Methodenartikel

Dissektion der Maus Bauchspeicheldrüse für histologische Analyse und Metabolic Profiling

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DOI:

10.3791/55647

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19. August 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser video Artikel enthält eine ausführliche Demonstration der Verfahren erforderlich, um erfolgreich die Bauchspeicheldrüse von einer Maus entfernen durch Präparation für histologische Analyse und metabolic profiling.

Zusammenfassung

Wir haben die Bauchspeicheldrüse spezifischen Transkriptionsfaktor, 1a Cre-Rekombinase untersucht; Lox-Stop-Lox-Kristen Ratte Sarkom, Glycin, Asparaginsäure an das 12-Codon (Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / +) Belastung als ein Modell des menschlichen pankreatischen Krebses Maus. Unsere aktuellen Studien soll neue metabolischen Biomarker der Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression ermittelt. Wir haben durchgeführt, metabolic profiling von Urin, Kot, Blut, sowie Pankreas-Gewebe-Extrakte und histologische Analysen der Bauchspeicheldrüse, die Krebsentwicklung zu inszenieren. Die Maus-Bauchspeicheldrüse ist keine wohldefinierte solide Organ wie beim Menschen, sondern ist ein diffus verteilte weichen Gewebe, das nicht leicht zu erkennen ist von Einzelpersonen mit Maus Innere Anatomie nicht vertraut oder von Personen, die wenig oder gar keine Erfahrung durchführen Maus-Organ-Sektionen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine detaillierte schrittweise bieten visuelle Demonstration, Novizen bei der Entfernung der Maus Bauchspeicheldrüse durch Dissektion zu führen. Dieser Artikel sollte besonders wertvoll für Studenten und Forscher neue Forschung, die Ernte der Maus Bauchspeicheldrüse durch Präparation für metabolic profiling oder histologische Analysen benötigt.

Einleitung

Die Maus hat ein wichtiges Tier Modell des menschlichen pankreatischen Krebses1,2entwickelt. In der Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Maus-Modell, die Kristen Ratte Sarkom (K-Ras) Onkogen ist ausschließlich in der Bauchspeicheldrüse, was Einleitung von präkanzerösen Läsionen in der Bauchspeicheldrüse, bekannt als Pankreas intraepitheliale Neoplasie (liegen), dass der Fortschritt aktiviert zu pankreatischen duktalen Adenokarzinome, gemeinhin als PDACs3. Dieses Maus-Modell-System bietet eines der verfügbaren Tiermodelle für menschlichen pankreatischen Krebs4,5, mit dem zusätzlichen Vorteil, die sich die liegen innerhalb der ersten fünf Monate des Lebens und häufig Fortschritte PDAC innerhalb einer einzelne Jahr4,5, während Bauchspeicheldrüsenkrebs am häufigsten bei Menschen 60-70 Jahre alt tritt.

Extraktion der Bauchspeicheldrüse durch Dissektion aus der Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D / + Mäuse in verschiedenen Altersstufen ermöglicht detaillierte längs histologische Untersuchung der Entwicklung von Krebs in der Bauchspeicheldrüse PDAC3,4 von den frühesten Stadien der PanIN durch das Fortschreiten bis , 5. Ernte der Bauchspeicheldrüsenkrebs im Alter von fünf bis fünfzehn Monate Gewebe vorzubereiten Auszüge zu globalen Veränderungen im Pankreas4 Stoffwechsel zu charakterisieren, die auftreten, während der Übergang vom gesunden zum erkrankten Gewebe verwendet werden 6,7.

Dieser Artikel stellt eine komplette visuelle Anleitung die erforderlichen Schritte zum Ausführen einer Maus Bauchspeicheldrüse Extraktion und enthält Richtlinien für die Lagerung der Bauchspeicheldrüse zur weiteren Analyse. Dieses Handbuch wird für Einzelpersonen forschen auf andere Pankreas Erkrankungen, darunter Diabetes Typ I und besonders nützlich für Studenten und Forscher neu in Forschung, die Ernte von Pankreas Maus sollte gleichermaßen wertvoll sein Präparation für metabolic profiling oder histologische Analysen.

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Protokoll

durchgeführt, in dem Video und weiter unten beschriebenen Abläufe von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Universität Miami genehmigt worden.

1. Vorbereitung und Impuls-Test

  1. stellen zwei verschiedene Bereiche für den chirurgischen Eingriff, dem OP-Tisch und dem Post-OP-Tisch. Inszenieren Sie beide Bereiche mit allen Materialien und Utensilien notwendig.
    1. Bühne, die das Betriebssystem Tabelle unter eine belüftete Haube. Ordnen Sie die Tabelle mit der Ausrüstung in einer Weise, die die kontinuierliche und ungehinderte Leistung des Verfahrens erlaubt.
    2. Schaffen eine postoperative Tabelle im selben Raum und in der Nähe der Haupt-Tabelle des Vorgangs. Beide Tabellen als sterile Umgebungen während des Verfahrens zu erhalten.
  2. Ort die folgenden liefert auf dem OP-Tisch: ein Glas mit Deckel, eine 15 mL Tube, einem Paar Chirurgische Scheren, ein Squeeze-Flasche von 70 % Ethanol, zwei Schaumstoffplatten, zwei Zangen, zwei 1 mL 21 Gauge Spritzen, zwei 50 mL Röhrchen ein Zentrifugenröhrchen , eine kryogene Durchstechflasche, vier chirurgischen Pads, zehn Pins, einem Dispenser sterilisieren Tücher und Sharps Container.
  3. Legen Sie die folgenden Lieferungen auf dem Post-OP-Tisch: eine Analysenwaage, einer 4 L Dewar von flüssigem Stickstoff, einem flachen breiten Mund Dewar, einem schwimmenden Reaktionscup Rack, ein paar Chirurgische Scheren, zwei Zangen, vier kryogene Fläschchen und ein Spender von sterile Tücher.
  4. Füllen Sie ein 50 mL und eine 15 mL Tube zu 75 % des Volumens mit Formalin.
  5. Mit einem Stift in jeder Ecke ein OP Pad, ein ca. 30 cm x 30 cm Hartschaumplatten dienen als Dissektion Board befestigen. Nutzen Sie die verbleibenden vier Stifte während des Betriebs. Bereiten Sie eine kleinere Hartschaumplatten mit einem OP Pad übertragen die Organe auf der Post-Op-Tisch.
    Achtung: Isofluran (99,9 %) ist eine giftige Chemikalie, und sollte in einer Abzugshaube verwendet werden, um das Höchstmaß an Sicherheit aus der Aufräumvorgang Narkose Abgas 8 sicherzustellen. Weitere Informationen über die Risiken für die Forscher im Zusammenhang mit der Verwendung der Open-Drop-Methode mit Isofluran finden Sie in einem Artikel von Taylor und Mook 8.
  6. Eine OP Pad in das Glasgefäß und Einweichen mit ein paar Tropfen von Isofluran (99,9 %) und einem Papiertuch über den Rand zu direkten Kontakt der Maus mit der Isofluran zu verhindern. Ebenso eine OP Pad verwenden, um säumen den verbleibenden Schlauch und Tränken mit ein paar Tropfen Isoflurane und legen Sie eine zusätzliche Pad über den Rand zu direkten Kontakt zwischen der Maus und der Isofluran verhindern.
  7. Pour Flüssigstickstoff in den flachen breiten Mund Dewar, bis das Maximum füllen Zeile erreicht ist.
  8. Statt der Maus ausgewählt für die Dissektion in die Narkose Kammer, d. h. das Glasgefäß mit einem Pad, getränkt mit ein paar Tropfen Isofluran (99,9 %) bedeckt mit Deckel, für ~ 1 min.
    Hinweis: Diese Zeit variiert von Maus zu Maus. Sobald die Maus bewusstlos ist, entfernen Sie es aus der Kammer und platzieren Sie es auf das Bedienboard.
  9. Ausrichten die Maus, sodass es Bauchseite bis und mit dem Kopf wies Weg von der Wissenschaftler aufliegt. Legen Sie den Kopf in die Röhre, gesäumt von einer OP Pad getränkt mit ein paar Tropfen von Isofluran (99,9 %), und führen Sie einen Impuls-Test durch eine Prise Fuß um sicherzustellen, dass die Maus nicht auf Reize reagiert.
    1. Wenn dieser Test fehlschlägt und die Maus auf den Fuß Kneiftest reagiert, wiederholen Sie Schritt 1.8.

2. Erster Schnitt, Herz durchbohren und Euthanasie

  1. Pin die Gliedmaßen der Maus auf die chirurgische Dämmplatte und nass die ventrale Seite der Maus mit 70 % igem Ethanol.
  2. Die Fell/Haut in der Nähe der Harnröhrenöffnung mit Zange zusammendrücken und leicht nach oben ziehen. Machen Sie einen Schnitt mit der chirurgische Schere durch die Bauchhöhle der Harnröhrenöffnung auf der Mittellinie beginnend und endend am Kinn.
    1. Nahe des Startpunktes des ersten Schnittes, einseitig das Fell/Haut mit der Zange greifen und machen ein weiterer Schnitt mit der Schere nach unten und schräg in Richtung der hinteren Pfote.
    2. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf die gleiche Weise auf der gegenüberliegenden Seite.
      Hinweis: Die Fell/Haut kann eine breitere Öffnung erstellen festgenagelt werden, aber ist nicht notwendig.
  3. Herzen suchen und entfernen Sie das Perikard, die der Sac in der Herzgegend, zur Vermeidung von Verstopfungen der Spritzennadel ist.
    1. Der Herzbeutel mit der Zange fassen und mit der Schere ausschneiden. Führen Sie die Herz-Punktion durch sorgfältig die Spritzennadel in das schlagende Herz und beginnen Sie langsam den Kolben zurückziehen.
    2. Für die optimale Blutentnahme, verwenden Sie den Kolben der Nadel zu imitieren die Pumpfunktion des Herzens und vermeiden zu schnelles zeichnen.
      Hinweis: In der Regel etwa 1 mL Blut gesammelt werden können.
    3. Nach Abschluss der Blutentnahme, zerstreuen das Blut in die Zentrifugenröhrchen und entsorgen Sie die Spritze in die Scharfbehälter.
    4. Nach der Herz-Punktion durchführen Euthanasie durch Entfernen der Anlagen verbinden Herzen.
      Hinweis: Heparin, ein Antigerinnungsmittel, wurde die Spritze in diesem Verfahren vor Herz durchbohren um das Blut zu gerinnen für Serum-Sammlung in dieser spezifischen Studie ermöglichen nicht hinzugefügt. Jedoch wenn der Forscher Blutgerinnung Sammle Plasma verhindern wollte, Heparin konnte hinzugefügt werden, die Spritze vor der Herz-Punktion.
  4. Wenn die Studie Genotypisierung der Maus beinhaltet, einen Teil des Ohrs mit der Schere schneiden und legen Sie in ein Zentrifugenröhrchen für eine Überprüfung der Genotyp.

3. Bauchspeicheldrüse Extraktion

  1. suchen den Magen auf der linken Seite der Maus. Beginnen Sie vorsichtig (um reißen zu vermeiden) trennt die Bauchspeicheldrüse, Magen und Zwölffingerdarm mit zwei Pinzetten.
    Hinweis: Wenn die Bauchspeicheldrüse vom Magen und Darm zu trennen, ist es sehr wichtig, dass die Zange vorsichtig verwendet werden, um das Pankreas-Gewebe Weg von den Organen zu führen und zu nicht zerdrücken oder reißen die Bauchspeicheldrüse mit der Zange.
    1. Weiterhin die Bauchspeicheldrüse aus den Dünndarm Jejunum und Ileum, trennen und schließlich von der Blinddarm des Dickdarms.
  2. An den Blinddarm, positionieren Sie die Zange und Trennung der Bauchspeicheldrüse entlang der restlichen Doppelpunkt in Richtung Enddarm.
    Hinweis: An dieser Stelle ist es bequem zu schneiden und entfernen den Teil aus dem Magen in die Region des Dickdarms, die unmittelbar vor dem Rektum.
  3. Suchen Sie die Bauchspeicheldrüse und Milz zugeordnet. Schieben Sie die Bauchspeicheldrüse zur rechten Seite der Maus. Trennen Sie die restlichen Verbindungen zwischen der Bauchspeicheldrüse und der Brusthöhle mit der Zange, vollständig zu lösen, der Bauchspeicheldrüse und der angrenzenden Milz.
  4. Die Bauchspeicheldrüse zu entfernen und zur Prüfung verteilt. Lassen Sie die Milz an der Bauchspeicheldrüse zu Identifizierungszwecken befestigt.
    1. Entfernen Sie alle Bindegewebe, Fett und mesenterialen Gewebe aus der Bauchspeicheldrüse.
      Hinweis: Dieses Gewebe ist von weißer Farbe und somit aus dem Gewebe der Bauchspeicheldrüse, das pinker Farbe ist leicht unterschieden werden kann. Dies ist besonders wichtig, wenn die ganze Bauchspeicheldrüse entfernt werden muss. Zum Beispiel, wenn die Bauchspeicheldrüse muss abgewogen und im Vergleich zu Körpergewicht oder zwischen Gruppen von Tieren. In der Ptf1a Cre / +; LSL-Kras G12D / + Mausmodell, speziell in den älteren Monaten harten faserigen Bauchspeicheldrüsen-Gewebe vorhanden sein könnten. In diesem Fall muss sorgfältige Entfernung der Bauchspeicheldrüse durchgeführt werden, da der Darm im Tumorgewebe interlaced sein könnte. In fortgeschrittenen Fällen abnorme Milz und Leber können auch vorhanden sein.
  5. Auf Wunsch entfernen andere Organe an dieser Stelle.

4. Datenerhebung und-Speicherung

  1. nach der Extraktion der Organe, verschieben die Proben in den postoperativen Bereich für Erhaltung.
  2. Wiegen jedes Organ und legen Sie sie in ihre jeweiligen kryogenen Vial.
    Hinweis: entlang with die Masse jeder Probe sollte etwaige Unregelmäßigkeiten zu Referenzzwecken aufgezeichnet werden.
  3. Sobald die Organe gewogen sind, legen Sie sie in den flüssigen Stickstoff für Snap einfrieren.
  4. Nach dem Fang Einfrieren, aufbewahren der Organe bei-80 ° C für die Langzeitspeicherung.
  5. Stellen die Formalin aufbewahrt Proben auf der Bank-Oberseite über Nacht und am nächste Morgen ändern ihre Lösung von Formalin in 70 % igem Ethanol.
    Hinweis: Diese Beispiele sollten gespeichert werden, bei 4 ° C für die Langzeitspeicherung.
  6. Für langfristige Lagerung, Einfrieren die Blut und Ohr Punch bei-80 ° c. Lassen Sie für Serum-Sammlung aus dem Blut das Blut gerinnen für 30 min dann Zentrifugieren sie. Die Serum-Teil mit einer Pipette zu entfernen und dann speichern bei-80 ° c

5. Clean Up

  1. desinfizieren die Dissektion Werkzeuge mit der Sterilisation Tücher. Verschluss der Röhre, gesäumt von den Isofluran getränkt OP Pad. Ersetzen Sie die OP Pad auf der Dämmplatte mit einem frischen OP Pad. Entsorgen Sie die Teile der Maus, die nicht pro Anlage gesammelt wurden ' s Tier Entsorgung Politik.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über den Arbeitsbereich Umwelt und Abbildung 2 zeigt das Post-OP-Feld. Während diese Einstellung die minimale Menge an Ausrüstung bietet und Inszenierung, Einzelpersonen dies am besten individuell verändern können. Das Protokoll sollte entsprechend den spezifischen Bedürfnissen des Experiments optimiert werden. Dieses Verfahren wird in einer Weise durchgeführt, die das Leben einer Maus, erfordern ...

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Diskussion

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden
Während andere informelle Videos von Maus Sezierungen vorhanden sind, in diesem video Artikel finden die ersten Profi-Qualität, Peer review, visuelle Demonstration aller die detaillierten Schritte erforderlich für die Extraktion und die Ernte von der Maus Bauchspeicheldrüse durch Dissektion10 . Mit der Bauchspeicheldrüse wird eine Hauptorgel für metabolische Aktivität und Insulin ermöglicht Produktion, Dissektion und Ernte der Bauch...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

MAK bestätigt Unterstützung für diese Arbeit von den National Institutes of Health / National Cancer Institute grant-Nummer - 1R15CA152985-01A1. Dieses Projekt wurde auch von Miami University Undergraduate Research Award Program, die Miami University Doktorat-Studium Möglichkeiten für Scholarship Program und der Miami University Sommer Scholars Program unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Glas  Corning3140-150Das im Video verwendete Glas wird nicht mehr hergestellt. Dies ist sein Ersatz.
Deckel des GlasesCorning9985-150Der im Video verwendete Glasdeckel wurde nicht mehr hergestellt.  Dies ist sein Ersatz.
15 mL Falcon TubesFisher Scientific339650
Chirurgische SchereFisher Scientific9201
QuetschflascheFisher Scientific03-409-10DD
100% EthanolFisher Scientific22-032-103
FormalinFisher Scientific245-684
SchaumstoffplattenTherapak562908
PinzetteFisher Scientific200205SHN
1 mL 21G SpritzenBD Biosciences309624
50 mL Falcon RöhrchenFisher Scientific339652
2,0 mL Mikrozentrifugenröhrchen Fisher Scientific02-681-258
OP-PadsFisher ScientificS67011
T-Pins Länge:  2" Advance Store ProductsX32T-05
SterilisationstücherProfessional Disposables International Inc.Q85084
Behälter für scharfe GegenständeFisher Scientific14-827-122
AnalysenwaageMarshall ScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Flache Weithals-DewarFisher ScientificF3087-V
Schwimmendes MikroröhrchengestellVWR60986-100
Kryo-Fläschchen 1,2 ml, sterilFisher Scientific10-500-25
Isothesie (Isofluran)Henry Schein Tiergesundheit050033
FlüssigstickstoffWright BrothersNIT-60-XX
Maus Kras StammThe Jackson LaboratoryOO8179
Maus Cre StammMMRRCOOO435-UNC

Referenzen

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