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Methodenartikel

Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardations-Assays für die Analyse der

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DOI:

10.3791/55638

⸱

21. Juni 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physical Chemical Biology, Center for Biological Research (CIB-CSIC), Spanish National Research Council (CSIC), 2Department of Immunology, Complutense University School of Medicine, 3Abvance Biotech srl

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.

Zusammenfassung

Wir zeigen Methoden zur Expression und Reinigung von tRNA (UUU) in Escherichia coli und die Analyse durch Gelretardierungsassays der Bindung von tRNA (UUU) an TcdA, eine N 6 -Dreonylcarbamoyladenosin (t 6 A) Dehydratase, die das Threonylcarbamoyl cyclisiert Seitenkette an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) von tRNAs an cyclische t 6 A (ct 6 A) gebunden. Die Transkription des für tRNA (UUU) kodierenden synthetischen Gens wird in E. coli mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und die tRNA enthaltenden Zellen werden nach der Induktion von 24 h geerntet. Die RNA-Fraktion wird unter Verwendung des Säurephenol-Extraktionsverfahrens gereinigt. Die reine tRNA wird durch eine Gelfiltrationschromatographie erhalten, die die kleineren tRNA-Moleküle effizient von größeren intakten oder fragmentierten Nukleinsäuren trennt. Um die TcdA-Bindung an tRNA (UUU) zu analysieren, wird TcdA mit tRNA (UUU) gemischt und auf einem nativen Agarosegel bei 4 ° C abgetrennt.Die freie tRNA (UUU) wandert schneller, während die TcdA-tRNA (UUU) -Komplexe einer Mobilitätsverzögerung unterliegen, die bei der Färbung des Gels beobachtet werden kann. Wir zeigen, dass TcdA ein tRNA (UUU) -Bindungsenzym ist. Dieser Gel-Retardierungs-Assay kann verwendet werden, um TcdA-Mutanten und die Wirkungen von Additiven und anderen Proteinen auf die Bindung zu untersuchen.

Einleitung

Der Gel-Retardierungs-Assay 1 (auch bekannt als elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungs-Assay, EMSA) ist ein elektrophoretisches Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Es erlaubt die Analyse von Protein-DNA sowie Protein-RNA-Wechselwirkungen und insbesondere Wechselwirkungen zwischen tRNA und tRNA-bindenden Proteinen unter Verwendung von entweder gereinigten Komponenten oder komplexen Mischungen von Proteinen ( zB Zelllysaten) oder Nukleinsäuren ( zB tRNA Pools). Wir haben Gel-Retardierungs-Assays zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen gereinigter tRNA (UUU) und TcdA, einer N 6- Threonylcarbamoyladenosin (t 6 A) -Dehydratase, die die an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) gebundene Threonylcarbamoyl-Seitenkette cyclisiert, Von tRNAs zu cyclischen t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ist auch bekannt als CsdL 3 ,F "> 4. Das tcdA / csdL- Gen bildet mit den csdA- und csdE- Genen 5 einen Cluster, der die Cystein-Desulfurase und den Schwefelakzeptor des Cysteinsulfinase-Desulfinats (CSD-Systems) codiert und die TcdA-Funktion in vivo 3 aufrechterhalten muss.

Der Grundgedanke der Gel-Retardierungs-Assays besteht darin, dass während der freien Nukleinsäuremoleküle aufgrund ihrer großen negativen Ladung schnell an die Vorderseite von Acrylamid- oder Agarosegelen wandern, wird die elektrophoretische Beweglichkeit von Proteinkomplexen derselben Nukleinsäuren drastisch reduziert. Die Verminderung der Mobilität wird als "Verschiebung" in den Nukleinsäure-Protein-Komplexen visualisiert, die als diskrete Banden aufgelöst werden. Positiv geladene und größere Nukleinsäure-Protein-Komplex zeigen eine größere Verschiebung oder Verminderung der Mobilität auf einem Gel.

Da die Ladungsneutralisierung des Komplexes ein universelles Phänomen istFür Protein-Nukleinsäure-Komplexe kann der Gel-Retardierungs-Assay auf eine breite Palette von Komplexen und Nukleinsäure-Typen angewendet werden. Die Methode ist einfach, preiswert und kann in Laboratorien mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden. Es erfordert nur geringe Mengen an Proteinen und tRNA. Dies ist ein Vorteil gegenüber alternativen biophysikalischen Techniken, die in der Regel größere Probenmengen verbrauchen.

Der Gel-Retardierungs-Assay wurde weithin für die Untersuchung von Transkriptionsfaktoren verwendet. Der Assay wurde verwendet, um die Bindungskinetik, die Stärke und die Spezifität der Transkriptionsfaktoren für viele verschiedene DNA-Sequenzen zu analysieren. Es war tatsächlich auf diesem Gebiet, dass die EMSA erstmals 6 , 7 entwickelt wurde . Gel-Retardierungs-Assays mit RNA 8 , 9 , 10 , 11 und tRNA-Moleküle wurden auch in der Ribosomenforschung eingesetztUnd zu analysieren, wie wir hier tun, die Enzyme, die tRNA-Nukleoside nachtranskriptional modifizieren.

Viele verschiedene Parameter beeinflussen das Ergebnis eines Gel-Retardierungs-Assays wie Temperatur, Qualität der Protein- und tRNA-Probe und die Stärke der Bindung. Eine sorgfältige Planung und Durchführung des Experiments ist entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse der freien Nukleinsäure und der Protein-gebundenen Spezies. Hier nutzten wir das für tRNA (UUU) kodierende synthetische Gen, das in einen Expressionsvektor kloniert wurde, dessen Promotor die Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle fehlt, was zur Synthese großer Mengen der tRNA 2 führt . Dieses detaillierte Protokoll soll einen klaren Leitfaden für die Durchführung von tRNA-Gel-Retardierungsexperimenten liefern, während gemeinsame Fehler vermieden werden.

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Protokoll

Achtung: Vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) beachten. Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und korrosiv. Verwenden Sie geeignete Praktiken bei der Durchführung der Extraktion von tRNA mit Phenol, einschließlich der Verwendung einer Dunstabzugshaube und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhosen, Schuhspitzen, etc. ). Dieses Protokoll verwendet einen nicht-toxischen Nukleinsäure-Fleck. Die Verwendung von alternativen Flecken kann zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen und die spezialisierte Entsorgung des Färbemittels erfordern, wenn sie toxisch und / oder krebserregend sind ( z . B. Ethidiumbromid).

1. Vorbereitung des Agarosegels

  1. 2 g Agarose wiegen und zu einer Glasflasche geben, um ein 2% iges w / v Agarosegel zuzubereiten.
  2. Füge 100 ml von 1 × tris-borat-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (TBE) laufenden Puffer zu der agarosehaltigen Flasche hinzu. Schmelzen durch Erhitzen in einer Mikrowelle. In 30 s Intervallen, swirl die Inhalte zu mischenGut und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Agarose-Lösung auf ca. 50-60 ° C abkühlen.
  3. Tape die offenen Kanten eines Gel-Tray, um eine Form zu schaffen, legen Sie einen geeigneten Kamm, um die Brunnen zu schaffen und die geschmolzene Agarose in sie zu werfen. Vermeiden Sie die Blasenbildung und lassen Sie sie bei Raumtemperatur erstarren.
  4. Nach dem Erstarren legen Sie den Gelträger in eine Elektrophoreseeinheit und füllen ihn mit TBE-Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.

2. Vorbereitung der tRNA

  1. Express-tRNA (UUU) in E. coli
    1. Am Morgen wird ein mit dem Expressionsvektor pET23d-EcUUU 2 transformiertes Fläschchen mit gefrorenem E. coli BL21 (DE3) verwendet, das das für E. coli tRNA (UUU) kodierende Gen enthält, um eine salzarme Luria Brühe (LB) Platte, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Umkehren Sie die Platte und legen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator, bis Kolonien erscheinen (spät nachtOon)
    2. Inokulieren einer gut gewachsenen Einzelkolonie in 5 ml LB plus 100 μg / ml Ampicillin und wachsen über Nacht bei 220 U / min bei 37 ° C.
    3. Am nächsten Morgen pellet man die Zellen (6.500 xg für 10 min bei 4 ° C), ersetzen Sie das Medium mit 5 mL frischem LB plus 100 μg / mL Ampicillin und resuspend. Verwenden Sie diese Suspension, um 200 ml LB plus 100 μg / ml Ampicillin zu inokulieren. Für 5 h bei 220 U / min bei 37 ° C wachsen.
    4. Wenn die optische Dichte der Kultur bei 590 nm (OD 590 ) 0,6 - 0,8 erreicht hat, füge 1 mM IPTG zur Kultur hinzu, um die Expression des tRNA (UUU) -Gens auszulösen. Inkubieren bei 37 ° C für 3 h.
    5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren der Kultur bei 6.500 xg für 10 min bei 4 ° C.
  2. Lyse und Extraktion
    1. Das Zellpellet wird in 5 ml Lysepuffer (0,3 M Natriumacetat, 10 mM EDTA) resuspendiert. Von diesem Zeitpunkt an benutzten autoklavierte Puffer und halten alle tRNA-haltigen Proben bei 4 ° C, um t zu verhindernRNA-Abbau
    2. Füge 1 Volumen Säurephenol (pH 4,3) zum resuspendierten Zellpellet in der Dunstabzugshaube hinzu. Mischen für 1 min durch Inversion, um die Zellen zu lysieren und bei 10.000 xg (10 min, 4 ° C) zu zentrifugieren.
    3. Sammeln Sie die obere wässrige Phase, die die lösliche tRNA (UUU) (und kleinere Konzentrationen der anderen tRNA-Pools) enthält, unter Verwendung einer Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass die organische (untere) Phase nicht abgesaugt wird. Verwerfen Sie die untere Schicht und das Pellet, das aus der organischen Phase und Zelltrümmer besteht, in einen geeigneten Behälter.
    4. Ausfällen der tRNA durch gründliches Mischen der löslichen (wässrigen) Phase mit 2,5 Vol .-% 100% V / V Ethanol durch Inversion für 1 h bei 4 ° C. Die Mischung wird bei 15.000 xg (30 min, 4 ° C) zentrifugiert.
    5. Den Überstand sorgfältig dekantieren und das tRNA-reiche Pellet in 4 mL Gelfiltrationspuffer (20 mM Natriumphosphat oder Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA) resuspendieren. Führen Sie 5 μl des resuspendierten tRNA-Pools auf einem 2% w / v Agarosegel.
      HINWEIS:Gute Qualität tRNA erscheint als Einzelband (Molekulargröße zwischen 50-100 bp).
  3. Reinigung von tRNA (UUU)
    1. Nach der üblichen chromatographischen Praxis 12 beladen die resuspendierte tRNA (UUU) auf eine hochauflösende präparative Gelfiltrationssäule (Abmessungen: 16 x 600 mm, Bettvolumen: 120 mL, Auflösungsbereich: 1.000-70.000 Da), die zuvor im Gelfiltrationspuffer äquilibriert wurden (Mobile Phase). Stellen Sie den Durchfluss auf 1 mL / min ein, um die Proben zu eluieren.
      HINWEIS: Der tRNA (UUU) Peak eluiert etwa bei 75,5 ml. Typischerweise kann eine Ausbeute von 0,5-1,0 mg / l tRNA der Kultur erhalten werden.
    2. Analysieren Sie die Proben bei repräsentativen Elutionsvolumina durch Elektrophorese von 5 - 10 & mgr; l jeder Probe auf einem 2% w / v Agarosegel.

3. Probenvorbereitung

  1. Express und Reinigung von TcdA nach López-Estepa et al . 2
    HINWEIS: Bis zu 250 μMTcdA kann für die Studie verwendet werden.
  2. Die entsprechende Menge an TcdA gemäß Tabelle 1 in gut markierte 1,5 mL Zentrifugenröhrchen pipettieren. Zugabe von 1,6 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) (Endkonzentration) und sanftes Mischen mit einer Pipette. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5 min.
  3. 10 μM Adenosintriphosphat (ATP) und 50 mM MgCl 2 (Endkonzentrationen) zugeben. Mit einer Pipette vermischen und die Mischung 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  4. Fügen Sie gereinigte tRNA (UUU) (Abschnitt 2.3) gemäß Tabelle 1 hinzu , mischen mit einer Pipette und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
  5. Füge phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis zu 100 μl Endvolumen hinzu. Mischen Sie richtig und fügen Sie Glycerin zu einer Endkonzentration von 10% v / v hinzu.
  6. Vortexen Sie die Probe und drehen Sie kurz den Inhalt des Röhrchens (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Gel Loading und Elektrophorese Entwicklung

  1. Legen Sie die Elektrophoreseeinheit in eine mit Crushed Ice gefüllte Schale, um die Kammer bei 4 ° C während des Elektrophoreselaufs zu halten.
  2. Sorgfältig pipettieren Sie 5 μl jeder Probe in die entsprechende Vertiefung. Füge einen geeigneten DNA-Größenmarker hinzu.
  3. Stecken Sie die Elektroden in die entsprechenden Steckplätze des Netzteils. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie die Spannung auf 100 V und führen Sie das Gel für 90 min.

5. Gel-Färbung zur Beobachtung der tRNA-Protein-Wechselwirkung

  1. Die Färbelösung durch Mischen von 50 ml TBE mit 1x eines geeigneten DNA-Flecks zubereiten. Vermeiden Sie es, die Färbelösung dem Sonnenlicht auszusetzen, indem Sie den Färbebehälter mit Aluminiumfolie abdecken.
    HINWEIS: DNA-Flecken werden in der Regel als 10.000 oder 20.000x konzentrierte Bestände gelagert.
  2. Nach 90 min Elektrophorese entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Tablett und legen es in einen Behälter mit Färbelösung. Legen Sie es auf eine Wippe bei niedriger Schaukelgeschwindigkeit bei RaumtemperaturUre für 30 min.
  3. Entfernen Sie das Agarosegel aus dem Färbebehälter, klopfen Sie es sorgfältig auf ein Stück Zellstoffgewebe oder Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie es direkt auf einen Transilluminator. Schalte das UV-Licht ein, um Bänder mit tRNA zu visualisieren. Nehmen Sie ein Foto von dem Gel.
  4. Proteinfärbung (optional).
    1. Die DNA-Färbelösung sicher (nach Sicherheitsverfahren) verwerfen und mit 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) -Lösung ersetzen. Legen Sie das Tablett auf eine Wippe bei Raumtemperatur und Fleck über Nacht (> 12 h). Die CBB-Färbelösung verwerfen und mit 50 mL PBS ersetzen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Für 1 h auf einer Wippe entschuldigen.
  5. Visualisierung von Protein enthaltenden tRNA-Komplexen unter einem leichten Transilluminator und fotografieren das Gel, um mit dem tRNA-UV-Gelbild zu vergleichen.

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Ergebnisse

Große Mengen an tRNA (UUU) können durch Expression des tRNA-Gens in E. coli unter der Kontrolle eines stark induzierbaren T7-Promotors erhalten werden. Die exprimierte tRNA (UUU) akkumuliert im Cytoplasma und ist über den Pool von natürlich reichlich vorhandenen tRNAs angereichert. Ein zweistufiger Reinigungsprozess, der aus einem Einfang / Extraktionsschritt und einem Gelfiltrations- / Polierschritt bestand, wurde verwendet, um eine eTA-Klasse-tRNA zu erhalten. Der Einfang / Ex...

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Diskussion

Der hierin beschriebene Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardierungs-Assay kann auf eine Anzahl von Weisen modifiziert werden. Zuerst kann der Prozentsatz der Agarose im Gel reduziert werden, um die Trennung und Visualisierung von Protein-tRNA-Komplexen signifikant größer zu machen als die hier analysierte (120 kDa). Zweitens, wenn das Zielprotein thermolabile ist, müssen zusätzliche Vorkehrungen getroffen werden, um sicherzustellen, dass die Temperatur unterhalb der maximal akzeptablen Temperatur gehalten wird, indem die Ele...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

MCV ist Mitglied des CIB Intramural Programms "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Die Forschungsergebnisse, die zu diesen Ergebnissen führten, wurden vom spanischen Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 bis MCV), dem spanischen Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R und SAF2015-72961-EXP bis MCV) gefördert ), Die Regionalregierung von Madrid (S2010 / BD-2316 bis MCV) und die Europäische Kommission (Rahmenprogramm 7 (RP7)) Projekt ComplexINC (Vertrag Nr. 279039 bis MCV). Die Förderer hatten keine Rolle in Studienentwurf, Datenerfassung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
E. coli BL21(DE3)Novagen70235DE3 Lysogen enthält T7-Polymerase nach IPTG-Induktion.
pET23dNovagen69748-3pET23d verleiht Resistenz gegen Ampicillin; T7-Promotor.
LB-Brühe, salzarm (Lennox L-Brühe), granuliertesMelfordGL1703Herkömmliche LB-Brühe, hohes Salzgehalt, kann ebenfalls verwendet werden.
AmpicillinSigma-Aldrich10419313
Inkubator Schüttler (thermostatisiert)NBSExcella E24 Es kann jeder Schüttel-Inkubator mit Temperaturregelung verwendet werden.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG), >=99%Acros OrganicsBP1755
Natriumacetat, wasserfrei, >99%MelfordB4017
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Dinatriumsalz, >99%Acros OrganicsAC327205000Gesundheitsschädlich beim Einatmen.
Zentrifuge (gekühlt)Eppendorf5430
Zentrifuge (gekühlt) RotorEppendorf5430/5430P
ZentrifugeSorvallRC5C
ZentrifugenrotorSorvallSLA-3000
Phenollösung, gesättigt mit 0,1 M Citratpuffer, pH 4,3 ± 0,2Sigma-AldrichP4682Akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ), ätzend
Ethanol absolut für die Analyse, 100% v/vMerck Millipore100983
Natriumphosphat zweibasisches Dihydrat, Na2HPO4, >=99%Sigma-Aldrich71643
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4Merck48.730.250
HiLoad 16/60 Superdex 75 GE Healthcare28989333
AgaroseMelfordMB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethan HCl]MelfordT1513
BorsäureMelfordB0503
MikrowelleHaierHDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid]Sigma-AldrichC4706Korrosiv gegenüber Metallen und Haut.
ATP [Adenosin 5′-triphosphat-Dinatriumsalzhydrat], Grad I, >=99%Sigma-AldrichA2383
Magnesiumchlorid (MgCl2), wasserfrei, >=98%Sigma-AldrichM8266
Natriumchlorid (NaCl), >99Fisher BioreagentsBP358
Kaliumchlorid (KCl), >99%MelfordP0515
NZYDNA Ladder VINZYtechMB8901
NetzteilConsortEV261
ElektrophoresegerätReal LaboratoryRELSMINI10
Real Safe NukleinsäurefärbungReal LaboratoryRBMSAFE20.000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF)Syngene2216498
Coomassie Brilliant Blue GSigma-AldrichB0770
Wippe (Gyro-Rocker)StuartSSL3
Mixer Vortex Fisher Marke13214789
%

Referenzen

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
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  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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