Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Summary

Wir beschreiben hier Protokolle zur Messung der Antikörper-Antigen-Bindungsaffinität und Kinetik vier häufig verwendete Biosensor-Plattformen.

Abstract

Markierungsfreie optische Biosensoren sind leistungsfähige Werkzeuge in der Wirkstoffforschung für die Charakterisierung von biomolekularen Wechselwirkungen. In dieser Studie beschreiben wir die Verwendung von vier routinemäßig verwendet Biosensorplattformen in unserem Labor die Bindungsaffinität und Kinetik von zehn hochaffine monoklonale Antikörper (mAb) gegen menschliche Proproteinkonvertase Subtilisin Kexin Typ 9 (PCSK9) zu bewerten. Während beiden Biacore T100 und PROTEON XPR36 vom etablierten Oberflächenplasmonresonanz (SPR) -Technologie abgeleitet werden, haben die erstere vier Strömungszellen durch Reihenströmungskonfiguration verbunden ist, während die letztere präsentieren 36 Reaktionsstellen parallel durch ein improvisiertes 6 x 6-Gewirr Mikrofluidik-Kanalkonfiguration. Die IBIS MX96 arbeitet auf der SPR-Sensortechnik, mit einem zusätzlichen Abbildungsmerkmal auch basiert, die Erkennung in der räumlichen Orientierung bietet. Diese Erfassungstechnik in Verbindung mit der Continuous Flow Microspotter (CFM) erweitert den Durchsatz signifikant durch enabling Multiplexreihendruck und der Nachweis von 96 Reaktionssport gleichzeitig. Im Gegensatz dazu ist das Oktett RED384 basierend auf der Bioschicht Interferometry (BLI) optische Prinzip, mit faseroptischen Sonden als Biosensor wirkende Interferenzmuster zu erfassen, wechselt auf Wechselwirkungen an der Spitzenoberfläche zu binden. Im Gegensatz zu den SPR-basierten Plattformen, das BLI-System beruht nicht auf kontinuierlichem Fluss Fluidik; Stattdessen sammeln die Sensorspitzen Lesungen, während sie in Analyt-Lösungen einer 384-Well-Mikroplatte während der umlaufenden Bewegung eingetaucht sind.

Jede dieser Biosensorplattformen hat seine eigenen Vor- und Nachteile. Um eine Fähigkeit, einen direkten Vergleich dieser Instrumente Qualität kinetische Daten zur Verfügung zu stellen, die beschriebenen Protokolle zeigen Experimente, die das gleiche Assay-Format und die gleichen hochwertigen Reagenzien verwenden, um Antikörper-Antigen-Kinetik zu charakterisieren, die das einfache 1 passen: 1 molekulare Interaktionsmodell .

Introduction

Die Erfassung zuverlässiger kinetischer Parameter zur Charakterisierung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen ist ein wesentlicher Bestandteil des Prozesses der Arzneimittelforschung und -entwicklung¹. Optische Oberflächenplasmonenresonanz (SPR)-Biosensoren, der "Goldstandard" für die Echtzeit-Detektion dieser Wechselwirkungen, werden seit etwa zwei Jahrzehnten eingesetzt, um eine frühzeitige Auswahl von therapeutischen Antikörperkandidaten zu ermöglichen^2,3. Neben der Bereitstellung einer Affinitätseinstufung von Antikörperkandidaten durch das schnelle Bindungsscreening von Rohüberständen⁴ und strenge kinetische Konstantenbestimmungen von gereinigten Präparaten⁵, können Biosensoren die funktionelle Aktivität von Leitkandidaten über Epitop-Binning-Studien weiter differenzieren^6,7.

Um der wachsenden Nachfrage nach Antikörper-basierten Produkten für verschiedene therapeutische Indikationen gerecht zu werden⁸, wurde in den letzten Jahren eine Vielzahl innovativer Biosensor-Instrumente entwickelt, die die Effizienz der Kandidatenidentifikation und -charakterisierung erhöhen^9,10. Diese Instrumente unterscheiden sich in der mikrofluidischen Kanalkonfiguration, dem Design und/oder in den optischen Prinzipien, die bei der Detektion biomolekularer Wechselwirkungen zum Einsatz kommen. Konkret haben die Octet RED384^{11, ProteOn} XPR36¹² und IBIS MX96⁷ die Anzahl der in einem einzigen Bindungszyklus gemessenen Interaktionen auf 16, 36 bzw. 96 erweitert, was eine erhebliche Durchsatzverbesserung gegenüber der herkömmlichen Biacore-Plattform darstellt. Obwohl diese verschiedenen Biosensorplattformen alle wesentliche kinetische Daten für die Charakterisierung von Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen liefern, unterscheiden sie sich im Versuchsaufbau und in den Betriebsverfahren aufgrund unterschiedlicher instrumenteller Konfigurationen. In der SPR-Imaging-Array-Plattform des IBIS MX96 wird beispielsweise der Schritt der Multiplex-Liganden-Immobilisierung in einem Offline-Modus in einem externen Druckgerät durchgeführt, das vom Detektor getrennt ist^7,13; Im Gegensatz dazu verwenden die anderen drei Biosensorplattformen einen "All-in-One"-Aufbau, bei dem die Zugabe einer Komponente auf die Sensoroberfläche, sei es das Aktivierungsreagenz, der Ligand oder der Analyt, in Echtzeit und durch vorprogrammierte Befehle in sequenzieller Reihenfolge aufgezeichnet wird. Ein einzigartiges Merkmal dieser auf BioLayer-Interferometrie (BLI) basierenden Plattform im Octet RED384 ist die Verfügbarkeit von vorbeschichteten optischen Faser-Biosensoren für den sofortigen "Dip-and-Read"-Einsatz¹⁴, wodurch die Notwendigkeit der Vorbereitung der Ligandenoberfläche und der Initiations-/Konditionierungsschritte entfällt, die häufig für die Sensorchips in SPR-basierten Plattformen erforderlich sind. Das fluidikfreie Design dieses Instruments vereinfacht auch die Mechanik und vermeidet Verstopfungen und Kontaminationsprobleme beim Umgang mit Rohproben. Mit dem neuartigen 6 x 6 kreuzenden fluidischen Design im ProteOn XPR36 kann ein "One-Shot"-Kinetikansatz implementiert werden, indem die Strömungskanäle zwischen horizontaler und vertikaler Richtung umgeschaltet werden, um 36 Wechselwirkungspunkte zu erzeugen¹⁵. Anstatt die Bindungskinetik jeweils für einen Liganden oder Analyten zu bewerten, wie dies bei der traditionellen Biacore T100-Plattform mit seriellem Fluss der Fall ist, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, bis zu 36 verschiedene Wechselwirkungen gleichzeitig in einem einzigen Bindungszyklus zu überwachen.

Trotz ihrer Unterschiede werden diese vier Biosensorplattformen alle von vielen Laboratorien weltweit eingesetzt. Für neue Benutzer mit wenig praktischer Erfahrung mit Biosensoren kann die Entscheidung, welches Instrument verwendet werden soll, angesichts der Unterschiede im instrumentellen Design eine schwierige Aufgabe sein. Um das am besten geeignete Instrument für ihre Forschungszwecke zu bestimmen, müssen Faktoren wie Datenqualität, Leistungskonsistenz, Durchsatz, Benutzerfreundlichkeit und Materialverbrauch zusammen betrachtet werden. Während mehrere Benchmark-Studien die Variabilität der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten untersucht haben, die von mehreren Laboratorien und Biosensoren erhalten wurden^5,16, befasst sich eine kürzlich veröffentlichte Kopf-an-Kopf-Vergleichsstudie weiter mit den systematischen Faktoren, die die Zuverlässigkeit der Daten aus Sicht der instrumentellen Leistung beeinflussen^17,18. Die Protokolle, die in diesem Video vorgestellt werden, konzentrieren sich auf den Versuchsaufbau und die Verfahren im Detail und werden von dem Forschungsartikel mit dem Titel "Vergleich von Biosensorplattformen bei der Bewertung von Antikörper-Antigen-Bindungskinetiken mit hoher Affinität" begleitet¹⁷. Diese Protokolle sollen nicht nur neuen Biosensor-Anwendern helfen, diese Instrumente für ihre Forschungszwecke zu implementieren, sondern auch aktuellen Biosensor-Anwendern zusätzliche Einblicke in technische Herausforderungen und Überlegungen bei Versuchsdesigns zur Bewertung hochaffiner Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen liefern.

Protocol

1. Proteine ​​und Antikörper

1. Produzieren und reinigen , den menschlichen Proproteinkonvertase Subtilisin Kexin Typ 9 (PCSK9) und zehn Mäuse stammende anti-PCSK9 mAbs , wie zuvor beschrieben ^17.
2. Beurteilung der Reinheit der gereinigten Produkte durch sequentielles 10 & mgr; g jeder Probe in ein analytisches Größenausschlußchromatographie (SEC) -Säule Injizieren eines UPLC System ^19.

2. Kinetische Messungen im Biacore T100

1. Instrument und Vorbereitung der Reagenzien
   1. Equilibrieren des CM5-Sensorchip für 15 min bei Raumtemperatur.
   2. Auftauen zwei 200 ul Aliquots von 200 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) und zwei 200 ul Aliquots von 50 mM N-Hydroxysuccinimid (NHS) bei Raumtemperatur.
   3. Bereiten einer 1-L Flasche 1x HBS-EP (10 mM HEPES [pH 7,4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA und 0,005% v / v Polysorbat P20) Laufpuffer durch diLuting eine 10x HBS-EP + Stammlösung in Wasser.
   4. Herstellung von 1 ml Protein A / G bei 30 & mgr; g / ml in 10 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 500 ul jeder Probe bei mAb 0,063 ug / ml in HBS-EP-Laufpuffer. Tauen Sie ein gefrorenen Fläschchen menschlicher PCSK9 auf Eis.
   5. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Extras | Eject Chip“, stellen Sie den Sensor-Chip in den Mantel und in der Nähe. Klicken Sie auf "Extras | Set Temperature", geben Sie "25" ° C wie die Analyse Temperatur und "10" ° C als die Raumtemperatur.
2. Oberflächenimmobilisierung
   1. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Datei | Öffnen / New Wizard Vorlage“ und wählen Sie „Immobilisation“ aus der Liste im linken Bereich.
   2. Klicken Sie auf „Neu“, um die Immobilisierung Setup-Fenster aufzurufen. Wähle „CM5“, wie der Chip-Typ und wählt „1“ Durchflußzelle pro Zyklus.
   3. Markieren Sie das Kästchen neben jede „Immobilisieren Flusszelle 1/2/3/4“ zu activate die Optionen. Wählen „für immobilisierte Ziel-Ebene“ und „Amin“, wie das Verfahren für alle Durchflusszellen.
   4. Geben Sie „30 ug / mL ProA / G“ als Ligand, sicherzustellen, dass der Zielwert wird auf „10000“ Response Units (RU) für alle von den Durchflusszellen.
   5. Check "Prime vor run", und klicken Sie auf "Weiter". Wählen „Reagenzhalter 2“ ist, definiert die Position für die Reagenzien und die Pipette in einzelne Probenfläschchen entsprechend. Legen Sie das Rack zurück in das Gerät, und klicken Sie auf „Start“ und geben Sie ein Experiment Namen gespeichert werden, um den Lauf zu starten.
3. Analytbindemittels und Regenerationszyklen
   1. Klicken Sie auf „Datei | Öffnen / Neue Methode“, wählen Sie „20140812 hu anti-PCSK9 IgGs Bindung an hu PCSK9“ und die Methode öffnen. Überprüfen Sie die Parameter in der Methode.
   2. In "Assay-Schritten", sicherzustellen, dass es 10 Zyklen, in denen "hu PCSK9" ist der Name mit "Sample" ausgewählt in „PurpOSE 1 ‚“. Die Wiederholungszahl wird eingestellt‘.
   3. In "Cycle Types", die Kontaktzeit auf "220" s für Capture 1 über Strömungspfad "2", "110" s für Capture 2 über Strömungspfad "3" und "55" s für Capture 3 über Strömungspfad eingestellt "4". Die Strömungsrate „10“ & mgr; l / min für alle der Erfassungszyklen.
   4. Wählen Sie „Probe 1“, überprüfen Sie „Musterlösung“ als Variable. Stellen Sie die Kontaktzeit auf „600“ s und die Dissoziation Zeit auf „2700“ s über Strömungspfad „1, 2, 3, 4“. Die Strömungsgeschwindigkeit wird auf „30“ & mgr; l / min eingestellt.
   5. Wählen "Regeneration 1" ist, geben "Glycin-HCl pH 1,5" in der Lösung Feld die Kontaktzeit auf "20" s über Strömungspfad "1, 2, 3, 4".
   6. In "Variable Settings" Geben 2fache Konzentrationen von "100 nM - 6,25 nM" Titrieren für Zyklus 1-3 "50 nM - 3,12 nM" für Zyklus 4-8, und "5 nM - 0,323 nM" foder Zyklus 9-10.
   7. In "Setup Run", wählen Sie den Detektionsströmungspfad "2-1, 3-1, 4-1", klicken Sie auf "Weiter", überprüfen Sie "Prime vor run", und klicken Sie auf "Weiter".
   8. Wählen „Sample and Reagenzhalter 1“ ist, definieren die Position für die Reagenzien und die Pipette in einzelne Probenfläschchen entsprechend. Legen Sie die Zahnstange in das Gerät, und klicken Sie auf „Start“ und geben Sie ein Experiment Namen gespeichert werden, um den Lauf zu starten.
4. Datenanalyse mit BIAevaluation
   1. Klicken Sie auf „Kinetics / Affinity | Oberfläche gebunden“, wählen Fc „2-1“, „3-1“ oder „4-1“ getrennt und überprüfen sowie die „Null“ alle angezeigten Kurven aus den verschiedenen Analytkonzentrationen Konzentration leer.
   2. Klicken Sie auf „Weiter“, um den Puffer leer abgezogen Kurven zu erhalten. Klicken Sie dann auf „Kinetics“, wählen Sie die „1: 1 Bindung“ -Modell, und klicken Sie auf „Anpassen“ die angepasste kinetische parame zu erhaltenters.
   3. Für den globalen Einbau mehrerer mAb Oberflächen, klicken Sie auf „Multiple R _max“ an der Unterseite und die Bindungskurven von dem anderen Fcs für den gleichen mAb zur Liste hinzuzufügen.
   4. Klicken Sie auf „Weiter“, um alle Puffer leer abgezogen Bindungskurven zu erhalten. Klicken Sie dann auf „Kinetics“ , wählen Sie „1: 1 Bindung“ -Modell, und wählen Sie „local fit“ für jeden R _max in den Parametern , die global ausgestattet kinetischen Parameter zu erhalten.

3. Kinetische Messungen im PROTEON XPR36

1. Instrument und Vorbereitung der Reagenzien
   1. Equilibrieren einen GLM-Sensorchip und eine 2-L Flasche PBS-T-EDTA (PBS [pH 7,4], 0,005% Tween-20 und 3 mM EDTA) Laufpuffer für 15 min bei Raumtemperatur.
   2. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Auswerfen“ und dann den GLM-Chip einsetzen. Stellen Sie die Chiptemperatur auf „25“ ° C und die Autosampler Temperatur auf „10“ ° C.Klicken Sie auf „Glycerol Initialisierung“ und folgen Sie den Anweisungen aufgefordert, den Chip zu initialisieren.
   3. Klicken Sie auf „Datei | Öffnen“ eine Präkonditionierung Protokoll aus der Liste, werden die Lösungen in einer 96-Well-Platte. Klicken Sie dann auf „Ausführen“, wählen Sie das Protokoll und klicken Sie auf „Start“.
   4. Auftauen eine 1 ml-Aliquot von 400 mM EDC und eine 1 ml-Aliquot von 100 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) bei Raumtemperatur.
   5. Bereiten 2 ml-Protein A / G bei 60 & mgr; g / ml in 10 mM Natriumacetat (pH 4,5) und 500 ul jede mAb Probe bei 0,25 & mgr; g / ml, 0,125 & mgr; g / ml und 0,063 & mgr; g / ml in PBS-T -EDTA Laufpuffer. Tauen Sie ein gefrorenen Fläschchen menschlicher PCSK9 auf Eis.
2. Immobilisation, Analytbindemittels und Regeneration
   1. Klicken Sie auf „Datei | Neu | Neues Protokoll“. In „Konfiguration“, geben Sie die Testnamen, wählen Sie „GLM“ Chip, wählen Sie „Micro“ und „2.2“ ml Volumen ein.
   2. Wählen"Protocols | Samples" definieren "EDC / Sulfo-NHS" als "Aktivator" in Vertiefungen H1-H6, "Protein A / G" als "Ligand" in G1-G6 "Ethanolamine" als "Deaktivator" in F1-F6 "Glycine" als "Regenerator" in E1-E6, PBS-T-EDTA "als "freien Raum" in D1-D6 "mAb X Probe", wie "Ligand" in C1-C6, und "human PCSK9" als" Analyte in Vertiefungen H1-H6 in einer zweiten Platte mit 96 Vertiefungen.
   3. Wählen „Steps“, Doppelklick „Immobilisierung“ im „Protocol Editor“, wobei die Schritte umfassen drei aufeinanderfolgende horizontale Injektionen von EDC / Sulfo-NHS, Protein A / G, und 1 M Äthanolamin jeweils bei einer Flussrate von „30“ ul / min und eine Kontaktzeit von „300“ s.
   4. Auf „Regenerieren“, injiziert drei „18“ es Impulse von Glycin (pH 1,5) auf „100“ & mgr; l / min in horizontaler und vertikalen Richtung, gefolgt von zwei „60“ es Pulse von PBS-T-EDTA bei "25" & mgr; l / minauch in beiden Richtungen.
   5. Klicken „Ligand“, injiziert mAb 1 mAb 2 in der vertikalen Richtung, die eine Durchflussrate von „25“ & mgr; l / min und eine Kontaktzeit von „160“ s verwendet wird.
   6. Klicken „Analyt“, injizieren fünf Konzentrationen von humanem PCSK9 (100 nM auf 6,25 nM in 2-fache serielle Verdünnungen) und einen leeren Puffer über 6 horizontale Kanäle gleichzeitig, „40“ & mgr; l / min für „600“ s Vereinigungszeit verfolgt durch „2700“ s der Dissoziation Zeit.
   7. Auf „Regenerieren“, injizieren zwei „18“ -s Impulse von Glycin (pH 1,5) auf „100“ & mgr; l / min in horizontaler und vertikaler Richtung.
   8. Wiederholen Sie die Schritte nach jedem Bindungszyklus für die verbleibenden mAbs.
      HINWEIS: Zusätzlich zu der 100 nM - 6,25 nM menschlicher PCSK9 Konzentrationsreihe, 25 nM - 1,56 nM und 5 nM - 0,313 nM Konzentration Serie verwendet werden.
   9. Bereiten Sie die Proben und Reagenzien in zwei 96-Well-Platten nach den Reagenzpositionendefiniert in Schritt 3.2.2, dann auf die „Run“, wählen Sie das Protokoll / Experiment und klicken Sie auf „Start“.
3. Mit Datenanalyse Proteon - Manager
   1. Klicken Sie auf „Bildschirmtyp“ und wählen Sie „Analyte“. Klicken Sie dann auf „Protokoll Step“ und alle Bindungskurven in der Liste auswählen.
   2. Klicken Sie auf "Auto-Verfahren", und klicken Sie auf "Process | Kanal Referenz | Interspot". Klicken Sie dann auf "Process | Doppel Referenz | Zeile | A6".
   3. für jeden mAb an allen drei Flächen für kinetische Analyse Klicken Sie auf „Datensatz erstellen“, um einzelne Datensätze zu speichern.
   4. Klicken Sie auf "Analysis Dataset", markieren jedes mAb-Datensatz und klicken Sie auf "Analyse | Kinetic". Wählen Sie „Langmuir“ -Modell und „Simultaneous ka / kd“ und klicken Sie auf „Weiter“.
   5. Markieren Sie sowohl die Assoziation und Dissoziation Anpassungsbereich, wählen Sie „Local“ R _max, und klicken Sie auf „Weiter“ , um die Passform ausführen zu erhaltendie angepassten kinetischen Parameter.
   6. Wiederholen des obigen Schrittes , aber wählen „gruppierte“ R _max für die Montage der experimentellen R _max - Werte zu erhalten , für den Liganden Oberflächenaktivität zu berechnen.

4. Kinetische Messungen im Octet RED384

1. Reagenz und Probenplatte Vorbereitung
   1. Bereiten 50 ml 1x KB (Kinetic Buffer enthält PBS pH [7,4], 0,02% Tween-20, 0,1% Albumin und 0,05% Natriumazid) durch eine 10x Stammlösung in PBS verdünnt.
   2. Dispense das 1x KB in eine 96-Well-Platte mit 200 & mgr; l pro Vertiefung. Hydrat 48 anti-human capture (AHC) Biosensor Spitzen in diesen einzelnen Vertiefungen für mindestens 10 min.
   3. Bereiten Sie jede mAb Probe bei 20 ug / ml, 10 ug / ml und 5 ug / ml in 1 × KB, sowie menschliche PCSK9 bei 7 titriert Konzentrationen im Bereich von 100 nM bis 1,56 nM in 2-fache serielle Verdünnungen.
   4. Laden Sie die mAb Proben in ein 384-Well gekippt Boden Mikrotiterplatten (refeRred als das Reagenz Plate) und die menschliche PCSK9-Lösungen in einer anderen 384-well Mikrotiterplatten (bezeichnet als die Probenplatte) bei 90 & mgr; l pro Vertiefung.
   5. Last Reihe von 1x KB und Glycin (pH 1,5) Lösungen in den Vertiefungen in der Probenplatte.
      ANMERKUNG: Diese 1x KB Vertiefungen werden für die Chip-Vorkonditionierung Basislinienstabilisierung und Dissoziation Analyten verwendet. Die Glycin-Lösung wird zur Regenerierung verwendet.
2. Experimentelles Verfahren einrichten
   1. In der Datenerfassungssoftware, klicken Sie auf "Experiment | New Experiment Wizard | New Kinetics Experiment | Kinetische".
   2. In „Platte Definition“, gehen Sie folgendermaßen vor den Probentypen und Positionen zu definieren.
      1. Wählen Sie „16“ Kanäle und „384er“ -Format.
      2. Definiert die Proben- und Reagenzien Orte in der Platte Anzeige durch gleichzeitiges Drücken der Umschalttaste gedrückt, während der linke Maustaste auf den Brunnen 16 Vertiefungen zu einer Zeit, zu markieren.
      3. Rechtsklick auf dieVertiefungen der mAb Proben enthalten, und „Load“ wählen, bei der den Schritt, um anzuzeigen, die mAbs auf die AHC-Sensoren (oder erfaßt) geladen. Geben Sie die mAb Namen und Konzentrationen in der Tabelle auf der rechten Seite.
      4. Rechtsklick auf die Vertiefungen, die die menschliche PCSK9 enthält und wählen „Sample“ den Schritt, um anzuzeigen, an denen die mAb-Sensoren erfasst werden, eingetaucht und die Bindungswechselwirkungen werden gemessen. Geben Sie die entsprechenden molaren Konzentrationen in der Tabelle auf der rechten Seite.
      5. Definiert die Vertiefungen mit 1x KB als „Puffer“ oder „Neutralisation“, und die Vertiefungen, die Glycin als „Regeneration“.
   3. In „Assay Definition“, gehen Sie folgendermaßen vor dem Versuchsaufbau zu definieren:
      1. Klicken Sie auf „Hinzufügen“ und wählen Sie „Baseline“, „Regeneration“, „Äquilibrierung“, „Laden“, „Vereinigung“ und „Dissoziation“ Schritte in die Liste mit den Zeiten von „30“ s, „30" , "18" s, "200" s, "500" s und "1800" s dar. Die shake Geschwindigkeit "1000" Umdrehungen pro Minute.
      2. Um die Schritte zu „Assay-Schritte-Liste“, klicken Sie zunächst auf einen Schritt hinzuzufügen, klicken Sie dann auf den lokalisierten Vertiefungen entweder in der Probe oder dem Reagenz Platte. Die Schritte sind wie folgt:
         1. Äquilibrierung-Regeneration: Voraussetzung der AHC-Sensoren um drei Zyklen von "15" es Dips in Glycin (pH 1,5), mit "15" alternierenden es Dips in 1x KB.
         2. Laden: fangen die mAb Proben auf die AHC-Sensoren für „200“ s.
         3. Baseline: stellt das BLI-Signal für „60“ s vor dem Assoziationsschritt.
         4. Verband: dip die Sensoren in den Vertiefungen variierender Konzentrationen von humanem PCSK9 für eine „500“ sich Assoziationszeit enthalten.
         5. Dissociation: dip PCSK9 gebundenen Sensoren in neue Vertiefungen 1x KB für eine „1,800“ es Dissoziation Periode.
         6. Regeneration: tauchen die mAb-PCSK9 bound Sensoren in Vertiefungen von Glycin (pH 1,5) mit zwei „18“ es Impulsen zwischen jedem Bindungszyklus.
   4. In „Bewertungs Experiment“, schieben Sie durch die Schritte und die erforderlichen Änderungen vor, indem sie zu den vorherigen Registerkarten zurück.
   5. In „Run Experiment“, geben Sie eine „60“ s Verzögerungszeit und schütteln Sie die Probenplatte während des Wartens. Stellen Sie die Plattentemperatur auf „25“ ° C und drücken Sie auf „GO“.
3. Datenanalyse mit ForteBio der Datenanalyse - Software
   1. Klicken Sie auf „Datenauswahl | geladene Daten | Kinetics | PCSK9-Antikörper-Bindung an PCSK9 7.23.14“
   2. In „Processing“, verarbeiten die Daten wie folgt:
      1. In Schritt 1: Klicken Sie auf „Sensorauswahl“ Sensoren in H1-H6 zu markieren, klicken Sie rechts auf sie und klicken Sie auf „Typ-Änderungs-Sensor | Referenzsensor.“
      2. In Schritt 2 überprüfen „Subtraktion“ und wählen Sie „Average Reference Sensor“; jeden aktive Probe Sensor von dem Mittelwert der 6 leeren Puffersensoren zu subtrahieren.
      3. In Schritt 3 auf „Align Y-Achse“ und wählt „Baseline“ alle Bindungskurven zum Basisschritt vor der Vereinigung auszurichten.
      4. In Schritt 5 auf „Sawitzki-Golay-Filter“, um die Bindungskurven zu glätten, indem das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, und klicken Sie auf „Process Data“.
      5. In Schritt 6 Klicken Sie auf „Processed Ergebnisse“ die verarbeiteten Bindungskurven anzuzeigen.
      6. In Schritt 7 die vier Platten auf der rechten Seite überprüfen Sie die Bindungskurven nach jedem Verarbeitungsschritt angezeigt wird, und klicken Sie auf „Speichern von Daten verarbeitet“.
   3. In „Analyse“, überprüfen Sie „Assoziation und Dissoziation“ und wählen Sie „1: 1“ -Modell.
   4. Markieren Sie die Bindungskurven für „Global (voll)“ Fit und gruppieren sie durch „Farbe“. Verwendung „R _max gebunden“ auszuführen , um die Gruppe mit dem gleichen m auf Sensoren Einpassen beschichtetAb - Konzentration die experimentellen R _max - Werte für die Berechnung der Ligand Oberflächenaktivität und „R _max von nicht verknüpft Sensor“ auszuführen globales Aufstecken auf Sensoren beschichtet mit mehreren mAb - Konzentrationen zu erhalten.
   5. Klicken Sie auf „Fit Curves“, um den Einbau Kinetik Parameter zu erhalten. Speichern Sie die Ergebnisse am Ende eines jeden Anpassungsanalyse.

5. Kinetische Messungen im IBIS MX96

1. Instrument und Vorbereitung der Reagenzien
   1. Äquilibrieren einen COOH-G-Chip für 15 min bei Raumtemperatur.
   2. Bereiten einer 1-l-Flasche von Systemlaufpuffer (PBS [pH 7,4], 0,01% Tween-20) und der Immobilisierung-Puffer (10 mM Natriumacetat [pH 5,0], 0,01% Tween-20).
   3. Bereiten jeden mAb von 20 ug / ml bis 0,16 ug / ml durch 2fache Reihenverdünnungen in sowohl dem Systemlaufpuffer und Natriumacetatpuffer (pH 5,0) Immobilisierungspuffer.
   4. Dispense die mAb Proben in zwei Septemberarate 96-Well-Platten, in der jeder mAb 8 vertikale Bohrungen bei den Titration Konzentrationen pro Vertiefung in 200 & mgr; L einnimmt.
   5. Auftau-Aliquots von 400 mM EDC und 100 mM sulfo-NHS bei Raumtemperatur.
   6. Bereiten 300 ul Protein-A / G bei 50 ug / ml in dem Natriumacetatpuffer (pH 5,0) Puffer und Immobilisierung Pipette in ein Glasfläschchen.
   7. Bereiten Sie 200 ul menschlichen PCSK9 von 100 nM bis 0,39 nM von 2-fach-Reihenverdünnungen im System-Laufpuffer. Pipettieren sie in separaten Fläschchen.
2. Multi-cycle kinetics mit Amin-gekoppelten Antikörper - Arrays
   1. Mischen Sie die EDC / Sulfo-NHS (400 mM / 100 mM) und Aliquots verzichtet das Gemisch in den oberen 48 Vertiefungen einer neuen Platte mit 96 Vertiefungen bei 200 & mgr; l pro Vertiefung.
   2. Platzieren Sie die mAb Quellenplatte (verdünnt in Natriumacetat [pH 5,0]) in Position 2 und die EDC / Sulfo-NHS-Reagens Platte in Position 1 in dem Drucker.
   3. Installieren des Sensorchips in das CFM. Öffnen Sie die "CFM 2.0" software, dann klicken Sie auf "Einstellungen laden | 96 Amine Paar". Die 10 x 8-Array-Antikörper wird wie folgt erstellt:
      1. Liefert die EDC / Sulfo-NHS in der oberen Hälfte der Reagenzplatte auf den Sensor 48 unter Verwendung von Mikrokanälen, und dem Zyklus sie über die Sensorfläche für „5“ min.
      2. Liefert die mAb Proben in der oberen Hälfte der Quellenplatte mit dem Sensor und Zyklus sie über die aktivierten Oberflächen für „10“ min.
      3. die Immobilisierung Puffer aus einer 50 ml konischen Röhre über die Antikörperoberfläche für „5“ min liefern.
      4. Wiederholen die vorstehenden Verfahren für die verbleibenden Proben mAb in der unteren Hälfte der Quellenplatte.
   4. Andocken des Drucksensorchips in das Instrument. In der Steuersoftware, klicken Sie auf „Datei | Connect | Öffnen Mess | Bestehende Measurement“ und wählen Sie „2014.08.15“.
   5. In "Allgemein", wählen Sie "G - System Prime" unter "Full-System-Skript". Wählen Sie dann „G - QuEnch“, um die Oberflächen mAb zu deaktivieren, indem 150 & mgr; l 1 M Äthanolamin einzuspritzen.
   6. Klicken Sie auf „Kamera“, um den mAb-Arrays zu visualisieren und bei Bedarf den Kontrast einzustellen. Positionieren Sie die roten Kästchen die mAb-Spots zu umgeben, und bewegen Sie die grünen Kästchen zu den interspots zwischen den aktiven mAb-Spots befindet sich zur Referenzierung.
   7. In "Analyse-Zyklus", wählen Sie "A - AP Standard-Run" unter "IBIS Scripts". Set 1.0 min für die Baseline, 10,0 min für Verbindung und 90 Stufen für die Dissoziation bei 8 & mgr; l / s Geschwindigkeit.
   8. Innerhalb der „Zyklen“, injizieren menschliche PCSK9 eine Konzentration zu einem Zeitpunkt folgenden fünf Puffer Injektionen. Regeneriert die mAb Oberflächen mit Glycin pH 2,0 zwischen jedem Bindezyklus.
3. Single-cycle kinetics mit Fc-Antikörper - Arrays eingefangen
   1. Installieren eines neuen Sensorchip in die CFM. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.3 5.2.5 oben durch die mAb-Proben mit Protein-A / G ersetzt wird.
   2. Entferne dasSensorchip von der MX96 und es zurück in den CFM Drucker einsetzen.
   3. Liefert die mAbs in der oberen Hälfte der Platte an die Protein A / G Sensoroberfläche 48 unter Verwendung von Mikrokanälen, und dem Zyklus sie über die Oberfläche für 10 min unter Verwendung von bidirektionalen Strömung.
   4. Wiederholen des obigen Schrittes für die verbleibenden Proben mAb in der unteren Hälfte der Platte.
   5. Andocken des Drucksensorchips in das MX96 Instrument. In der Datenerfassungs-Software, klicken Sie auf "Datei | Connect | Öffnen Mess | Bestehende Mess | Weiter" und wählen Sie "Protein A + G Bindung kinetic7.30.14".
   6. Klicken Sie auf „Kamera“, um den mAb-Arrays zu visualisieren und bei Bedarf den Kontrast einzustellen. Positionieren Sie die roten Kästchen die mAb-Spots zu umgeben, und bewegen Sie die grünen Kästchen zu den interspots zwischen den aktiven mAb-Spots befindet sich zur Referenzierung.
   7. In "Analyse-Zyklus", wählen Sie "A - AP Standard-Run" unter "IBIS Scripts". Set „1,0 min“ für die Baseline „, 10,0min“für Association, und‚10‘Schritte zur Dissoziation bei‚8 & mgr; l / sec‘Geschwindigkeit.
   8. Innerhalb der „Zyklen“, injizieren menschliche PCSK9 eine Konzentration zu einem Zeitpunkt folgenden fünf Puffer Injektionen. Keine Regeneration zwischen jeder Analyten Injektion durchgeführt.
4. Datenanalyse mit Sprint- und Scrubber
   1. Im SprintX Sofware, klicken Sie auf „Datei | Öffnen Dreieck-Datei“, wählen Sie alle Probeninjektionen in der Liste, und klicken Sie auf „Speichern SprintX Datei“, „Kalibrierung“ und „RLL Bestimmung“, bevor Sie auf „Analyze“.
      HINWEIS: Die RLL-Werte beziehen sich auf die immobilisierte / erfasst mAb Niveaus auf der Sensoroberfläche.
   2. Check „Referenzierung“ und wählen Sie „Local“, die die benachbarten Referenzspots zu verwenden. Prüfen Sie auch, „Ausrichten“ auf der ersten Injektion und klicken Sie dann auf „Start Automation.“
   3. In der Serien Registerkarte, wählen Sie „Lineale in der Symbolleiste“ passen sieeinen kleinen Bereich der Basislinie unmittelbar vor dem ersten Probeninjektion, und wählen Sie die Option „Null“.
   4. Generieren Sie eine .IBMX Datei zur Analyse in dem Scrubber, indem Sie „Export-Datei iBMX“ und klicken Sie dann auf „Start Automation.“
   5. Starten Sie Scrubber und laden Sie die Datei .IBMX. Geben Sie „100n“, wie die „Auf Konz“ und „2“ als „Verdünnungsfaktor“.
   6. Crop Daten, entfernen alle Basislinie vor dem Beginn der Injektion, und richten die Bindungskurven zu Beginn der Assoziation.
      HINWEIS: Für das Single-Cycle-Kinetik Experiment nicht die Kurven ausrichten.
   7. Gehen Sie auf die „Kinetics“ Registerkarte, stellen Sie das Lineal für die Einspritzung Endzeit, wählen Sie „k _d“ und fit, dann „fix k _d.“ Wählen Sie „k _a k _d“ und passen Sie es erneut.
   8. Schwimmer die _Kd - Säule und wieder fit , um die Passform zu verfeinern.
      HINWEIS: Für den Einbau von Single-Cycle-BindungskurvenKlicken Sie auf „Opts“ und „subtrahieren“, dann wählen Sie „Getrennt“ und schweben die „Begin Inj“ Spalte deaktivieren Sie die Assoziation Profile zurück zu einem theoretischen Grundlinie Ursprung passen.
   9. Überprüfen Sie die Einbau Kinetik Parameter in der Registerkarte Ergebnisse.

Results

Abbildung 1 zeigt die Antikörperarray Bild aus dem CFM und das beschmutzte mAb Ebenen durch die beiden Immobilisierungsverfahren, und Abbildung 2 zeigt die entsprechenden Bindungssensorgramme, die in dem MX96 aus dem Mehrzyklus kinetischen und der Einzelzyklus kinetische Messungen an diesem mAb - Arrays . Die Echtzeit - Bindung und kinetisch angepaßte Kurven von verschiedenen Antikörpern-beschichteten Oberflächen in den vier Biosensorplattformen erzeugt werden , in den Figuren 3 bis 6. Abbildung 7 zeigt den Vergleich der endgültigen kinetischen Raten und Gleichgewichtsbindungskonstanten von der globalen Analyse dieser Bindungskurven erhalten. Die einzelne Association (k _a), Dissoziation (k _d), und das Gleichgewicht (K _D) Bindungskonstanten ist in Tabelle 1 dargestellt. die Variabilität der Datensätze innerhalb des gleichen Instrument erzeugt Um zu demonstrieren, k _a, k _d, K und _D bei Dichten verschiedener mAb Oberfläche, und Figur 9 vergleicht weiter die berechneten Bindungsaktivitäten der mAb Oberflächen über die Biosensor - Plattformen.

Abbildung 1. Multiplex Ligand Arrays von Amin-gekoppelte (A) und Fc-erfasst (B) Antikörper Surfaces von CFM Drucken im IBIS MX96. Bilder der gedruckten Arrays werden in den linken Tafeln gezeigt, wo die grauen Bereiche von roten Quadrate zeigen die Anwesenheit von Antikörper eingeschlossen. Die dunkleren interspots zwischen den aktiven Antikörperstellen befinden Referenz Subtraktion verwendet. Jede Spalte enthält einen Antikörper, an den Titration Konzentrationen unterhalb und links von dem Bild identifiziert gedruckt. Die Mengen der gedruckten Antikörper quantitativ bestimmt, indem die Berechnung difference in bulk Verschiebungen zwischen den aktiven und Referenzstellen sind in den rechten Platten gezeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Vergleich von Echtzeit - Bindung Sensogramme von Multi-Zyklus (A) und Einzelzyklus (B) Kinetische Experimente im IBIS MX96. Die aufeinanderfolgenden Injektionen von menschlichen PCSK9 bei Konzentrationen über den 10 x 8-Antikörper-Arrays erhöht, sind oberhalb jedem entsprechenden Sensorgramm Segment festgestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

(Toppanels) bewertet, Mittel- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten glatten schwarzen Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1-Interaktionsmodell. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. Bindung Sensorgramme der aufgenommenen Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in der PROTEON XPR36. Die Wechselwirkungen werden über Hoch- (Toppanels) ausgewertet, mediUm- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten glatten schwarzen Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1-Interaktionsmodell. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5 : Bindung der aufgenommenen Sensorgramme Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in dem Octet RED384. Die Interaktionen werden über Hoch- (Toppanels) bewertet, Mittel- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten roten Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1 Interaktionsmodell. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Die Bindung Sensorgramme der Amingekoppelten (A) und Fc-erfasst (B) Antikörper Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays im IBIS MX96. Die Bindungsprofile als 10 x 8 organisiert Platten, die die Anordnungsplatte Karte in Abbildung 1 folgen. Die schwarzen Linien stellen die aufgezeichneten Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen, und die überlagerten roten Linien stellen die angepaßten Kurven. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7" src = "/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Abbildung 7 : Vergleich des Verbandes k _a (A), Dissociation k _d (B) und Equilibrium K _D (C) Bindungskonstanten , die durch die vier Biosensorplattformen. Die kinetischen Parameter werden von den globalen Analyse der Bindungskurven in den Fig abgeleitet von 3 bis 6. Die Instrumente werden wie folgt dargestellt: Biacore T100 (blau), PROTEON XPR36 (grün), Octet RED384 (rot), IBIS MX96, Amin-gekoppelt (lila) und IBIS MX96, Fc-erfasst (orange). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8. Vergleich der Konsistenz von Geschwindigkeitskonstanten über mehr Antikörper Oberflächendichten in der Biac ore T100 (A), PROTEON XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, Amin-gekoppelt (D), und IBIS MX96, Fc-erfasst (E). Die kinetischen Parameter k _a (oben-Subfelder), k _d (mittlere Teilplatten) und K _D (untere Teilplatten) aus Gruppenanalyse an einzelnen Antikörperoberflächendichte abgeleitet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 9. Bindungsaktivitäten der Antikörper Oberflächen und deren Standardabweichungen (Fehlerbalken) in den vier Biosensorplattformen. Die Werte werden unter Verwendung der Gleichungen in dem Forschungs Artikel ¹⁷ beschrieben , berechnet.large.jpg“target =‚_ blank‘> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

	k a	Kd	K D
	(M -1 s -1)	(s -1)	(nM)
mAb 1	11,7 (7,8) x 10 5	4,89 (4,18) x 10 -5	0,052 (0,05)
mAb 2	1,53 (0,28) x 10 5	1,30 (1,54) x 10 -5	0,092 (0,12)
mAb 3	11,4 (8,3) x 10 5	27,6 (11,0) x 10 -5	0,333 (0,20)
mAb 4	3,61 (1,6) x 10 5	20,1 (12,3) x 10 -5	0,659 (0,54)
mAb 5	0,59 (0,21) x 10 5	3,46 (2,50) x 10 -5	0,663 (0,46)
mAb 6	1,19 (0,78) x 10 5	7,21 (3,83) x 10 -5	0,894 (0,64)
mAb 7	1,29 (0,53) x 10 5	16,4 (5,63) x 10 -5	1,57 (1,02)
mAb 8	4,02 (2,23) x 10 5	22,8 (10,7) x 10 -5	0,768 (0,68)
mAb 9	4,20 (2,13) x 10 5	6,67 (4,3) x 10 -5	0,197 (0,16)
mAb 10	1,20 (0,49) x 10 5	12,5 (7,64) x 10 -5	1,27 (0,80)

Tabelle 1: Kinetische Preise und Equilibrium Bindungskonstanten von 10 mAbs Erhalten von Global Einbau von Bindungskurven von vier Biosensor Instruments zum 1: 1 - Interaktionsmodell.

Discussion

Unsere Kopf-an-Kopf-Vergleichsstudie zeigt, dass jede Biosensor-Plattform ihre eigenen Stärken und Schwächen hat. Auch wenn die Bindungsprofile der Antikörper sind ähnlich durch einen visuellen Vergleich (Abbildungen 3 bis 6) und die Rangordnung der erworbenen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sind sehr konsistent über die Instrumente (Abbildung 7), unsere Ergebnisse zeigen , dass SPR-basierte Instrumente mit kontinuierlicher Fluss Fluidik) besser an hochaffine Wechselwirkungen Lösung mit langsamen Dissoziationsraten. Aufwärtsdrift während der Dissoziationsphase wird in Datensatz beobachtet (beispielsweise mAb 2, mAb 5 und mAb 9; Figur 5) , die durch das BLI Fluidik freies Instrument. Diese Feststellung kann zum großen Teil auf Probenverdampfung im Laufe der Zeit in der Mikroplatte zugeschrieben werden, die eine primäre Begrenzung des Systems ist. Mit dieser inhärenten Einschränkung wird die Versuchszeit auch auf weniger als 12 h begrenzt; Experimente wurden daher mit sh programmiertOrter Zeiten (500 s Assoziation und Dissoziation 30 min) im Vergleich zu denen der anderen Plattformen (10 min und 45 min Assoziation Dissoziation). Allerdings hat die Versuchszeit verkürzt wird nicht angezeigt , um die Auswirkungen der Verdampfung auf der Datenqualität / Konsistenz zu mildern, als die Rate erzeugt Konstanten , die durch das BLI-basierte Instrument zeigt weniger Linearität infolge von Schwankungen in einige der off-Raten (8C ). Neben Probe Verdunstung, Unterschiede in den Fangreagenzien verwendet haben auch in den Ergebnissen der Unterschiede beigetragen. Während Protein-A / G in allen drei Fluidik-basierten Plattformen SPR verwendet wurde, wurden AHC-Sensoren in der nicht-Fluidik BLI Plattform verwendet. Da Protein A / G ist wahrscheinlich eine schwächere Affinität für den mAbs haben, als dies der AHC, ein Antikörper-basierte Biosensor-Oberfläche, als diejenigen, die off-Raten des mAb-Antigen-Komplexes aus dem Protein A / G Oberflächen künstlich schneller erscheinen von der AHC Oberfläche erhalten. Diese Möglichkeit wird unterstützt by die experimentellen Daten , die zeigen , dass die off-Rate von der Plattform BLI erzeugten Werte als die von den anderen Instrumenten (7, rote Linie) erhalten durchweg niedriger waren. Dennoch hat die BLI-Plattform verschiedene Vorteile gegenüber den anderen Plattformen. Zum Beispiel ist es sehr flexibel in Bezug auf Sensor Auswahl und Assaykonfiguration aufgrund der verschiedenen vorbeschichtet Sensoren für den sofortigen Gebrauch. Verwendung der AHC-Sensoren In unseren Experimenten eliminiert die Notwendigkeit für Ligand Immobilisierung Schritte, die Verringerung der Vorbereitungszeit. Darüber hinaus erfordert die BLI-Plattform viel weniger Wartung im Vergleich zu den anderen Fluidik SPR-Plattformen, die komplizierte Schläuche und Wert Switch-Konfigurationen verfügen. Diese Funktion ist ein Vorteil für Experimente mit rohen Proben, die Verstopfung und Verschmutzung Probleme verursachen kann.

Da die Nachfrage nach effizienten, schnellen und genauen Identifizierung von therapeutischen Kandidaten erhöht, die Notwendigkeit biosensor Durchsatz steigt ebenfalls. Unter den vier Biosensorplattformen, der Durchsatz von dem Biosensor der Lage, 96-Liganden-Array-Druck ist am höchsten ist, durch den Biosensor gefolgt gekoppelt mit einem kreuz und quer durch 36-Liganden-Format und der BLI-basierten Biosensor mit 16-Kanal-Simultanauslese, die letztlich erhöhen die Anzahl der Wechselwirkungen in einem einzelnen Bindungszyklus gemessen auf 96, 36 bzw. 16. Diese Durchsatzkapazitäten sind deutlich höher als die der herkömmlichen SPR-Plattform, die sich durch nur vier Fließzellen begrenzt wird durch einen einzigen seriellen Fluss verbunden. Da unsere Experimente einen relativ kleinen Probensatz von 10 mAbs bewertet an mehreren Oberflächendichten mit langen Dissoziation Zeiten beteiligt, spielten die Instrumentaldurch eine moderate Rolle, die Effizienz der Versuche zu bestimmen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den experimentellen Zeiten der drei Hochdurchsatz-Plattformen und in allen Fällen wurden die Versuche in einem Tag abgeschlossen. Auf der anderen Seite sind die traditionellen seriellen Fluss SPR Experimente erforderlich 3 Tage in Anspruch nehmen, trotz der Walk-away Automatisierung der Datenerfassung nach dem Setup. In anderen Studien , die eine große Anzahl von Proben (dh in den Hunderten oder Tausenden), für die Off-Rate - Ranking / kinetischen Screening oder Epitop Binning Zwecke beinhalten, wird der Durchsatz ein kritischer Faktor.

Obwohl der Durchsatz in der IBIS MX96 Größenordnungen höher ist als die der anderen Biosensoren und ist daher eine optimale Wahl für diese Zwecke hat es einige Mängel. Insbesondere zeigt das Array Drucken durch die CFM große Oberfläche Inkonsistenzen (Abbildung 1) und reduzierte Datenreproduzierbarkeit (8D und 8E). Für eine genaue kinetische Messungen wird die Menge an Liganden auf der Biosensoroberfläche ein kritischer Parameter, der gesteuert werden muss, um sicherzustellen, dass die Bindungsreaktionen nicht durch Sekundärfaktoren, wie beispielsweise gestörtMassentransfer oder sterische Hinderung. Für den Biacore T100 und PROTEON XPR36 wurden die optimalen Niveaus _L R auf der Grundlage der Standardberechnung des Satzes R _max - Werte bestimmt , wie ¹⁷ in der Forschung Artikel beschrieben. Auf der anderen Seite, für die die Oktett RED384 und IBIS MX96 Plattformen wurden die mAb capture Ebenen empirisch unter Verwendung einer Reihe von 2-fach seriell verdünnten Antikörper in konstanten Zeiten erreicht. Der Mangel an Wissen oder Steuerung des Einfangschritt führte zu einer hochdichten Oberfläche und hohen Bindungsantwortsignalen (Abbildung 2), die die Genauigkeit der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten beeinträchtigt haben könnten. Darüber hinaus stellt die Trennung des Druckers aus dem SPR-Detektor auch eine Herausforderung, wenn mehrere Bindungszyklusmessungen die Regenerationen leiten. Der einzige Weg, um den Multi-cycle kinetics Setup durchzuführen war, durch direkte Kopplung des Amin mAbs, wie durch den mAb Fc durch das immobilisierte Protein A / G zu erfassen, im GegensatzOberfläche in den anderen drei Biosensorplattformen. Als Ergebnis wurde ein zusätzliches Regeneration Scouting Experiment erforderlich, um die optimalen Regenerationsbedingungen zu bestimmen. Das Ergebnis dieser Anordnung wurde auf eine ~ 90% niedriger beobachteten Oberflächenaktivität verknüpft verglichen mit dem Fc - Capture - Verfahren (Figur 9), zusätzlich zu einer längeren Versuchszeit. Zur Ausführung wurde die Fc-Capture-Methode ein alternativen Single-Cycle-kinetischer Ansatz angenommen. Dieser Ansatz beinhaltet die sequentielle Injektion von Analyten bei Konzentrationen ohne Regeneration zwischen jeder Injektion (Abbildung 2) zu erhöhen. Dieser sehr bequem, aber weniger häufig angewandt Ansatz nicht nur die Versuchszeit verkürzt und Reagenzienverbrauch reduziert, sondern auch die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sehr ähnlich zu denen von den anderen Biosensoren (Abbildung 7) hergestellt. Daher überwindet die inhärente Beschränkung Konfiguration dieses Single-Cycle-Kinetik Ansatz Anwendung des Instruments und stellt einMöglichkeit für die hochauflösende kinetische Geschwindigkeitskonstanten in einer Hochdurchsatz-Weise zu erhalten.

Trotz des Durchsatz eine große Einschränkung in der Biacore T100 sein, unsere Ergebnisse zeigen gemeinsam, dass sie die meisten konsistenten Daten mit höchster Qualität erzeugt. Dies wurde von der PROTEON XPR36 gefolgt, das hat ~ 10-fach höheren Durchsatz. Ihre Fähigkeit, qualitativ hochwertige Daten zu erzeugen, wird ein Vorteil, wenn die Charakterisierung hochaffine Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, die technisch anspruchsvoll sein können, wenn die Nachweisgrenzen der Instrumente erreicht werden. Während die systematischen Einschränkungen in Instrumentierung des Octet RED384 die genaue Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten hindern (dh kurz die Empfindlichkeit fällt bei langsamer Off-Raten ausreichenden Signalabfall zu lösen), die beide der Biacore T100 und PROTEON XPR36 kann empfindlich und zuverlässig liefern Nachweis für die Differenzierung.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biacore T100 System	GE Healthcare	28975001	Das T100 System wurde auf den T200
CM5 Sensor Chip aufgerüstet	GE Healthcare	BR100012
BIAbewertung	GE Healthcare		Version 4.1
Biacore T100 Steuerungssoftware	GE Healthcare		Die Steuerungssoftware T100 wurde auf das T200
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	Es enthält: 750 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC), 115 mg N-Hydroxysuccinimid (NHS), 10,5 mL 1,0 M Ethanolamin-HCl pH 8,5
HBS-EP+ Puffer 10-fach;	GE Healthcare	BR100669	Konzentrierte Stammlösung
Fläschchen aus Kunststoff, Außendurchmesser 7 mm	GE Healthcare	BR100212
Gummikappen, Typ 3	GE Healthcare	BR100502
Kunststofffläschchen und -kappen, Außendurchmesser 11 mm	GE Healthcare	BR100214
ProteOn XPR36 Protein-Interaktions-Array-System	Bio-Rad	1760100
ProteOn Manager Software	Bio-Rad	1760200	Version 3.1.0.6
GLM Sensor Chip	Bio-Rad	1765012
Amine Coupling Kit	Bio-Rad	1762410	Enthält EDAC (EDC), Sulfo-NHS, Ethanolamin HCl
Regenerations- und Konditionierungskit und Puffer	Bio-Rad	1762210	Es enthält je 1 Glycinpuffer (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) und NaOH, SDS, HCl, Phosphorsäure, NaCl; 50 mL pro Lösung
2 L PBS/Tween/EDTA-Puffer	Bio-Rad	1762730	Enthält Hosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA
Octet RED384 System	Forté
Biodatenanalyse-Software	Forté		Version 9.0.0.4
Eintauchen und Lesen von Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensoren	Forté Bio	18-5060	Ein Tablett mit 96 Biosensoren
384-Well gekippte Bodenplatte	Forté Bio	18-5080
Biosensor Spender	Forté Bio	18-5016
Kinetics Puffer 10x	Forté Bio	18-1092	10-fache Konzentration. Enthält ProClin 300.
IBIS MX96 SPRi System	Wasatch Microfluidics
Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Drucker	Wasatch Microfluidics		Version 2.0
SensEye COOH-G Chip	Wasatch Microfluidics		1-09-04-004
Datenanalyse-Software	Wasatch Microfluidics		Version 6.19.3.17
SPRint Datenanalyse-Software	Wasatch Microfluidics		Version 6.15.2.1
Scrubber 2	BioLogic Software		Version 2
Pierce Rekombinantes Protein A/G	ThermoFisher Scientific	21186