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Summary

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.

Abstract

Charakterisierung von Protein Deamidierung ist zwingend notwendig, die Rolle (n) und Möglichkeiten dieses Proteins posttranslationalen Modifikation (PTM) in der menschlichen Pathologie und anderen biochemischen Zusammenhänge zu entschlüsseln. Um Charakterisierung von Protein Deamidierung durchzuführen, haben wir vor kurzem eine neue lange Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode, die den Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn) Isoform trennen kann Produkte der Desamidierung von Modellverbindungen zu sehr komplexen biologischen Proben. LERLIC-MS / MS ist daher die erste Schrotflinte Proteomik Strategie für die Trennung und Quantifizierung von Gln Desamidierung Isoformen. Wir zeigen auch, wie ein Novum, dass die Probenverarbeitungsprotokoll skizziert hier stabilisiert das Succinimid zwischen dessen Charakterisierung ermöglicht durch LERLIC-MS / MS. Die Anwendung von LERLIC-MS / MS, wie in diesem Video-Artikel gezeigt kann helfen, die derzeit unknow aufzuklärenn molekulare Arrays von Protein Desamidierung. Darüber hinaus bietet LERLIC-MS / MS weitergehendes Verständnis der enzymatischen Reaktionen, die Desamidierung in verschiedenen biologischen Hintergründen umfassen.

Introduction

Desamidierung ist ein Protein posttranslationale Modifikation (PTM) , die eine negative Ladung an das Proteinrückgrat durch Modifikation von Asparagin (Asn) und / oder Glutamin (Gln) die Reste ¹ einführt. Diese Modifikation während Asn – Reste beeinflussen erzeugt das isomeren Produkte Isoasparaginsäure (Isoasp) und n -Asparaginsäure (Asp) an einem gemeinsamen Verhältnis 3: 1 ^2. Dessen ungeachtet kann dieses Verhältnis durch das Eingreifen des Reparaturenzym L-Isoaspartyl methyltransferase (PIMT) ^{3, 4} verändert werden. In ähnlicher Weise erzeugt Deamidierung von Gln – Reste die isomeren gamma-Glutaminsäure (γ-Glu) und alpha-glutaminsäure – Isoformen (α-Glu) bei einem erwarteten 1: 7 Verhältnis ^{3, 5,} aber dieses Verhältnis kann durch die Wirkung der verschoben werden das ubiquitäre Enzym Transglutaminase 2 und andere Transglutaminasen, einschließlich Transglutaminase 1, wird eine Enzyme kürzlich mit extrazellulären Vesikeln im Gehirn ⁶ als assoziiert identifiziert.

Der Ursprung der Desamidierung kann entweder spontan oder enzymatisch sein, ist das erstere besonders häufig auf Gln – Resten , bei denen Transglutaminasen und anderen Enzyme vermitteln inter / intramolekulare Vernetzung über Umamidierung (siehe ³ für weitere Details über Gln Umamidierung und ihre Auswirkungen in einigen chronischen und tödliche Krankheiten beim Menschen). Daher ist Desamidierung ein PTM , die eine entscheidende Auswirkung auf die Struktur und Funktion der betroffenen Moleküle ^{4, 7, 8} und erfordert eine eingehende chemische Charakterisierung ³ im Lichte ihrer unterschiedlichen biochemischen Konsequenzen einschließlich der Dienst als molekulare Uhr hat ⁹ des Alterns .

Obwohl Deamidierung von Asn-Reste hat relativ gut charakterisierte von unten nach oben shotgun Proteomics ^{1, 10,} Deamidierung von Gln – Resten immer noch nicht eine geeignete Charakterisierungsmethode über die anspruchsvolle Analyse von Modellverbindungen , die durch elektronen basierend hat radikale Fragmentierungs ^11. Wir haben vor kurzem eine neue eindimensional Shotgun Proteomics Strategie (LERLIC-MS / MS) ³ , die Trennung von Gln und Asn Desamidierung Isoformen von komplexen biologischen Proben und Modellverbindungen in einer einzigen Analyse ermöglicht. LERLIC-MS / MS basiert auf der Trennung von tryptischen Peptiden verdaute eine lange Länge (50 cm) Ionenaustauschersäule (LAX) arbeitet auf elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie (Erlić) Modus und mit dem Tandem-Massenspektrometrie (LC- MS / MS). Diese neue analytische Strategie wurde verwendet, um das Ausmaß jeder deamidiertes Rückstand in menschlichen Hirngewebe zu charakterisieren und relativ zu Quantifizierenf "> 3. Dennoch skizzierte das Protokoll hier wird Video – Imaging von LERLIC-MS / MS abzielen , die Besonderheiten von Protein Desamidierung im biochemischen Zusammenhang von Interesse zu studieren.

ETHIK STATEMENT

Alle Verfahren dieses Protokolls wurden von der Institutional Review Board der Nanyang Technological University in Singapur und wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts genehmigt.

Protocol

1. Packen der Lang Länge Anionen-Austausch (LAX) Kapillarsäule

(Anmerkung: Obwohl die LAX Spalte in-home sein kann , verpackt , wie wir in diesem Protokoll beschreiben, LAX Spalten sind auch im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für weitere Details).

1. Suspend 50 mg schwacher Anionenaustauschfüllmaterial in 3,5 ml Packungspuffer (Tabelle 1) , um die Aufschlämmung herzustellen.
2. Montieren Sie das Ende der Kapillarsäule (Länge 50 cm – 200 & mgr; m Innendurchmesser (ID) Schlauch) mit einer weiblich-zu-männlich Fitting, eine ferule und eine weibliche Schraubenmutter. Platzieren eine Bildschirm 1/16" OD von 1 Mikrometer Porengröße innerhalb des weiblich-zu-Negativ-Paßelement. (Anmerkung: Der Bildschirm hier verwendet wurde, haben muß kleinere Porengröße als die Partikelgröße des Füllmaterials zu verhindern, dass eine Leckage des Materials aus dem Säule).
3. Packen die Kapillare mit der Aufschlämmung eine Druckpumpe bei 4.500 psi betrieben wird. (Hinweis: Packen Sie die coluMn, bis das Verpackungsmaterial ist am Eingang der Säule) sichtbar.
4. Montieren Sie das andere Ende der Kapillarsäule wie unter Punkt 1.2 beschrieben.

2. Probenvorbereitung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von LERLIC-MS / MS menschliche Hirngewebe als Modell Proteom zu analysieren. (Hinweis: Bei anderen Geweben oder proteomischer Proben zu verwenden, sollten die Probenvorbereitungsverfahren angepasst werden.)

1. Gewebehomogenisierung:
   ein. Waschhirngewebe (50 bis 100 mg) mit 1x Phosphatpufferlösung dreimal für fünf Minuten.
   b. Homogenisieren des Gewebes in einer 1: 1: 2,5 Gewebe- / metallischen Perlen / SDC Homogenisierungspuffer (Tabelle 2) Verhältnis (w / w / v) für 5 min bei 4 ° C in Safe-Lock – Röhrchen bei maximaler Intensität ein Gewebe – Homogenisator. (Anmerkung: SDC Homogenisierungspuffer Proteaseinhibitoren umfassen kann , wie zuvor in ³ angegeben)
   c. Zentrifugiere die Gewebehomogenat, erhalten from den vorherigen Schritt, bei 10.000 × g, 4 ° C für 10 min und den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen sammeln.
   d. Wiederholen Sie die Schritte bc für die verbleibenden Pellets und die Überstände so oft wie nötig kombinieren , bis kein Pellet beobachtet wird. (Hinweis: Wenn Sie die Schritte bc mehr als zwei Mal wiederholen müssen, bewegen Sie die Probe und die Perlen zu einem neuen Safe-Lock – Rohr den Verlust der Probe während des Zentrifugationsschritt zu verhindern).
   e. Quantifizierung der Proteinkonzentration der erhaltenen Homogenate von Bicinchoninsäure (BCA) ^12.
2. Natriumdeoxycholat (SDC) -Assistierte in-Lösung Trypsinverdauung ¹³ Gehirnhomogenaten.
   ein. Fügen eine Endkonzentration von 10 mM Dithiothreitol (DTT) (unter Verwendung der Stammlösung in Lösung 5 von Tabelle 3 angegeben) auf das erhaltene Homogenisat die Reduktion von Protein – Disulfid – Bindungen zu initiieren.
   b. Inkubieren des Homogenisats während 30 Minuten in einem Badbei 60 ° C voreingestellt.
   c. In das Homogenat zu einer Endkonzentration von 20 mM Iodacetamid (IAA) unter Verwendung der Stammlösung in Lösung 7 von Tabelle 4 angegeben.
   d. Inkubieren des Homogenats IAA bei Raumtemperatur im Dunkeln während 45 min enthält.
   e. Verdünne das Hirnhomogenat zwei Faltungen unter Verwendung Verdünnungspuffer (Lösung 6 von Tabelle 3).
   f. Inkubieren der Probe für eine zweite Reduktionsstufe während 30 Minuten bei 37 ° C.
   G. Hinzufügen Sequenzierungs-grade-modifiziertes Trypsin , gelöst in Lösung 2 von Tabelle 2 bei Protein-zu-Enzyme Verhältnis 1:50 (w / w).
   h. Digest des Homogenats mit Trypsin durch Inkubation über Nacht bei 30 ° C.
   ich. Quenche die enzymatische Verdauung am nächsten Tag um 0,5% Endkonzentration Ameisensäure (FA) Zugabe. (Hinweis: Die Zugabe von FA Fällung der SDC Salz unter sauren Bedingungen führen.)
   j. Sanft vortexen die Proben SDC precipi enthälttates.
   k. Pellet die SDC Salze nach unten, indem die Proben bei 12.000 × g, 4 ° C während 10 min zentrifugiert.
   l. Die überstehende Flüssigkeit und dann die Flüssigkeit in ein sauberes neues Röhrchen. (Anmerkung: während der Pipettieren dieses Schrittes Achten Sie darauf, nicht erneut zu suspendieren und / oder sammeln Salze aus dem SDC-Pellet.)
   Meter Das SDC – Pellet in SDC Wiederauflösepuffer (Tabelle 5) unter kräftigem Vortexen für 1 min wieder aufzulösen.
   n. Wiederholen Sie die Schritte Jl zweimal , um ausgefallenes Peptide zu erholen und die Überstände kombinieren. (Anmerkung:. Siehe Serra et al 2016 ¹³ für weitere Einzelheiten über die SDC-assistierte in-Lösung Trypsinverdauung Protokoll hier angepasst.)
3. Die Entsalzung von tryptischen verdauten Proben.
   ein. Perform Entsalzen der verdauten Proben, die eine 1 g C-18-Patrone. (Anmerkung: Die Verwendung einer großen Volumen Patrone (5 ml), unabhängig von der Menge an Protein, erhielt garantiert korrekte Reinigung der verbleibenden SDC Salze in den Proben vorLC-MS / MS-Injektion.)
   b. Führen Konditionierung der 1g C-18 Kartusche mit 5 ml Acetonitril (ACN).
   c. Übergeben von 5 ml clean-up – Puffer (Tabelle 6) durch die konditionierte 1 g C-18 Kartusche verbliebener organische Lösungsmittel zu entfernen.
   d. Legen Sie die Probe auf die 1 g C-18-Patrone.
   e. Führen von 3 bis 5 Reinigungsschritten auf die Probe in der 1 g C-18 – Säule unter Verwendung von 5 ml clean-up – Puffer jeden Schritt.
   f. Eluieren der entsalzten Peptide aus dem 1 g C-18 Kartusche unter Verwendung von 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 7).
   G. Trocknen Sie die eluierten Peptide in einem Vakuum-Konzentrator.
   c. Rekonstituieren die getrocknete Probe in einem Endvolumen von 200 & mgr; l Elutionspuffer. . (Anmerkung: Verwenden kräftig und lange (> 10 min) gefolgt von Vortexen anschließende Beschallung in einem Ultraschallbad während 30 min vollständig resuspendieren die getrockneten Peptide in Injektionspuffer)
   d. Stellen Sie das Injektionsvolumen der Probe für LERLIC-MS / MS zu analysieren zwischen 1 bis 3 & mgr; g Protein.

3. One-Dimension LERLIC-MS / MS-Trennung

1. Flüssigchromatographie Bedingungen:
   Mobile Phasen:
   A: 0,1% FA in Wasser (Tabelle 8).
   B: 0,1% FA in ACN (Tabelle 9)
   Fließgeschwindigkeit: 0,4 ml / min
   Säule: LAX Kapillarsäule (50 cm Länge – 200 um ID)
   ein. Verwenden Sie das folgende 1200 min-Gradient: 95% B für 40 min, 95-85% B während 434 min, 85-70% B während 522 min, 70-35% B während 124 min, 35-3% B für 45 min , isokratisch bei 3% B für 5 Minuten, 3-95% B über 7 min gehalten und bei 95% B für 23 min isokratisch.
   b. Führen Trennung der Peptide , die die Kapillar – LAX , wie in Serra & Gallart-Palau et al angegeben. ³ unter Verwendung von Ultrahochdruck – Flüssigkeitschromatographie.
2. Massenspektrometer-Konfiguration:
   ein. Konfigurieren Sie die Scan-Ereignisdetails Datenerfassung Wechsel betwe ausführenen vollständige Fourier-Transformations-Massenspektrometrie (FT-MS) und Fourier-Transformations-Tandem-Massenspektrometrie (FT-MS / MS) mit den folgenden Parametern:
   a.1. Datenerfassungsmodus: positiv
   a.2 FT-MS Parameter:
   Massenbereich: 350 – 2000 m / z
   Auflösung: 60.000
   Microscans: 1 pro Spektrum
   Automatische Verstärkungsregelung: 1 × 10 ⁶
   a.3 FT-MS / MS-Parameter:
   Fragmentierungsmodus: Hochenergie-Kollisions-Dissoziation (HCD)
   A.4 Massenbereich: 150 – 2000 m / z
   A.5 Auflösung: 30.000
   A.6 Top N-Ionen: 10
   Microscans: 1 pro Spektrum
   Ladezustand:> 2+
   Isolationsbreite: 2 Da
   A.7 Automatische Verstärkungsregelung: 1 × 10 ⁶
   b. Führt Massenspektrometrie Nachweis von Peptiden , wie in ³ unter Verwendung eines Orbitrap – Massenspektrometer mit einer Nanoelektrospray – Ionenquelle ausgerüstet angegeben bei 1,5 kV arbeitet.

4. Datenanalyse

1. Führen Sie protein Datenbanksuche auf den LERLIC-MS / MS erhaltenen Daten der folgenden Parameter unter Verwendung einer spezifische Proteom – Software: (Hinweis: Siehe ³ für weitere Details.)
   ein. Ionen-Toleranz: 10 ppm
   b. Fragmention Toleranz: 0,05 Da
   c. False Discovery Rate (FDR): 1%
   d. Datenbank: UniProt Menschliche Datenbank
   e. Feste Modifikationen: Carbamydomethylation bei Cys
   f. Variable Modifikationen (wenn von der Software erforderlich): Oxidation (Met), Deamidierung (Asn und Gln).
2. Überzeugte Charakterisierung und Quantifizierung von isomeren deamidiertes Produkten in LERLIC-MS / MS-Daten:
   ein. Export-Datenbank Sucher von LERLIC-MS / MS zu einer spreedsheet Software für die Analyse.
   b. Suchen und extrahieren Sie die ganze Liste von deamidiertem Peptide und deren nichtdeamidierter Pendants.
   c. Unter Verwendung die Liste des erhaltenen Peptide als Referenz, extrahiert die Ionenchromatogramme (XICS) diese Peptide, die eine sachgemäße Software bei 5 ppm Massentoleranz verwendet wird. (Hinweis:Siehe ³ für weitere Details über die Software für die Extraktion von XICS verwendet.)
   d. Eine Sichtkontrolle des erhaltenen XICS der separierten Doppelpeak Elution der isomeren Produkte zu identifizieren , wie ³ angegeben. (Anmerkung: isomere Produkte dieser Peptide bei MS / MS-Ebene identifiziert wird, kann leicht durch das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Retentionszeiten in dem Datenbank Suchergebnis geführt zu finden.)
   e. Relative Quantifizierung der isomeren Produkte aus jeder deamidierten site / Peptid auf der Basis der Peakfläche von jedem identifizierten Isomer in den erhaltenen XICS durchgeführt werden.

Representative Results

Discussion

In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Schritt- für -Schritt – Protokoll von LERLIC-MS / MS ³ wird ein Verfahren in dem Tiefen gehende Charakterisierung durchzuführen , und um genau das Ausmaß des Protein Desamidierung und die enzymatischen Prozesse auf dieser Proteinmodifikation beteiligt zu bestimmen. LERLIC-MS / MS basiert auf der Verwendung einer langen Länge (50 cm) LAX nach dem Prinzip der elektrostatischen Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung – Chromatographie (Erlić) ^27. Die Verwendung einer Säule mit langer Länge, wie ³ in unserer Studie gezeigt, maximiert das Potential von Erlić getrennte Peptide gemäß ihrem isoelektrischen Punkt ^27.

LERLIC-MS / MS stellt eine neuartige shotgun eindimensionale Trennstrategie, einen Arbeitsablauf, die Zeit-on-Hände während der Probenverarbeitung speichert , obwohl es eine 1.200 min – Gradienten erfordert , wie in ³ angegeben ist auf sehr komplexe Proteome optimale Ergebnisse zu erhalten. A 60 min gradient in LERLIC-MS / MS kann auch eine optimale Trennung von Gln Desamidierung Isoformen an Modellverbindungen zum ersten Mal in Shotgun Proteomics ³ erreichen. Basierend auf diesen beiden Anwendungen, wir spekulieren , dass eine Trennung zweite Dimension von LAX Kapillare durchgeführt kann bisher von unserer Gruppe ¹⁰ verwendete für die Analyse von Proben der mittleren Komplexität, ein Workflow unter einem mehrdimensionalen Chromatographie Ansatz zu einem ersten Dimension Umkehrphasenchromatographie gekoppelt werden.

Probenvorbereitung für die Analyse von Protein Deamidierung ist ein entscheidender Schritt, die besondere Aufmerksamkeit erfordert ¹ das Auftreten von artifizieller Desamidierung auf Asn – Resten an einem großen Ausmaß zu verhindern. Hao et al. festgestellt , dass tryptischen Verdau unter milden sauren pH – Wert verhindert signifikant Erscheinung artefactual Desamidierung bei der Probenvorbereitung ²⁸ auf . Wir haben in dieser Studie unserer SDC-assisted in Lösung Versuch verwendetptic Verdauung ^13, eine Methode , bei der Probenverarbeitung 6. Auf der anderen Seite bei einem pH durchgeführt, stärker sauren Bedingungen könnte die Fähigkeit von Trypsin – Verdau herausfordern , wenn der pH niedriger als 6 ²⁹ gehalten wird. Auseinandersetzung mit diesem Thema, vor kurzem Liu et al. haben eine optimale Verdauung Strategie berichtet , die durch Substituieren von Trypsin durch Glu-C bei pH 4,5 ³⁰ an Asn – Reste erfolgreiche Verdauung und Verhinderung des Auftretens von artefactual Desamidierung ermöglicht. Die Umsetzung der von Liu et al Verdauungsmethode. ³⁰ Asn Desamidierung von LERLIC-MS / MS könnte eine mögliche Strategie sein , die erfordert experimentelle Verifikation zu analysieren.

Das Protokoll in diesem Video-Artikel beschrieben hat ein großes Potenzial weiter zu charakterisieren und zur Zeit unbekannt Isoform Verhältnis Arrays quantitativ zu bestimmen, die die Beteiligung von Protein Desamidierung in Alterung und Krankheiten des Menschen zu definieren. Pelzterhin, Anwendung von LERLIC-MS / MS in anderen biologischen Hintergründen wird helfen, die Möglichkeiten und Risiken von Protein Desamidierung als molekulare Uhr Modifikation zu bestimmen.

Materials

PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material)	PolyLC Inc.	Special order
Long-length ion exchange capillary column 50 cm – 200 µm ID	PolyLC Inc.	Special order
PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length	SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia 	620050
Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Female nut for microferule	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Pressure Bomb NanoBaume	Western Fluids Engineering	SP-400
Shimadzu Prominence UFLC system	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Next Advance	BBX24
Safe-lock tubes	Eppendorf 	T9661-1000EA
Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile.	Next Advance	SSB14B
Table-top centrifuge 	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg	Waters	WAT020805
Vacumm concentrator	Eppendorf 	Concentrator Plus System
Dionex UltiMate 3000 UHPLC 	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC 
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray 	Michrom-Bruker Inc.	TCSI-SS2
Incubator INCUCELL 	MMM Group	INCUCELL111
Sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
Protease inhibitor cocktail tablets	Roche	11836170001 (ROCHE)
Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x)	Sigma-Aldrich	P5493
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A1542
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	i6125
Formic acid	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Ammonium hydroxide	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Acetonitrile HPLC grade	Sigma-Aldrich	675415
Isopropanol HPLC grade	Sigma-Aldrich	675431
Water HPLC grade	Sigma-Aldrich	14263