Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Zusammenfassung

Diese Arbeit beschreibt eine Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode für die Untersuchung von Thrombozytenadhäsion, -ausbreitung und -sekretion unter Strömung. Diese vielseitige Plattform ermöglicht die Untersuchung der Thrombozytenfunktion für die mechanistische Forschung auf Thrombose und Hämostase.

Zusammenfassung

Blutplättchen sind wesentliche Akteure in der Hämostase, die Bildung von Thromben, um vaskuläre Brüche zu versiegeln. Sie sind auch an Thrombose beteiligt, die Bildung von Thromben, die das Gefäßsystem verschlingen und Organe verletzen, mit lebensbedrohlichen Konsequenzen. Dies motiviert die wissenschaftliche Forschung zur Thrombozytenfunktion und die Entwicklung von Methoden zur Verfolgung zellbiologischer Prozesse, wie sie unter Strömungsbedingungen auftreten.

Für die Untersuchung der Thrombozytenadhäsion und -aggregation stehen eine Vielzahl von Strömungsmodellen zur Verfügung, zwei Schlüsselphänomene in der Thrombozytenbiologie. Diese Arbeit beschreibt eine Methode, um die Vollendung der Plättchendegranulation unter der Strömung während der Aktivierung zu untersuchen. Das Verfahren nutzt eine Strömungskammer, die mit einem Spritzenpumpenaufbau gekoppelt ist, der unter einem Weitfeld-, invertierten LED-basierten Fluoreszenzmikroskop angeordnet ist. Der hier beschriebene Aufbau ermöglicht die gleichzeitige Erregung von mehreren Fluorophoren, die von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder Fluoreszenzen abgegeben werdenEntfärbt. Nach Live-Zell-Imaging-Experimenten können die Deckgläser mit statischer Mikroskopie ( dh konfokale Mikroskopie oder Rasterelektronenmikroskopie) weiterverarbeitet und analysiert werden.

Einleitung

Plättchen sind anucleare Zellen, die im Blutstrom zirkulieren. Ihre Hauptfunktion ist es, vaskuläre Brüche an Orten der Verletzung zu versiegeln und Blutverlust zu verhindern. An diesen Verletzungsorten werden subendotheliale Kollagenfasern exponiert und anschließend durch das multimere Protein, von Willebrand-Faktor (VWF) abgedeckt. VWF interagiert mit den Plättchen im Kreislauf in einem Mechanismus, der von dem Ibcoprotein Ibα-IX-V-Komplex auf der Zelloberfläche ¹ abhängt, was die Geschwindigkeit der Thrombozyten verlangsamt. Dies ist besonders wichtig bei hohen Scherraten. Die Thrombozyten unterliegen anschließend morphologischen Veränderun....

Protokoll

Das örtliche medizinische Ethikkomitee des Universitätsklinikums Utrecht genehmigte die Zeichnung von Blut für Ex-vivo- Forschungszwecke, einschließlich derjenigen dieser Studie.

1. Lösungsvorbereitung

1. Zubereitung eines 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinansulfonsäure- (HEPES) Tyrode-Puffers durch Auflösen von 10 mM HEPES, 0,5 mM Na ₂ HPO ₄ , 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgSO ₄ und 5,55 mM D- Glukose in destilliertem Wasser.
   1. Machen Sie zwei Varianten des Puffers: Stellen Sie den pH-Wert bei 6,5 bzw. 7,4 ein. Machen Sie frischen Puffer für jeden Tag der Experimente.....

Ergebnisse

Fig. 1 zeigt Bilder der Strömungskammer und des experimentellen Aufbaus; Die Lage und die Abmessungen des Siliziumblechs; Und Schlauchverbindungen. Abbildung 2 gibt Auskunft über die Abmessungen der Durchflusskammer. Abbildung 3 und Film 1 zeigen eine Zeitreihe von Bildern der Plättchenadhäsion und Ausbreitung auf immobilisiertem VWF. CD63 ist ein Transmembranprotein, das in die Mem.......

Diskussion

Weltweit ist Thrombose eine führende Todesursache und Morbidität, und Thrombozyten spielen eine zentrale Rolle bei der Entwicklung. Diese Arbeit beschreibt ein Verfahren zur lebenden Zellenabbildung von Thrombozyten-Degranulation unter Strömung. Es wird allgemein angenommen, dass bei der Aktivierung von Blutplättchen alle körnigen Inhalte direkt in Lösung gelangen. Die begleitenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass dies nicht unbedingt der Fall ist. Während der Adhäsion und Degranulation behalten die Plättchen eine sig.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)	VWR	441476L
Na2HPO4	Sigma	S-0876
NaCl	Sigma	31434
KCl	Sigma	31248
MgSO4	Merck KGaA	1,05886
D-Glukose	Merck KGaA	1,04074
Prostacyclin	Cayman Chemical	18220
Trinatriumcitrat	Merck KGaA	1.06448
Zitronensäure	Merck KGaA	1.00244
Deckgläser	Menzel-Glä ser	BBAD02400500#A	24 x 50 mm, Nr. 1 = 0,13 - 0,16 mm Dicke.
Chromschwefelsäure (2% CrO3)	Riedel de Haen	07404	CAS [65272-70-0].
Von-Willebrand-Faktor (VWF)	hauseigene gereinigte
Fibrinogen-Enzym-Forschungslaboratorien		FIB3L
4-Well-Schale, unbehandelt	Thermo Scientific	267061
Humanserumalbuminfraktion V	Haem Technologies Inc.
Blutentnahmeröhrchen, 9 ml, 9NC Gerinnungsnatriumcitrat 3,2%	Greiner Bio-One	455322
Zellanalysator	Abbott Diagnostics	CELL-DYN Hämatologie-Analysator
Paraformaldehyd	Sigma	30525-89-4
Spritzenpumpe	Harvard Apparatus, Holliston, MA	Harvard apparatus 22
10 mL Spritze mit 14,5 mm Durchmesser	BD biosciences	305959	Luer-Lok Spritze
Anti-CD63-biotin	Abcam
Anti-CD62P-Biotin	Forschung & Forschung D Systems	Dy137
4',6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI)	Polysciences Inc.	9224
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjugat	Thermo Scientific	S11223
Immersionsöl	Zeiss	444963-0000-000
Waschmittellösung	Unilever, Biotex
Glycine	Sigma	56-40-6
Polyvinylalkohol	Sigma	9002-89-5	Mowiol 40-88.
Trishydrochlorid	Sigma	1185-53-1
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)	Sigma	280-57-9
Schafe Anti-hVWF pAb	Abcam	AB9378
Alexa Fluor 488-NHS	Thermo Scientific	A20000
Glycerol	Sigma-Aldrich	15523-1L-R
Parafinn Folie	Bemis	PM-996	4 Zoll x 125 Fuß Rolle.
Silikonplatte unverstärkt	Nagor	NA 500-1	200 mm x 150 mm x 0,125 mm.
Individuell zugeschnittene Silikonplatte mit Perfusions- und Vakuumkanälen	im eigenen Haus		hergestellt Hergestellt aus Silikonfolie unverstärkt (Nagor, NA 500-1)
1,5 mL Röhrchen	Eppendorf AG	T9661-1000AE
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss Observer Z1		Ausgestattet mit LED-Erregerlichtern.
Mikroskop-Software	Zeiss ZEN 2	blue edition
18 G Nadel (18 G x 1 1/2")	BD biosciences	305196
NaCl	Riedel de Haen	31248375
Tris	Roche	10708976
Kunststoff-Pasteurpipette	VWR	612-1681	7 mL unsteril, graduiert bis zu 3 mL.
Silikonschlauch	VWR	228-0656	Innendurchmesser x Außendurchmesser x Wandstärke = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.
Objektträger	Thermo Scientific	ABAA000001##12E	76 x 26 x 1 mm, geschliffene Kanten 45 Grad, mattiertes Ende.

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