Ein Multi-Loch Cryovial Eliminiert Einfrieren Artefakte, wenn Muskelgewebe wird in flüssigem Stickstoff direkt tauchend

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren Muskelgewebe einzufrieren, indem sie direkt in flüssigen Stickstoff tauchen. Dieses Protokoll zeigt auch eine neue Cryovial, die den „Decke-Effekt“ von Stickstoffgas, wenn flüssiger Stickstoff in Kontakt mit der Gewebeoberfläche einer Probe zu vermeiden.

Zusammenfassung

Studien über die Skelettmuskelphysiologie stehen vor der technischen Herausforderung, in geeigneter Weise die Proben Verarbeitungsabschnitte mit deutlich sichtbaren cytoplasmatischen Kompartimenten zu erhalten. Eine weitere Hürde ist die enge Apposition von Muskelfasern zu den umliegenden Geweben. Da der Prozess der Gewebefixierung und Paraffineinbettung der Schrumpfung von Muskelfasern führt, Gefrieren ist ein optimales Mittel zum Härten Muskelgewebe zur Sektionierung. Allerdings ist ein häufig auftretendes Problem, die Bildung von Eiskristallen, tritt während der Herstellung von Gefrierschnitten aufgrund des hohen Wassergehalt des Muskels. Das Protokoll hier vorgestellte erste beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Muskelgewebe richtig Einfrieren, indem sie in flüssigem Stickstoff eingetaucht wird. Das Problem bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff allein ist, dass es die Bildung einer Stickstoffgasbarriere bewirkt neben das Gewebe, das als Isolator wirkt und hemmt die Kühlung der Gewebe. Um dies zu vermeiden „Dampfdecke“ -Effekt, ein new Kryoröhrchen wurde entwickelt, um die Geschwindigkeit der Flüssigkeitsströmung um die Gewebeoberfläche zu erhöhen. Dies wurde durch Stanzen eines insgesamt 14 Einlassöffnungen in der Wand des Fläschchens erreicht. Nach Blasendynamik, eine höhere Rate des Flüssigkeitsstrom führt zu kleineren Blasen und weniger Chancen eine Gasbarriere zu bilden. Wenn flüssiger Stickstoff die Kryoröhrchen durch die Einlasslöcher strömt, ist die Strömungsgeschwindigkeit um das Gewebe schnell genug, um die Gasbarriere zu beseitigen. Im Vergleich zu dem Verfahren von Muskelgewebe Einfrieren unter Verwendung von vorgekühltes Isopentan, ist dieses Protokoll einfacher und effizienter und kann verwendet werden, Muskel in einem Durchsatz Weise einzufrieren. Darüber hinaus ist dieses Verfahren optimal für Institutionen, die keinen Zugang zu Isopentan haben, die bei Raumtemperatur extrem leicht entflammbar ist.

Einleitung

Der Skelettmuskel ist das wertvollste Komponente eines fleischproduzierenden Tieres aus der Ernährungs- und verarbeitungstechnischer Sicht. In der Fleischindustrie gibt es zwei besonders kritische Aspekte: die Effizienz des Muskelwachstums und der Qualität des resultierenden Fleisch. Als Hauptbestandteil des Muskels, sind Muskelfasern zu Wachstum und frische Fleischqualität ¹ bei Tieren direkt in Zusammenhang steht. Zum Beispiel ist die Gesamtanzahl von Fasern (TNF) und die Querschnittsfläche der Fasern (CSAF) meist Muskelmasse und Fleischqualität bestimmen; auch, Fasertyp Zusammensetzung (FTC) wirkt sich stark auf frische Fleischqualität ^2. Daher ist die Manipulation von Muskelfasereigenschaften bei Tieren eine sehr wirksame Methode ¹ den Kern der Rentabilität und die Wettbewerbsfähigkeit der Betriebe zu erhöhen.

Bis heute wurden mehrere intrinsische und extrinsische Faktoren identifiziert worden, Muskelfaser characterist zu manipulierenics ^1. Diese Manipulation kann durch die gezielte Auswahl von Tieren mit spezifischen Genen, wie die Myostatin - Gene in cattle ^3, das Callipyge Gen in sheep ⁴ und die RYR1 und IGF2 Gene in pigs ⁵ erreicht werden. Auch Ernährung Kontrolle und Behandlungen mit spezifischen Hormone spielen eine wichtige Rolle bei der Muskelfasereigenschaften ^6. So ein Ansatz, die genetischen und Ernährungsfaktoren kombiniert könnte Muskelfleischanteil und Fleischqualität verbessern kann. Allerdings Studien über Muskelfasern sind in der Fleischindustrie, weil die Aufklärung der Struktur von Muskelfasern begrenzt noch eine Herausforderung.

Muskelfasereigenschaften werden unter Verwendung histochemischer Methoden, wie beispielsweise die Myosin Adenosintriphosphatase (ATPase) -Assay identifiziert. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass die in dünnen (6-8 um) gefroren Abschnitte angeordnet EnzymeMuskelfasern chemisch reagiert mit bestimmten Produkten werden kann. Jedoch ist der Wassergehalt der Muskeln mehr als 75% bei Schweinen, Kaninchen, Mäusen und Menschen, unabhängig von der Position ( das heißt, Rücken, Bauch oder hinteren Gliedmaßen) ^7. Solche hohen Feuchtigkeitsgehalt in Muskeln verursacht eine häufig auftretende Problem - Einfrieren Artefakte - bei der Herstellung von Gefrierschnitten, wie zuvor beschrieben , ^{8, 9.} In den meisten Fällen ist es fast unmöglich, in geeigneter Weise zu Muskelgewebe in einem Schlachthof Produktionslinie, nach unserer Erfahrung einzufrieren.

Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt ein einfaches und effizientes Verfahren in unserem Labor verwendete Muskelgewebe einzufrieren für in einer Hochdurchsatz-Art und Weise Kryoschneiden. Der Höhepunkt dieses Verfahrens ist ein neues, die für Flash-Kryoröhrchen Frieren Muskelgewebe in flüssigem Stickstoff ausgelegt ist. Der aktuelle Workflow kann gleichzeitig Gewebe erleichternEinfrieren und die Verarbeitung für einen ausgezeichneten Muskel Kryoschnitt, mit einem deutlich sichtbar cytoplasmatischen Kompartiment und der engen Apposition von Muskelfasern an das umgebenden Gewebe. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auf eine breite Palette von Möglichkeiten für Gewebeanalyse angewendet werden, da flüssiger Stickstoff mit Gewebe nicht mischen.

Protokoll

Die aktuelle Methode wurde entwickelt und validiert zu ernten und lagert mehr als 1.000 Muskelproben zur histologischen Färbung in unserem Labor. Alle Verfahren beteiligen Tierpflege und Verwendung folgten die vom Ministerium für Landwirtschaft von China festgelegten Richtlinien.

1. Ausrüstung für die Probenentnahme

1. Beschriften Sie die Probe Identität auf jeder kryogenen Fläschchen.
   Hinweis: Die Kryo - Fläschchen speziell frische Gewebeproben für das Kryoschnittes Verfahren (Abbildung 1A) einzufrieren ausgelegt ist. Die Fläschchen werden aus Polypropylen in einer Form Fabrik (1C) gebildet.
2. Erhalten, die folgende Ausrüstung: flüssigen Stickstoff in einem geeigneten Flüssigstickstofftank, eine Schutzbrille oder einen Gesichtsschutz, Gefriertruhe Handschuhe, 10 cm Zange 25 cm Pinzette, eine Styropor-Kühler (innere Abmessungen: 20 cm lang x 12 cm breit x 13,5 cm hoch Außenabmessungen;: 24 cm lang x 16 cm breit x 15 cm hoch), Kunststofffolien (2,5 cm lang x 0,8 cm breit x 0,1 mm dick),ein Skalpell, und A4 PVC Bindungsabdeckungen (21 cm x 29,5 cm) (1B).

2. Herstellung von Muskelproben

1. Füllen Sie das Styropor-Kühler mit flüssigen Stickstoff 5 min vor der Probenentnahme.
   HINWEIS: Die große Säule von flüssigem Stickstoff ist wichtig, weil ein Teil des flüssigen Stickstoffs verkocht und verwandelt sich in Gas, wenn frische Proben berühren. Um die Häufigkeit der Übertragung von flüssigem Stickstoff zu reduzieren, um den Verlust, ein entsprechend dimensioniertes Styropor-Kühler aufzufüllen muss entsprechend der Anzahl von Abtastwerten im Voraus erfasst werden.
2. Sobald eine Probe erhalten wird, ist es leicht Platz auf einem Stück PVC-Bindungs ​​A4 Abdeckung und die Richtung der Muskelfasern beobachten.
   HINWEIS: Hier haben wir den Querschnitt des longissimus doris Muskel von der ersten bis zur letzten Lendenwirbel bei Schweinen. Die Proben sind etwa 12 cm lang, 8 cm breit und 5 cm hoch.
3. Verwenden eines Skalpells zwei parallele Schnitte durch die Probe i zu machenn die Richtung der Muskelfasern, etwa 3 cm lang und 0,6 cm auseinander liegen. Schneiden Sie den eingeschnittene Muskel in ein Rechteck ungefähr 0,6 cm breit x 0,6 cm x 1,5 cm lang.
   HINWEIS: Die Zuverlässigkeit der Messung der Querschnittsfläche der Muskelfasern hängt vor allem von der Faserorientierung des eingeschnittenen Muskel.
4. 10 cm verwenden Pinzette vorsichtig auf die Probe stellen auf einem Stück Kunststofffolie, die mit der Längsachse des eingeschnittenen Muskel parallel zur langen Kante des Films (2A).
   HINWEIS: Der Kunststofffilm hat zwei Funktionen: eine Haltefunktion, die bei der Festlegung der Ausrichtung der Muskelfasern und eine Haftfunktion hilft, dass Risse in der Probe aufgrund des schnellen Einfrierens verhindert.
5. Mit einer Pinzette, legt das Muskelgewebe in die untere Mitte eines Kryoröhrchen gekennzeichnet, genau zwischen den Einlasslöchern und dann fest verschließen die Phiole (2B).

3. Einfrieren und Speichern von Muskelprobes

1. Unter Verwendung von 25 cm Pinzette, unterzutauchen schnell das gesamte Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff in dem vorgekühlten Styroporkühler, zu warten, bis der flüssige Stickstoff nicht siedet (ungefähr 10-20 s).
   HINWEIS: Die Cryovial schwimmt, wenn der flüssige Stickstoff kocht, so sorgfältig das Fläschchen in dem siedenden Flüssigkeit Stickstoff taucht für 10-20 s.
2. Übertragen der Muskelproben zu einer Flüssigstickstofflagertank oder ein -80 ° C-Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.

4. Schieben Vorbereitung

1. Vorkühlen eines Kryostaten auf zwischen -20 ° C und -22 ° C.
2. Entfernen und entsorgen Sie die alte Mikrotom-Klinge, wischen Sie den Messerhalter und Treckerplatte im Kryostaten, ein neues Mikrotomklinge im Kryostaten installieren, und stellen Sie die Schnittstärke bis 8 um.
3. Übertragen der Muskelprobe in der Kryoröhrchen aus dem Flüssigstickstofflagertank oder -80 ° C Gefrierschrank zu dem Kryostaten, es in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis transportiert.
4. Warte 30 min für die Probe mit der Temperatur des Kryostaten äquilibrieren.
   HINWEIS: Alle Geräte, die die Probe berühren könnten, muß vorgekühlt werden, da eine hohe Temperatur könnte die Bildung von Eiskristallen in der Probe führen.
5. Montieren der Probe in der Probenhalter unter der optimale Schnitttemperatur Formulierung von wasserlöslichen Glykolen und Harze (OCT). Geschnitten 8-um-Schnitte.
   HINWEIS: Einstellen der Schnittwinkel senkrecht zur Ausrichtung der Muskelfasern, weil die CSAF die Querschnittsfläche der Muskelfasern ist.
6. Montieren Sie die Abschnitte in Richtung der Mitte einer Raumtemperatur Mikrodia. unmittelbar die Folie in eine Folie Box in einem -80 ° C-Gefrierschrank. Halten Sie das Dia bei RT trocknen.

Ergebnisse

Die Kryoröhrchen Illustration und die gemeinsamen für Laborgeräte Muskeln während der Herstellung von Gefrierschnitten Einfrieren sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Kryoröhrchen sind aus Polypropylen in einer Form Fabrik. Jedes Fläschchen hat insgesamt 14 Einlasslöcher: Ein an der Kappe ist; eine andere ist an der Unterseite; und die verbleibenden 12 bilden vier parallele Leitungen, die jeweils mit vier Bohrungen um 90 ° zueinander. Diese Einlasslöcher können die Ström...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein neues, Mehrloch Kryoröhrchen zum Einfrieren und Speicher von Muskelgewebe zu histologischer Beurteilung der Muskelfunktion führen. Der kritische Schritt in diesem modifizierten Protokoll ist, dass die Probe in den Mehrloch-Kryoröhrchen direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht ist. Unser Wissen ist dies die einfachste und rapidest Art und Weise ausgezeichnete gefrorene Proben für Muskel Kryoschneiden unter den bestehenden Gefrierverfahren zu erhalten (siehe die repräsentativen Ergebnisse).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kryostat Mikrotom	Leica	Leica CM1950
Digitalmikroskop	Nikon	Nikon DS-U3
Kryogene Phiole   Kunststofffolie			, von uns selbst entwickelt
Flüssiger Stickstoff
Skalpell			benutzt
10 cm Pinzette			Häufig verwendet
25 cm Pinzette			Häufig verwendet
Sicherheitsglas			verwendet
Gefrierhandschuhe			Gewöhnlich verwendet