Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Summary

Wir präsentieren eine Softwarelösung zur halbautomatischen Verfolgung der relativen Proteinkonzentration entlang der Länge der dynamischen zelligen Vorsprünge.

Abstract

Filopodien sind dynamische, fingerähnliche zelluläre Vorsprünge, die mit Migration und Zell-Zell-Kommunikation verbunden sind. Um die komplexen Signalisierungsmechanismen, die der filopodialen Initiation, der Dehnung und der anschließenden Stabilisierung oder dem Retraktion zugrunde liegen, besser zu verstehen, ist es entscheidend, die räumlich-zeitliche Proteinaktivität in diesen dynamischen Strukturen zu bestimmen. Um die Proteinfunktion in Filopodien zu analysieren, haben wir vor kurzem einen halbautomatischen Tracking-Algorithmus entwickelt, der sich an filopodiale Formänderungen anpasst und so eine parallele Analyse der Protrusionsdynamik und der relativen Proteinkonzentration entlang der gesamten filopodialen Länge ermöglicht. Hier stellen wir Ihnen ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll für optimierte Zellhandling, Bilderfassung und Softwareanalyse vor. Für die Verwendung von optionalen Merkmalen während der Bildanalyse und der Datendarstellung stehen wir Ihnen weiter zur Verfügung, sowie Leitfaden zur Fehlerbehebung für alle kritischen Schritte auf dem Weg. Schließlich beinhalten wir auch einen Vergleich der dBeschreibende Bildanalyse-Software mit anderen Programmen zur Filopodien-Quantifizierung. Zusammen stellt das vorgestellte Protokoll einen Rahmen für eine genaue Analyse der Proteindynamik in filopodialen Vorsprüngen mit Bildanalyse-Software dar.

Introduction

Die räumlich-zeitliche Kontrolle von Aktin-regulatorischen Proteinen ist mit der Filopodium-Dynamik ^{1 , 2 verbunden} . Die Verfolgung der räumlich aufgelösten Proteinkonzentration entlang der gesamten filopodialen Länge durch die Zeit ist daher entscheidend, um unser Verständnis der Mechanismen, die der Einleitung, der Dehnung, der Stabilisierung oder dem Zusammenbruch dieser dynamischen Strukturen ^{3 , 4} zugrunde liegen, voranzutreiben. Im Gegensatz zur Proteinanalyse im Cytosol, wo viele Zellformveränderungen in einem größeren Maßstab auftreten, sind ....

Protocol

1. Zellkultur

1. Kultur-HeLa- oder COS-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g / l D-Glucose, L-Alanin-L-glutamintipeptid, Pyruvat, 10% fötalem Rinderserum und 10 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin. Kultur-Neuronen in Kulturmedien ohne L-Glutamin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, ergänzt mit 0,5 mM L-Alanin-L-glutamin-Dipeptid, serumfreien neuronalen Nahrungsergänzungsmitteln und 10 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin.
2. Sobald 40% Konfluenz erreicht ist, transfizieren Zellen mit Konstrukten der Wahl mit einem Transfektionsreagenz nach Herstelleranweisungen. Halten Sie transfizierte Zellen im Inkubator bei 37 ° C und 5....

Results

Unter Verwendung von COS-Zellen, die mit einem Marker für filamentösen Actin (f-Tractin ¹⁸ , rot) und einem cytosolischen Referenz (grün) transfiziert wurden, fanden wir aktinreiche filopodiale Vorsprünge ( Abbildung 3A , obere Platte). Zeitreihen zeigten, dass Filopodien sich schnell ausdehnen und zurückziehen ( Abbildung 3A , Mitteltafel). Mit der Bildanalyse-Software haben wir dann einzelne Filopodien .......

Discussion

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfolgung der filopodischen Wachstumsdynamik und der Analyse der relativen Proteinkonzentrationen in diesen dynamischen Strukturen über den konvexen Rumpfalgorithmus vor. Mit der Software können bis zu 3 Kanäle paarweise in einem einzigen Durchlauf verglichen werden, wobei die relativen Konzentrationen von zwei Kanälen ( dh Proteinen) während des gesamten Extensions- / Retraktionszyklus bestimmt und als Bild- und Datendateien in separaten Ordnern gespeichert wer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% fötales Rinderserum	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamin 2000	Life Technologies	11668-027
1% Penicillin/Streptomycin	Biochrom AG	12212
Neurobasales Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (1M Stammlösung)	Life Technologies	15630
Citrin-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institut DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Institut DSMZ	ACC-60
3T3 Zellen	Leibniz Institut DSMZ	ACC-59
Mikroskop	Nicon Eclipse
Kamera	Andor	DU888 Ultra
Konfokale Einheit	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvat	Gibco	31966-021