Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll der langen Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophile Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode. Dies ist eine neue Methode, die zum ersten Mal die Quantifizierung und Charakterisierung der Glutamin und Asparagin Desamidierung Isoformen von Shotgun Proteomics ermöglicht.
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Methodenartikel
LERLIC-MS / MS für eingehende Charakterisierung und Quantifizierung von Glutamin und Asparagin Desamidierung in Shotgun Proteomics
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Charakterisierung von Protein Deamidierung ist zwingend notwendig, die Rolle (n) und Möglichkeiten dieses Proteins posttranslationalen Modifikation (PTM) in der menschlichen Pathologie und anderen biochemischen Zusammenhänge zu entschlüsseln. Um Charakterisierung von Protein Deamidierung durchzuführen, haben wir vor kurzem eine neue lange Länge elektrostatische Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung-Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LERLIC-MS / MS) Methode, die den Glutamin (Gln) und Asparagin (Asn) Isoform trennen kann Produkte der Desamidierung von Modellverbindungen zu sehr komplexen biologischen Proben. LERLIC-MS / MS ist daher die erste Schrotflinte Proteomik Strategie für die Trennung und Quantifizierung von Gln Desamidierung Isoformen. Wir zeigen auch, wie ein Novum, dass die Probenverarbeitungsprotokoll skizziert hier stabilisiert das Succinimid zwischen dessen Charakterisierung ermöglicht durch LERLIC-MS / MS. Die Anwendung von LERLIC-MS / MS, wie in diesem Video-Artikel gezeigt kann helfen, die derzeit unknow aufzuklärenn molekulare Arrays von Protein Desamidierung. Darüber hinaus bietet LERLIC-MS / MS weitergehendes Verständnis der enzymatischen Reaktionen, die Desamidierung in verschiedenen biologischen Hintergründen umfassen.
Einleitung
Desamidierung ist ein Protein posttranslationale Modifikation (PTM) , die eine negative Ladung an das Proteinrückgrat durch Modifikation von Asparagin (Asn) und / oder Glutamin (Gln) die Reste 1 einführt. Diese Modifikation während Asn - Reste beeinflussen erzeugt das isomeren Produkte Isoasparaginsäure (Isoasp) und n -Asparaginsäure (Asp) an einem gemeinsamen Verhältnis 3: 1 2. Dessen ungeachtet kann dieses Verhältnis durch das Eingreifen des Reparaturenzym L-Isoaspartyl methyltransferase (PIMT) 3, 4 verändert werden. In ähnlicher Weise erzeugt Deamidi....
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Protokoll
1. Packen der Lang Länge Anionen-Austausch (LAX) Kapillarsäule
(Anmerkung: Obwohl die LAX Spalte in-home sein kann , verpackt , wie wir in diesem Protokoll beschreiben, LAX Spalten sind auch im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien und Reagenzien für weitere Details).
- Suspend 50 mg schwacher Anionenaustauschfüllmaterial in 3,5 ml Packungspuffer (Tabelle 1) , um die Aufschlämmung herzustellen.
- Montieren Sie das Ende der Kapillarsäule (Länge 50 cm - 200 & mgr; m Innendurchmesser (ID) Schlauch) mit einer weiblich-zu-männlich Fitting, eine ferule und eine weibliche Sch....
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Ergebnisse
Deamidierung von Gln und Asn - Resten ist eine degenerative Proteinmodifikation (DPM) 14 in mehreren chronischen und tödlichen Krankheiten verwickelt angesehen. Es hat sich gezeigt , dass diese PTM die 1 - Halbwertszeit und Abbau Staaten von Antikörpern und anderen Molekülen im menschlichen Körper und ähnliche biologische Hintergründe vorhersagen können, 15. Die Bedeutung von Protein Desamidierung in der T.......
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Diskussion
In diesem Video-Artikel präsentieren wir ein Schritt- für -Schritt - Protokoll von LERLIC-MS / MS 3 wird ein Verfahren in dem Tiefen gehende Charakterisierung durchzuführen , und um genau das Ausmaß des Protein Desamidierung und die enzymatischen Prozesse auf dieser Proteinmodifikation beteiligt zu bestimmen. LERLIC-MS / MS basiert auf der Verwendung einer langen Länge (50 cm) LAX nach dem Prinzip der elektrostatischen Abstoßung-hydrophilen Wechselwirkung - Chromatographie (Erlić)
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem Singapore Ministry of Education (Tier 2: Grant ARC9 / 15) unterstützt wird, National Medical Research Council of Singapore (NMRC-OF-IRG-0.003-2.016) und NTU-NHG Alternsforschung Grant ( Grant-ARG / 14017). Wir möchten unsere Dankbarkeit und aufrichtigsten Dank an Dr. Andrew Alpert und PolyLC Team zum Ausdruck bringen für haben uns freundlicherweise mit den Verpackungsmaterialien, die möglich diese Studie gemacht.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PolyCAT 3 und Mikro; m 100-& Aring; (Schüttgut) | PolyLC Inc. | Sonderbestellung | |
| Lange Ionenaustauscher-Kapillarsäule 50 cm - 200 & Mikro; m ID | PolyLC Inc. | Sonderbestellung | |
| PEEKsil Schlauch 1/16" AD x 200 & Mikro; m ID x 50 cm Länge | SGE Analytical Science unter Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Buchse zu Buchse Verschraubung für 1/16" OD Schlauch | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Innenmutter für Mikroferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Mikroferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Druckbombe NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC System | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-Lock Röhren | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Edelstahlperlen. 0,9 – 2,0 mm. 1 lb. Unsteril. | Next Advance | SSB14B | |
| Tischzentrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital beheiztes Umwälzbad, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 Entsalzungskartusche 50 mg | Wasser | WAT020805 | |
| Vacumm Konzentrator | Eppendorf | Konzentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite Massenspektrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Inkubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Modifiziertes Trypsin in Sequenzierungsqualität | Promega | V5111 | |
| Proteasehemmer Cocktailtabletten | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphatpufferlösung 10x (verdünnt auf 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammoniumacetat | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Natriumdesoxycholat | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodacetamid | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Ameisensäure | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammoniumhydroxid | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitril HPLC-Qualität | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC Typ | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Wasser HPLC Typ | Sigma-Aldrich | 14263 |
Referenzen
- Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....
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Nachdrucke und Genehmigungen
