Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

11K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/55658

⸱

10. Juli 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Center Utrecht, 2Department of Pharmaceutics, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.

Zusammenfassung

Blutplättchen sind wesentliche Akteure in der Hämostase, die Bildung von Thromben, um vaskuläre Brüche zu versiegeln. Sie sind auch an Thrombose beteiligt, die Bildung von Thromben, die das Gefäßsystem verschlingen und Organe verletzen, mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Dies motiviert die wissenschaftliche Forschung zur Thrombozytenfunktion und die Entwicklung von Methoden zur Verfolgung zellbiologischer Prozesse, wie sie unter Strömungsbedingungen auftreten.

Für die Untersuchung der Thrombozytenadhäsion und -aggregation stehen eine Vielzahl von Strömungsmodellen zur Verfügung, zwei Schlüsselphänomene in der Thrombozytenbiologie. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Vollendung der Plättchendegranulation unter der Strömung während der Aktivierung zu untersuchen. Das Verfahren nutzt eine Strömungskammer, die mit einem Spritzenpumpenaufbau gekoppelt ist, der unter einem Weitfeld-, invertierten LED-basierten Fluoreszenzmikroskop angeordnet ist. Der hier beschriebene Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Erregung von mehreren Fluorophoren, die von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Fluoreszenzen abgegeben werdenEntfärbt. Nach Live-Zell-Imaging-Experimenten können die Deckgläser mit statischer Mikroskopie ( dh konfokale Mikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie) weiterverarbeitet und analysiert werden.

Einleitung

Plättchen sind anucleare Zellen, die im Blutstrom zirkulieren. Ihre Hauptfunktion ist es, vaskuläre Brüche an Orten der Verletzung zu versiegeln und Blutverlust zu verhindern. An diesen Verletzungsorten werden subendotheliale Kollagenfasern exponiert und anschließend durch das multimere Protein, von Willebrand-Faktor (VWF) abgedeckt. VWF interagiert mit den Plättchen im Kreislauf in einem Mechanismus, der von dem Ibcoprotein Ibα-IX-V-Komplex auf der Zelloberfläche 1 abhängt, was die Geschwindigkeit der Thrombozyten verlangsamt. Dies ist besonders wichtig bei hohen Scherraten. Die Thrombozyten unterliegen anschließend morphologischen Veränderungen, während sie Aktivierungsimpulse aus Kollagen erhalten. Dies führt zu einer irreversiblen Ausbreitung und schließlich zu einer Blutplättchenaggregation. Beide Prozesse hängen von der Sekretion von Granulatinhalten ab, um das Plättchen-Plättchen-Übersprechen zu erleichtern. Unter anderem enthalten die Plättchen-α-Granulate Fibrinogen und VWF, um die Plättchenadhäsion zu unterstützen und zu überbrückenPlättchen zusammen in einer integrinabhängigen Weise. Die Thrombozyten-dichten Granulate enthalten anorganische Verbindungen 2 , einschließlich Calcium und Adenosindiphosphat (ADP), die zur Verstärkung der Thrombozytenaktivierung beitragen. Weiterhin enthalten die Blutplättchen Mediatoren von (allergischen) Entzündungen 3 , komplementkontrollierenden Proteinen 4 und Angiogenesefaktoren 5 , 6 , wobei die Frage aufgeworfen wird, ob und wie diese Inhalte unter verschiedenen Bedingungen unterschiedlich freigesetzt werden.

Seit den 1980er Jahren ist die Untersuchung der Thrombozytenfunktion in Strömungsmodellen für die Untersuchung von thrombotischen Mechanismen wertvoll 7 . Seitdem wurden viel technischer Fortschritt gemacht, und Strömungsmodelle, die die Fibrinbildung einschließen, werden derzeit entwickelt, um das hämostatische Potential von therapeutischen Thrombozytenkonzentraten ex vivo 8 oder zu untersuchenUntersuchen den Einfluss von Störungen der Scherraten auf die Thrombusmorphologie 9 . Die Unterschiede in den molekularen und zellbiologischen Mechanismen, die eine stabile Adhäsion und physiologische Thrombusbildung (Hämostase) gegenüber der pathologischen Thrombusbildung (Thrombose) antreiben, können sehr subtil sein und die Entwicklung von Strömungsmodellen motivieren, die die Echtzeit-Visualisierung dieser Subzellulären ermöglichen Prozesse.

Ein Beispiel für ein Verfahren, für das ein solches Setup wertvoll wäre, ist die (Re-) Verteilung von intrazellulärem Polyphosphat und die Rekrutierung von Gerinnungsfaktoren, um den zeitabhängigen Einfluss, den dies auf die Fibrin-Ultrastruktur 10 hat, aufzudecken. Studien sind oft auf Endpunktanalysen beschränkt. Das Hauptziel der beschriebenen Methode ist es, die visuelle visuelle Untersuchung von dynamischen subzellulären Prozessen zu ermöglichen, die während der Thrombozytenaktivierung unter Strömung stattfinden.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Das örtliche medizinische Ethikkomitee des Universitätsklinikums Utrecht genehmigte die Zeichnung von Blut für Ex-vivo- Forschungszwecke, einschließlich derjenigen dieser Studie.

1. Lösungsvorbereitung

  1. Zubereitung eines 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinansulfonsäure- (HEPES) Tyrode-Puffers durch Auflösen von 10 mM HEPES, 0,5 mM Na 2 HPO 4 , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 und 5,55 mM D- Glukose in destilliertem Wasser.
    1. Machen Sie zwei Varianten des Puffers: Stellen Sie den pH-Wert bei 6,5 bzw. 7,4 ein. Machen Sie frischen Puffer für jeden Tag der Experimente. Ergänzung mit 10 ng / mL Prostacyclin wo angegeben.
  2. Bereiten Sie TRIS-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) vor, indem Sie 50 mM Tris und 150 mM NaCl in destilliertem Wasser auflösen und den pH-Wert auf 9,0 einstellen.
  3. Säurecitrat-Dextrose (ACD) durch Auflösen von 85 mM Tri-Natriumcitrat, 71 mM Zitronensäure und 111 mM D-Glucose in disWasser.
  4. Vorbereitung einer Fixierlösung durch Zugabe von 2% (v / v) Paraformaldehyd (PFA) zu HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4. Hitze auflösen (50 - 70 ° C) und den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Aliquot und bei -20 ° C aufbewahren. Tauen bei 37 ° C vor Gebrauch.
  5. Stickstoffpuffer durch Auflösen von 1% (m / v) Humanserumalbumin (HSA) in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, vorbereiten
  6. Eine Polyvinylalkohol-Lösung durch Zugabe von 4,8 g Polyvinylalkohol zu 12 g Glycerin zugeben und gut vermischen. 12 ml destilliertes Wasser zugeben und bei Raumtemperatur über Nacht auf einen Rotator geben.
    1. Zugabe von 24 ml 0,2 M Tris-HCL, pH 8,5. Bei 30 ° C auf 50 ° C erhitzen. 1,25 g 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) zugeben und gut vermischen. Zentrifuge bei 1.500 xg für 5 min. Aliquot der Überstand (1 ml reicht für 15-20 Folien) und bei -20 ° C lagern. Benutze die Aliquote einmal.

2. Deckglas-Vorbereitung

  1. Entfetten Sie die AbdeckungGläser (25 x 50 mm 2 ) durch Inkubieren über Nacht in unverdünnter Chromschwefelsäure. Spülen Sie die Deckgläser mit destilliertem Wasser ab und trocknen Sie sie über Nacht bei 60 ° C in einem Ofen.
  2. Halten Sie einen Streifen eines Paraffinfilms (10 x 15 cm 2 ) auf eine Laborbank mit einem Tropfen Wasser und entfernen Sie die Luft durch Glätten des Paraffinfilms. Pipettieren Sie 80 μl Tropfen von 10 μg / mL VWF oder 100 μg / ml Fibrinogen auf den Paraffinfilm. Legen Sie die Brille auf die Tropfen; Die Proteinlösung wird sich zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die gesamte Rückseite des Glases zu bedecken. Inkubieren für 1,5 h bei Raumtemperatur (RT).
  3. Entfernen Sie den Paraffinfilm und blockieren Sie die Deckgläser, indem Sie sie mit der beschichteten Seite nach oben in eine 4-Well-Platte mit Blockierpuffer legen. 1 Stunde bei 37 ° C oder Nacht bei 4 ° C inkubieren. Als Kontrolle blockieren Sie ein Deckglas, das nicht mit VWF oder Fibrinogen beschichtet wurde.

3. Herstellung von plättchenreichem Plasma (PRP)

  • Sammeln Sie citriertes Vollblut (Endkonzentration: 0,32% Natriumcitrat (M / V)) durch Venenpunktion.
  • Das Blut für 15 min bei 160 xg und RT ohne Bremse zentrifugieren. Sammle den Überstand ( dh den PRP) mit einer Plastik-Pasteurpipette.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation können drei Schichten beobachtet werden (von oben nach unten): PRP, weiße Blutkörperchen und rote Blutkörperchen. Achten Sie darauf, die weißen und roten Zellen nicht einzuschließen. Typischerweise können nach der Zentrifugation eines 9-ml-Blutröhrchens 3 ml PRP gesammelt werden.
  • Weiter mit Abschnitt 4, wenn das Experiment mit gewaschenen Plättchen durchgeführt wird. Wenn PRP gewünscht wird, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
  • Nach der PRP-Auffangung wird der Rest des Blutes (mit dem roten Zellpellet) für 10 min bei 2.000 xg ohne Bremse zentrifugiert. Sammle den Überstand, der das Plättchen-arme Plasma (PPP) enthält.
    HINWEIS: In der Regel können 2 ml nach diesem zweiten Zentrifugationsschritt gesammelt werden.
  • Zähle die Nummer des pSpalte im PRP auf einem Zellanalysator und verdünnen sie mit dem PPP (Schritt 3.4) auf eine Konzentration von 150.000 Thrombozyten / μL.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen des verdünnten PRP hängt von der Thrombozytenzahl des Spenders ab. Die Plättchenzahlen variieren stark zwischen den Spendern, und die PRP-Verdünnung erfordert eine individuelle Einschätzung. Plättchenzählungen gelten als normal, wenn innerhalb von 150.000 und 450.000 Thrombozyten / μL.
  • Weiter mit Abschnitt 5.

    • 4. Vorbereitung von gewaschenen Plättchen

    1. Bestimmen Sie das mittlere Plättchenvolumen (MPV) im PRP mit einem Zellanalysator.
      HINWEIS: Dies ist ein Indikator für die Plättchen-Voraktivierung 11 . Ein normaler MPV für die Rettung von Plättchen ist 7,5-11,5 fL 11 . Der MPV sollte während des Plättchenwaschvorgangs nicht um mehr als 1,5 fl ansteigen.
    2. Füge 1/10 Volumen ACD zu PRP hinzu, um Thrombozytenvoraktivierung zu verhindern und 15 min bei 400 xg und RT ohne Bremse zu zentrifugieren. Den su entfernenPernieren und das Pellet vorsichtig in HEPES Tyrode-Puffer, pH 6,5, auf das ursprüngliche Volumen von PRP aufsetzen.
    3. Tauen Sie ein Aliquot von Prostacyclin durch Zugabe von TBS zu einer Konzentration von 10 μg / ml; Halten Sie es auf Eis.
    4. Um die Thrombozytenaktivierung zu verhindern, füge Prostacyclin bei einer Endkonzentration von 10 ng / mL zu den wieder suspendierten Plättchen hinzu und zerkleinere 15 Minuten lang bei 400 xg und RT ohne Bremse. Den Überstand entfernen und das Pellet vorsichtig in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7.4, wieder suspendieren.
    5. Zählen Sie die Anzahl der Plättchen (Schritt 3.5) und bestimmen Sie die Änderung in MPV (Schritt 4.1) (die MPV sollte nicht mehr als 1,5 fL ändern).
    6. Die Anzahl der Thrombozyten mit HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf eine Konzentration von 150.000 Thrombozyten / μL einstellen. Lassen Sie die Thrombozyten für 30 Minuten bei RT vor den Experimenten zurück. Verwenden Sie gewaschene Plättchen für Experimente innerhalb von 4 h nach der Isolierung.

    5. Durchflusskammermontage

    HINWEIS: Diese Experimente nutzen eine eigenentwickelte Strömungskammer 12 . Es können eine Vielzahl von handelsüblichen Strömungskammern verwendet werden, solange sie ein Deckglas halten können, das vorzugsweise für weitere Analysen abnehmbar ist. Die für die beschriebenen Experimente verwendete Strömungskammer besteht aus Poly (methylmethacrylat), um eine Mikroskopeinsatzstufe genau zu platzieren. Es enthält einen Einlass und Auslass ( Abbildung 1A - C ; 1, 2) sowie einen Vakuumanschluss ( Abbildung 1A und C ; 3). Eine kundenspezifische Silikonfolie ( Abbildung 1A und D ; 4) wird oben aufgesetzt. Zwei Ausschnitte bilden Vakuumkanäle ( Fig. 1A und D ; 5), um das Deckglas ( Fig. 1A ; 6) fest an der Kammer anzubringen. Eine zentrale Aussparung bildet den Strömungskanal ( Fig. 1A Und D ; 7; 2,0 mm Breite und 0,125 mm Höhe). Der Einlass und der Auslass sind mit dem Strömungskanal verbunden und das Vakuum ist mit dem Vakuumkanal verbunden.

    1. Decken Sie die Oberseite der Durchflusskammer mit destilliertem Wasser ab und legen Sie die kundenspezifische Silikonfolie mit der glatten Seite nach unten auf das Wasser. Schwimmen Sie das Blatt in Position, indem Sie überschüssiges Wasser entfernen, während das Blatt in Position gehalten wird.
      HINWEIS: Diese Silikonfolie ist wiederverwendbar (Silikon ist bekannt für seine inerten Eigenschaften); In der Regel wurden Thrombozyten nicht beobachtet, um sie anzubringen. Die Blätter können mit Spülmittel gereinigt und wiederverwendet werden, bis das Material beschädigt wird ( dh das Reißen, insbesondere im Bereich zwischen den Kanälen). Im Allgemeinen kann ein Blatt für 20 Tage mit mehreren Experimenten pro Tag verwendet werden.
    2. Die Strömungskammer für 1 h bei 60 ° C inkubieren, um das restliche Wasser zu verdampfen, um die Silikonfolie fest an der Strömungskammer zu haften.
    3. Mit einer Plastik Pasteur Pipette, fügen Sie einen Tropfen vonHEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf den Strömungskanal. Legen Sie das Deckglas (siehe Abschnitt 2) mit der beschichteten Seite nach unten auf den Strömungskanal. Befestigen Sie die Vakuumpumpe am Vakuumanschluss ( Abb. 1A und C ; 3). Tragen Sie ~ 10 kPa Druck auf.

    6. Vorfärbung der Plättchen und Vorbereitung der Antikörper

    1. Plättchenfärbung
      1. Inkubieren der gewaschenen Plättchen mit 10 μg / ml DAPI für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Um das ungebundene DAPI zu waschen und die Thrombozytenaktivierung zu verhindern, füge Prostacyclin bei einer Endkonzentration von 10 ng / mL hinzu und sofort 15 min bei 400 xg und RT ohne Bremse zentrifugieren.
      2. Das Plättchenpellet in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, auf eine Plättchenkonzentration von 150.000 Thrombozyten / μL rekonstituieren.
    2. Vorbereitung von Antikörpern
      1. Mischen Sie Biotin-markierten Antikörper mit Alexa-markiertem StrepTavidin in einem Molverhältnis von 1: 1. Inkubieren für mindestens 10 min bei Raumtemperatur vor Gebrauch (Schritt 7.6).
        HINWEIS: Die Biotin-Markierungseffizienz kann zwischen verschiedenen Chargen variieren. Sollte es Probleme mit der Visualisierung von Zielmolekülen geben, sollten Kontrollexperimente durchgeführt werden, um die erfolgreiche Biotinylierung zu bestätigen, sowie die Target-Bindungseigenschaften des spezifischen biotinylierten Antikörpers.

    7. Perfusion

    1. Starten Sie das Fluoreszenzmikroskop sowie die Mikroskop-Software. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Mikroskopeinstellungen.
      HINWEIS: Das Mikroskop und die Aufzeichnungseinstellungen für die Live-Zell-Visualisierung und Aufzeichnung der Thrombozyten und der gewählten fluoreszenzmarkierten Antikörper und / oder Farbstoffe durch Laden eines geeigneten Experiments in die Mikroskop-Software einleiten. Fließversuche bei RT durchführen.
    2. Blockieren Sie den Einlassschlauch, indem Sie eine 10-ml-Spritze an den Schlauch anschließen und 1% HSA-Block austretenKochen Puffer in den Einlass Schlauch. 15 min bei RT inkubieren. Spülen Sie den Einlassschlauch durch Ansaugen von HEPES Tyrode's Puffer, pH 7,4, in den Einlassschlauch.
    3. Verbinden Sie den blockierten Einlassschlauch und den unbehandelten Auslassschlauch, beide mit einem Durchmesser von 1,02 mm und einer Länge von 20 bis 30 cm zum Einlass und Auslass der Kammer. Verbinden Sie eine 10-ml-Spritze (oder weniger Volumen für mehr Genauigkeit) mit dem Auslassschlauch. Schalten Sie die Spritzenpumpe ein.
      HINWEIS: Der Durchmesser der Spritze bestimmt in Kombination mit der an der Pumpe eingestellten Durchflussmenge den volumetrischen Durchfluss. Zusammen mit der Oberfläche des Strömungskanals kann die Schergeschwindigkeit nach der Formel 13 berechnet werden unten. Somit ist es möglich, die Scherrate durch Ändern der Strömungsgeschwindigkeit der Spritzenpumpe zu manipulieren oder die Abmessungen des Strömungskanals zu verändern. Eine Scherrate von 800-1.600 s -1 typischerweise für arterieller Blutfluss, während 25 - 100 s-1 Modelle für venöses Blutfließen. Für diesen Aufbau ergibt eine Durchflussrate von 7,5 μl / min eine Scherrate von 25 s -1 .
      Scherrate = 6Q / h 2 W in s -1
      Wobei: Q = volumetrische Durchflussrate (mL / s), h = Höhenkanal (cm) (0,015 cm, dies ist die Dicke der Silikonfolie), w = Breite Kanal (cm) (0,2 cm in dieser Kammer).
    4. Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf ein 100faches Objektiv (Gesamtverstärkung von 1.000X) und montieren Sie die Kammer auf dem Mikroskop mit der Glasoberfläche nach unten.
    5. Setzen Sie den Einlassschlauch in ein Rohr mit HEPES Tyrode's Puffer, pH 7.4. Ziehen Sie den Kolben der Spritze manuell an den Auslaufschlauch und ziehen Sie die Lösung durch die Kammer, um die Luft aus dem System zu entfernen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe ( Abbildung 1B und C ; 8) und führen Sie die Pumpe kurz, um den Kolben zu spannen und sorgen Sie für einen stabilen Durchfluss.
    6. Füge Antikörper und / oder Farbstoffe der Plättchen-Suspension oder PRP vorsichtig hinzuMit einer Plastikpipette vermischen und die Mischung auf ein 1,5-ml-Röhrchen überführen.
      HINWEIS: Für eine typische 30-minütige Perfusion bei einer Schergeschwindigkeit von 25 s-1 (7,5 μl / min) wird ein Minimum von 225 μl Plättchen-Suspension benötigt. Die für die repräsentativen Ergebnisse verwendeten Antikörper sind in Tabelle 2 gezeigt .
    7. Bewegen Sie den Einlaßschlauch, während er aus dem HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4, in ein 1,5-ml-Röhrchen, das entweder PRP oder die gewaschenen Plättchen und die Antikörper und / oder Farbstoffe enthält ( Fig. 1B und C ; 9), gedrückt wird.
      HINWEIS: Es ist wichtig, dass beim Überführen des Schlauches der Schlauch gepresst wird (Druckluft), um zu verhindern, dass Luft in den Schlauch eindringt. Es ist möglich, adhärierende Plättchen mit einer Vielzahl von Reagenzien in einem nachfolgenden Schritt zu behandeln, indem man den Einlaßschlauch in ähnlicher Weise zu einem anderen Rohr bewegt. Eine Liste von potentiell nützlichen Reagenzien ist in Tabelle 3 angegeben .
    8. Wähle die "live visualizatio"N "-Option in der Software, fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche des beschichteten Deckglases und starten Sie die Pumpe mit einer Schergeschwindigkeit von 1.600 s-1 (484 μl / min), bis die Plättchen in die Durchflusskammer gelangen. Verringern Sie die Schergeschwindigkeit auf 25 s-1, indem Sie die Einstellungen der Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 7,5 μl / min ändern.
    9. Überwachen Sie die Oberfläche der beschichteten Seite des Deckglases, warten Sie, bis das erste Plättchen anfängt zu haften, fokussieren Sie das Mikroskop auf dieses Plättchen und starten Sie die Aufnahme, indem Sie das Experiment in der Software initiieren. Siehe Tabelle 1 für die hier verwendeten Aufnahmeeinstellungen.
    10. Folgen Sie der Liveaufnahme visuell. Nach 30 min die Spritzenpumpe stoppen.
      HINWEIS: Sicherstellen, dass die Plättchen im Laufe des Experiments im Fokus bleiben. Typischerweise befestigen 20-30 Thrombozyten im Gesichtsfeld bei einer Vergrößerung von 1.000X; Das sind etwa 2.000-3.000 Plättchen im ganzen Strömungskanal.
    11. Fixierung mitDie Durchflusskammer (optional).
      1. Wenn die Strömung nach dem Stoppen der Spritzenpumpe gestoppt ist, den Einlassschlauch (luftfrei) in die Fixierlösung überführen. Starten Sie die Pumpe neu und füllen Sie den Fixierungspuffer durch den Kanal für mindestens 10 min mit der gleichen Durchflussrate wie in Schritt 7.8 beschrieben.
    12. Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop, reinigen Sie das Tauchöl aus dem Glas, trennen Sie das Vakuum und entfernen Sie das Deckglas vorsichtig mit einer 18 G-Nadel aus der Kammer.
      HINWEIS: Verhindern, dass das Deckglas brechen und das Silikonblech beschädigt.
    13. Legen Sie den Deckel (mit den Zellen nach oben gerichtet) in eine 4-Well-Platte auf ein Gewebe, vorbestimmt mit destilliertem Wasser.
      HINWEIS: Dadurch wird verhindert, dass das Deckglas an der Wannenoberfläche haftet und das Trocknen verhindert.
    14. 750 μl Fixierlösung auf das Deckglas pipettieren und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. Falls die Proben nicht direkt analysiert werden können,Lagern sie in 0,5% PFA (verdünnt durch HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4) bei 4 ° C, um eine stabile Fixierung zu gewährleisten. Fahren Sie mit Abschnitt 8 fort, um das Deckglas für die Bildgebung zu verarbeiten.
    15. Nach dem Gebrauch spülen Sie die Kammer, die Schläuche und die Platte mit destilliertem Wasser und inkubieren über Nacht in einer Waschmittellösung. Vor der Wiederverwendung der Kammer und anderer Komponenten mit destilliertem Wasser abspülen.
    16. Speichern Sie die Mikroskop-Rohdatendateien, die alle Metadaten enthalten. Wenn nötig, exportiere die Filme in .MOV, h.264 komprimiert oder .AVI unkomprimiert. Speichern Sie einzelne Frames als JPEG- oder TIF-Dateien.

    8. Probenvorbereitung für konfokale Fluoreszenzmikroskopie

    1. Übertragen Sie die Deckgläser auf neue 4-Well-Platten und spülen Sie 5 mal mit 3 ml HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4. 3 ml / Vertiefung des Blockierungspuffers zugeben und 1 h bei RT inkubieren.
    2. Entfernen Sie den Blockierpuffer. 3 ml / Vertiefung von 0,15% Glycin (M / V) in HEPES Tyrode-Puffer, pH 7,4; Und 15 min bei R inkubierenT.
    3. Glycinlösung entfernen und 5 mal in 3 ml / Vertiefung des Blockierungspuffers waschen. Gegebenenfalls fügen Sie Fluorophor-konjugierte Antikörper hinzu, die in Blockierungspuffer für zusätzliche Färbung verdünnt sind. Inkubieren für 1 h bei RT im Dunkeln.
    4. 5 mal mit Blockierungspuffer und 2 mal mit destilliertem Wasser waschen. Trocknen Sie das Glas, indem Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Gewebe (von den Kanten nach innen) entfernen, ohne die Zellen zu berühren.
    5. 25 μl Polyvinylalkohol-Lösung auf einen Objektträger pipettieren. Legen Sie das Deckglas mit den Zellen nach unten auf den Tropfen und lassen Sie den Polyvinylalkohol zwischen den beiden Flächen verteilen. Inkubieren über Nacht bei RT im Dunkeln.
    6. Analysieren Sie die Zellen durch konfokale Mikroskopie 14 .
    7. Speichern Sie die Rohdaten der aufgezeichneten Stapeldaten, die alle Metadaten enthalten. Wenn nötig, verarbeiten Sie die Rohdaten-Dateien in MOV, h.264 komprimiert oder .AVI unkomprimierte Dateien. Speichern Sie separate Stacks als JPEG- oder TIF-Dateien.

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Ergebnisse

    Fig. 1 zeigt Bilder der Strömungskammer und des experimentellen Aufbaus; Die Lage und die Abmessungen des Siliziumblechs; Und Schlauchverbindungen. Abbildung 2 gibt Auskunft über die Abmessungen der Durchflusskammer. Abbildung 3 und Film 1 zeigen eine Zeitreihe von Bildern der Plättchenadhäsion und Ausbreitung auf immobilisiertem VWF. CD63 ist ein Transmembranprotein, das in die Mem...

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Diskussion

    Weltweit ist Thrombose eine führende Todesursache und Morbidität, und Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur lebenden Zellenabbildung von Thrombozyten-Degranulation unter Strömung. Es wird allgemein angenommen, dass bei der Aktivierung von Blutplättchen alle körnigen Inhalte direkt in Lösung gelangen. Die begleitenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies nicht unbedingt der Fall ist. Während der Adhäsion und Degranulation behalten die Plättchen eine sig...

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Offenlegungen

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Danksagungen

    CM erkennt die finanzielle Unterstützung der Internationalen Patientenorganisation für C1-Inhibitor-Defizite (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht und der Landsteiner Stiftung für Bluttransfusionsforschung (LSBR) an.

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) VWR441476L
    Na2HPO4SigmaS-0876
    NaClSigma31434
    KClSigma31248
    MgSO4Merck KGaA1,05886
    D-GlukoseMerck KGaA1,04074
    Prostacyclin Cayman Chemical18220
    TrinatriumcitratMerck KGaA1.06448
    ZitronensäureMerck KGaA1.00244
    DeckgläserMenzel-Glä serBBAD02400500#A24 x 50 mm, Nr. 1 = 0,13 - 0,16 mm Dicke.
    Chromschwefelsäure (2% CrO3)Riedel de Haen07404CAS [65272-70-0].
    Von-Willebrand-Faktor (VWF)hauseigene gereinigte
    Fibrinogen-Enzym-ForschungslaboratorienFIB3L
    4-Well-Schale, unbehandeltThermo Scientific267061
    Humanserumalbuminfraktion VHaem Technologies Inc.
    Blutentnahmeröhrchen, 9 ml, 9NC Gerinnungsnatriumcitrat 3,2%Greiner Bio-One455322
    Zellanalysator Abbott DiagnosticsCELL-DYN Hämatologie-Analysator
    ParaformaldehydSigma30525-89-4 
    SpritzenpumpeHarvard Apparatus, Holliston, MAHarvard apparatus 22
    10 mL Spritze mit 14,5 mm DurchmesserBD biosciences305959Luer-Lok Spritze
    Anti-CD63-biotinAbcam 
    Anti-CD62P-BiotinForschung & Forschung D SystemsDy137
    4',6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)Polysciences Inc. 9224
    Streptavidin, Alexa Fluor 488 KonjugatThermo ScientificS11223 
    ImmersionsölZeiss444963-0000-000
    WaschmittellösungUnilever, Biotex
    GlycineSigma56-40-6 
    PolyvinylalkoholSigma9002-89-5Mowiol 40-88.
    TrishydrochloridSigma1185-53-1 
    1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)Sigma280-57-9
    Schafe Anti-hVWF pAbAbcam AB9378
    Alexa Fluor 488-NHSThermo ScientificA20000
    GlycerolSigma-Aldrich15523-1L-R
    Parafinn FolieBemisPM-9964 Zoll x 125 Fuß Rolle.
    Silikonplatte unverstärktNagorNA 500-1200 mm x 150 mm x 0,125 mm.
    Individuell zugeschnittene Silikonplatte mit Perfusions- und Vakuumkanälenim eigenen Haushergestellt Hergestellt aus Silikonfolie unverstärkt (Nagor, NA 500-1)
    1,5 mL RöhrchenEppendorf AGT9661-1000AE
    FluoreszenzmikroskopZeiss Observer Z1 Ausgestattet mit LED-Erregerlichtern.
    Mikroskop-SoftwareZeiss ZEN 2blue edition
    18 G Nadel (18 G x 1 1/2")BD biosciences305196
    NaClRiedel de Haen31248375
    TrisRoche10708976
    Kunststoff-PasteurpipetteVWR612-1681  7 mL unsteril, graduiert bis zu 3 mL.
    SilikonschlauchVWR228-0656Innendurchmesser x Außendurchmesser x Wandstärke = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.
    ObjektträgerThermo ScientificABAA000001##12E76 x 26 x 1 mm, geschliffene Kanten 45 Grad, mattiertes Ende.
    823022AB134331

    Referenzen

    1. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
    2. Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).
    3. May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
    4. Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
    5. Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
    6. Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
    7. Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
    8. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
    9. Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
    10. Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
    11. Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
    12. Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
    13. Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
    14. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
    15. Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
    16. Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
    17. Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
    18. Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
    19. Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).

    Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

    Nachdrucke und Genehmigungen

    Schlagwörter

    FlusskammerThrombozytenisolationFluoreszenzmikroskopieKonfokalmikroskopieThrombozytenaktivierungVon Willebrand FaktorP Selectin MobilisierungCD63 Oberfl chenexpression
    Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow
    Kontakt
    Rückmeldung an Ihre Bibliothek

    Datenschutz

    Nutzungsbedingungen

    Richtlinien

    Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.