstrukten verwendet.
Eclipse Ti-S Mikroskop	Nikon	--------------	Wird für die Aufnahme von Phasenkontrastbildern verwendet. Bei der digitalen Bilderfassung mit einer QiClick-Kamera, die mit der Nikon Elements Basic Research Software (4.10.01) verbunden ist.
Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskop	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti Mikroskop gepaart mit einer ANDOR Neo/Zyla Kamera für die Kalziumbildgebung.
NIS Elements AR 4.50.00 Software	Nikon Instruments	--------------	Wird verwendet, um Kalziumtransienten aus den Aufnahmen zu identifizieren, die mit dem Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen wurden.