LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics

Summary

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.

Abstract

Charakterisierung von Protein Deamidierung ist zwingend notwendig, die Rolle (n) und Möglichkeiten dieses Proteins posttranslationalen Modifikation (PTM) in der menschlichen Pathologie und anderen biochemischen Zusammenhänge zu entschlüsseln. Um Charakterisierung von Protein Deamidierung durchzuführen, haben wir vor kurzem eine neue lange Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode, die den Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn) Isoform trennen kann Produkte der Desamidierung von Modellverbindungen zu sehr komplexen biologischen Proben. LERLIC-MS / MS ist daher die erste Schrotflinte Proteomik Strategie für die Trennung und Quantifizierung von Gln Desamidierung Isoformen. Wir zeigen auch, wie ein Novum, dass die Probenverarbeitungsprotokoll skizziert hier stabilisiert das Succinimid zwischen dessen Charakterisierung ermöglicht durch LERLIC-MS / MS. Die Anwendung von LERLIC-MS / MS, wie in diesem Video-Artikel gezeigt kann helfen, die derzeit unknow aufzuklärenn molekulare Arrays von Protein Desamidierung. Darüber hinaus bietet LERLIC-MS / MS weitergehendes Verständnis der enzymatischen Reaktionen, die Desamidierung in verschiedenen biologischen Hintergründen umfassen.

Introduction

Desamidierung ist ein Protein posttranslationale Modifikation (PTM) , die eine negative Ladung an das Proteinrückgrat durch Modifikation von Asparagin (Asn) und / oder Glutamin (Gln) die Reste ¹ einführt. Diese Modifikation während Asn - Reste beeinflussen erzeugt das isomeren Produkte Isoasparaginsäure (Isoasp) und n -Asparaginsäure (Asp) an einem gemeinsamen Verhältnis 3: 1 ^2. Dessen ungeachtet kann dieses Verhältnis durch das Eingreifen des Reparaturenzym L-Isoaspartyl methyltransferase (PIMT) ^{3, 4} verändert werden. In ähnlicher Weise erzeugt Deamidi....

Protocol

1. Packen der Lang Länge Anionen-Austausch (LAX) Kapillarsäule

(Anmerkung: Obwohl die LAX Spalte in-home sein kann , verpackt , wie wir in diesem Protokoll beschreiben, LAX Spalten sind auch im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für weitere Details).

1. Suspend 50 mg schwacher Anionenaustauschfüllmaterial in 3,5 ml Packungspuffer (Tabelle 1) , um die Aufschlämmung herzustellen.
2. Montieren Sie das Ende der Kapillarsäule (Länge 50 cm - 200 & mgr; m Innendurchmesser (ID) Schlauch) mit einer weiblich-zu-männlich Fitting, eine ferule und eine weibliche Sch....

Results

Deamidierung von Gln und Asn - Resten ist eine degenerative Proteinmodifikation (DPM) ¹⁴ in mehreren chronischen und tödlichen Krankheiten verwickelt angesehen. Es hat sich gezeigt , dass diese PTM die ¹ - Halbwertszeit und Abbau Staaten von Antikörpern und anderen Molekülen im menschlichen Körper und ähnliche biologische Hintergründe vorhersagen ^{können, 15.} Die Bedeutung von Protein Desamidierung in der T.......

Discussion

In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Schritt- für -Schritt - Protokoll von LERLIC-MS / MS ³ wird ein Verfahren in dem Tiefen gehende Charakterisierung durchzuführen , und um genau das Ausmaß des Protein Desamidierung und die enzymatischen Prozesse auf dieser Proteinmodifikation beteiligt zu bestimmen. LERLIC-MS / MS basiert auf der Verwendung einer langen Länge (50 cm) LAX nach dem Prinzip der elektrostatischen Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung - Chromatographie (Erlić)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PolyCAT 3 und Mikro; m 100-& Aring; (Schüttgut)	PolyLC Inc.	Sonderbestellung
Lange Ionenaustauscher-Kapillarsäule 50 cm - 200 & Mikro; m ID	PolyLC Inc.	Sonderbestellung
PEEKsil Schlauch 1/16" AD x 200 & Mikro; m ID x 50 cm Länge	SGE Analytical Science unter Trajan Scientific Australia	620050
Buchse zu Buchse Verschraubung für 1/16" OD Schlauch	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Innenmutter für Mikroferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Mikroferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Druckbombe NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC System	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-Lock Röhren	Eppendorf	T9661-1000EA
Edelstahlperlen. 0,9 – 2,0 mm. 1 lb. Unsteril.	Next Advance	SSB14B
Tischzentrifuge	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standard Digital beheiztes Umwälzbad, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 Entsalzungskartusche 50 mg	Wasser	WAT020805
Vacumm Konzentrator	Eppendorf	Konzentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite Massenspektrometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
Inkubator INCUCELL	MMM Group	INCUCELL111
Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität	Promega	V5111
Proteasehemmer Cocktailtabletten	Roche	11836170001 (ROCHE)
Phosphatpufferlösung 10x (verdünnt auf 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ammoniumacetat	Sigma-Aldrich	A1542
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodacetamid	Sigma-Aldrich	i6125
Ameisensäure	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Ammoniumhydroxid	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitril HPLC-Qualität	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol HPLC Typ	Sigma-Aldrich	675431
Wasser HPLC Typ	Sigma-Aldrich	14263