Methodenartikel

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

DOI:

10.3791/55689

⸱

27. Juni 2017

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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DNA-Protein-Wechselwirkungen sind für mehrere biologische Prozesse essentiell. Bei der Auswertung von zellulären Funktionen ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen unentbehrlich für das Verständnis der Genregulation. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist ein mächtiges Werkzeug, um solche Wechselwirkungen in vivo zu analysieren .

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mehrere zelluläre Prozesse, einschließlich DNA-Replikation und Reparatur, DNA-Rekombination und Genexpression, erfordern Wechselwirkungen zwischen Proteinen und DNA. Daher regeln DNA-Protein-Wechselwirkungen mehrere physiologische, pathophysiologische und biologische Funktionen wie Zelldifferenzierung, Zellproliferation, Zellzykluskontrolle, Chromosomenstabilität, epigenetische Genregulation und Zelltransformation. In eukaryotischen Zellen interagiert die DNA mit Histon- und Nonhiston-Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Mehrere technische Werkzeuge können verwendet werden, um DNA-Protein-Wechselwirkungen zu analysieren, wie die Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting. Diese Techniken analysieren jedoch die Protein-DNA-Interaktion in vitro , nicht im zellulären Kontext. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine Technik, die Proteine ​​an ihren spezifischen DNA-Bindungsstellen einfängt, wodurch die Identifizierung der DNA-Protein-Wechselwirkung ermöglicht wirdS in ihrem Chromatin-Kontext. Es erfolgt durch Fixierung der DNA-Protein-Wechselwirkung, gefolgt von einer Immunopräzipitation des Proteins von Interesse. Anschließend wurde die genomische Stelle, an der das Protein gebunden war, charakterisiert. Hier beschreiben und diskutieren wir ChIP und zeigen ihren analytischen Wert für die Identifizierung der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) -induzierten Bindung des Transkriptionsfaktors SMAD2 an SMAD Bindungselemente (SBE) innerhalb der Promotorregion des Tyrosin- Proteinkinase-Kit (c-KIT) -Rezeptorligand Stammzellfaktor (SCF).

Einleitung

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Im Nukleus von Eukaryoten interagiert DNA mit Histonproteinen und nonhistonischen Proteinen und wird zu Chromatin kondensiert. Im physiologischen, pathophysiologischen und zellbiologischen Kontext werden zelluläre Funktionen räumlich und zeitweise durch chromatin-koordinierte Genexpression kontrolliert. DNA-Protein-Wechselwirkungen haben eine wesentliche Rolle bei der Regulation von zellulären Prozessen wie DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur sowie Protein-Expression. Daher ist die Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen ein unentbehrliches Werkzeug bei der Bewertung von Genexpression und Zellfunktion.

Es gibt mehrere Techniken zur Beurteilung von DNA-Protein-Wechselwirkungen in vitro , wie der Elektrophorese (Gel) Mobility Shift Assay (EMSA) und DNase I Footprinting 1 , 2 . Diese Techniken analysieren jedoch nicht die Protein-DNA-Wechselwirkung innerhalb des Chromatin- und Zellkontextes. ChIP iSa-Technik, die Proteine, die an ihre spezifischen DNA-Bindungsstellen gebunden sind, erfasst und dadurch die Identifizierung von DNA-Protein-Wechselwirkungen innerhalb des Chromatinkontextes erleichtert. Die Technik wurde ursprünglich von Gimour und Lis für die Beurteilung der RNA-Polymerase II-Bindung an spezifische Gene in Escherichia coli und Drosophila melanogaster 3 , 4 entwickelt . Es wird durch Fixierung der DNA-Protein-Komplexe durchgeführt, gefolgt von der Durchführung der Chromatingextraktion und der Scherung der DNA in ~ 200 Basenpaar (bp) Fragmente. Anschließend wird das DNA-gebundene Protein von Interesse durch Immunpräzipitation isoliert. Nach der Umkehrung der DNA-Protein-Vernetzung wird die DNA gereinigt und analysiert. Für die Analyse der Proteinbindungsstellen können mehrere Methoden angewendet werden, die von der Nukleinsäuresequenz der Proteinbindungsstelle innerhalb des Zielgens 5 abhängen. In Fällen, in denen die DNA-Sequenz bekannt ist, ist Standard PolYmerase Kettenreaktionen (PCR) können angewendet werden, wobei spezifische Primerpaare, die die bekannte Bindungsstelle flankieren, angewendet werden. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) kann auch verwendet werden 6 . In Fällen, in denen die Sequenz unbekannt ist, kann ChIP mit DNA-Mikroarrays (ChIP-on-Chip), DNA-Sequenzierung (ChIP-seq) oder Klonierungstechniken 7 , 8 , 9 kombiniert werden.

Der TGF-β-Weg hat starke Tumorunterdrückungsfunktionen und ist ein Schlüsselweg in der Zelldifferenzierung. Es wird durch die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex aktiviert, was zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren führt. Nach ihrer Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4 verschiebt sich der SMAD-Komplex in den Zellkern und bindet an die SBE innerhalb der Promotorregion der Zielgene, wo er Gene kontrolliert, die den Zellzyklus, die Apoptose und die Zelldifferenzierung kontrollierenauf. Die Transkriptionsreaktion auf die TGF-β-Stimulation ist zelltyp- und kontextspezifisch 10 . In letzter Zeit haben wir eine positive Rückkopplungsschleife zwischen TGF-β und dem c-KIT-Pfad 11 beschrieben . In diesem Modell bindet TGF-β1-aktiviertes SMAD2 an den c-KIT-Liganden-Promotor und induziert seine Expression und Sekretion. Anschließend aktiviert der c-KIT-Ligand den c-KIT-Rezeptor auto- und para-crinisch. Die c-KIT-Rezeptor-Aktivierung führt zu STAT3 Tyr 705 -phosphorylierung über JAK1 / 2. Nach der STAT3-Aktivierung und der nuklearen Translokation bindet STAT3 an das TGF-β1-Liganden-Gen und reguliert seine Expression.

Hier zeigen wir die wesentliche Rolle der ChIP-Analyse zur Identifizierung der SMAD2-Bindung an den c-KIT-Rezeptor-Liganden-Promotor und zur Identifizierung des Signaltransducers (und) Activators (von) Transkription 3 (STAT3-Bindung an die TGF- & bgr; 1- Gen).

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Protokoll

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1. Vorbereitung von Lösungen

  1. Bereiten Sie für jeden Versuch die folgenden Lösungen vor.
    1. Für die Fixierlösung 37% Formaldehyd zuzubereiten und bei RT zu lagern. Verdünnen Sie es in 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bis zu einer Endkonzentration von 1,42%.
      ACHTUNG: Formaldehyd wird als reizend, korrosiv, mutagen, teratogen und karzinogen eingestuft. Nicht einnehmen. Gas / Dämpfe / Dampf / Aerosol nicht einatmen. Bei unzureichender Belüftung Atemschutzgerät anlegen. Berührung mit Haut und Augen vermeiden. Von Inkompatibilitäten fernhalten, wie Oxidationsmittel, Reduktionsmittel, Säuren, Laugen und Feuchtigkeit.
    2. Für die Glycin-Stop-Fix-Lösung 0,125 M Glycin in 1x PBS-Lösung zubereiten und bei RT aufbewahren.
    3. Für die Zellschabelösung eine 1x PBS-Lösung in dH 2 O vorbereiten und auf Eis aufbewahren. Direkt vor der Verwendung Proteinase-Inhibitor Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) tOa Endkonzentration von 0,5 mM.
      ACHTUNG: PMSF ist als korrosiv und giftig eingestuft; Schutzkleidung tragen und in einem belüfteten Bereich verwenden.
    4. Vor der Verwendung des Zell-Lyse-Puffers (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 85 mM KCl und 0,5% NP40) wurde 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; 100X Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO): 104 mM 4- ( 2-Aminoethyl) benzolsulfonylfluorid-Hydrochlorid (AEBSF), 80 μM Aprotinin, 4 mM Bestatin, 1,4 mM E-64, 2 mM Leupeptin und 1,5 mM Pepstatin A) und 0,5 mM PMSF.
    5. Direkt vor der Verwendung des Kerne-Lyse-Puffers (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1% SDS) fügen Sie 1X PIC und 0,5 mM PMSF hinzu.

2. Zellfixierung und Scherung

  1. Wachsen Sie die Zellen auf 70-80% Konfluenz auf 10 cm Gewebekulturplatten. Stimulieren Sie die Zellen nach den experimentellen Zielen.
  2. Das Gewebekulturmedium entfernen, 5 ml Fixierlösung zugeben und inkubierenDie Zellen für 10 min bei RT auf einer Schüttelplattform.
  3. Entfernen Sie die Fixierlösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS.
  4. Entfernen Sie die 1x PBS, fügen Sie 5 ml Glycin-Stop-Fix-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei RT auf einer Schüttelplattform.
  5. Entfernen Sie die Glycin-Stop-Fix-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml eiskaltem 1x PBS.
  6. Entfernen Sie die 1x PBS, fügen Sie 2 ml Zellschaberlösung hinzu und ernten Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Übertragen Sie die geernteten Zellen auf ein konisches Rohr auf Eis.
  7. Die Proben für 10 min bei 600 xg und 4 ° C zentrifugieren.
  8. Den Überstand entfernen, das Pellet in 1 ml 1X-Zell-Lysepuffer resuspendieren und 30 min auf Eis inkubieren. Alternativ das Pellet in flüssigem Stickstoff einfrieren und bei -80 ° C aufbewahren.
  9. Sobald das Pellet im Zelllysepuffer resuspendiert ist, übergeben Sie die Zellsuspension auf einen eiskalten Dounce-Homogenisator und treten für 10 Hübe mit einem Typ-B-Pest aufE für zellunterbrechung
  10. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Proben für 10 min bei 2.400 xg und 4 ° C.
  11. Den Überstand verwerfen, das Pellet in 350 & mgr; l Kornverdauungspuffer resuspendieren und die Proben 5 min bei 37 ° C inkubieren.
  12. Mikrokokken-Nuklease (1 U / μL) zugeben und durch Vortexen mischen. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 5-20 min; Mischen Sie die Proben alle 2 min durch Inversion.
    HINWEIS: Die Zeit- und Enzymkonzentration unterscheidet sich zwischen Zelllinien und kann bei der suboptimalen enzymatischen Scherung eine Optimierung erfordern.
  13. Alternativ erreichen Sie die Chromatin-Scherung durch Ultraschallbehandlung mit handelsüblichen Schallapparaten.
    HINWEIS: Die Sondenbedingungen erfordern eine Optimierung. Ein Optimierungsbeispielprotokoll wird unten unter Verwendung eines Probenvolumens von 300 & mgr; l und einer Probenverarbeitungsleistung von 25% bereitgestellt.
    1. Nach Schritt 2.10 den Überstand verwerfen und den n resuspendierenUnclear Pellet in 1,0 ml handelsüblicher Scherpuffer.
    2. Aliquotieren Sie 300 μl des resuspendierten Kernpellets in drei 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Lege sie auf Eis.
    3. Die 3 Aliquots des fixierten Chromatins mit 25% iger Leistung mit 3 verschiedenen Bedingungen abscheren, um die optimalen Beschallungsbedingungen zu bestimmen:
      5 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls.
      10 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls.
      20 Impulse von jeweils 20 s, mit 30 s Ruhe auf Eis zwischen jedem Puls.
    4. Fahren Sie mit Schritt 2.15 fort, wie unten beschrieben.
  14. Nach der Inkubation mit der Mikrokokken-Nuklease werden 7 μl eiskaltes 0,5 M EDTA zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
  15. Zentrifugieren der Proben mit der gescherten DNA für 10 min bei 16.200 xg und 4 ° C.
  16. Übertragen Sie den gescherten DNA-haltigen Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Aliquot 50 μL in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen zur Bestätigung der suCcessful Scherung der DNA (Abschnitt 3). Verwenden Sie das verbleibende Volumen sofort für die Immunpräzipitation (Abschnitt 4) oder lagern Sie es bei -80 ° C.

3. Bestätigung der Scherwirkung

  1. Füge 150 μl nukleasefreies dH 2 O und 10 μl 5 M NaCl zu dem 50 μl Aliquot des gescherten Chromatins aus Schritt 2.16 hinzu.
  2. Inkubieren Sie die Proben bei 65 ° C für 4 h, um die Vernetzungen umzukehren.
  3. 2 & mgr; l RNase A (10 & mgr; g / & mgr; l) zugeben und die Proben bei 37 ° C für 15 min inkubieren.
  4. 10 μl Proteinase K (0,5 μg / μL) zugeben und die Proben bei 42 ° C für 90 min inkubieren.
  5. Zur Reinigung der DNA eine Phenol / Chloroform-Extraktion 12 durchführen .
    1. Fügen Sie nukleasefreies Wasser zu einem Endvolumen von 200 μl hinzu. 200 μl Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (25: 24: 1) zur Probe geben und 20 s vortexen.
    2. Zentrifuge bei RaumtemperaturFür 5 min bei 16.000 x g. Die obere wässrige Phase vorsichtig entfernen und auf ein frisches Röhrchen überführen. Achten Sie darauf, kein Phenol während des Pipettierens zu tragen.
    3. Fügen Sie 0,1 Volumina 3 M Natriumacetat (NH 4 OAc), pH 5,2, hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals mit einem Finger flackern. Fügen Sie 2,5 Volumina eiskaltes 100% Ethanol hinzu und mischen Sie durch Vortexen für 5 s. Inkubieren Sie die Probe O / N bei -20 ° C oder mindestens 1 h bei -80 ° C.
    4. Die Probe wird für 30 min bei 4 ° C und 16000 xg zentrifugiert, um die cDNA zu pelletieren.
    5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören. 1 ml RT, 70% Ethanol zugeben und das Röhrchen mehrmals umkehren.
    6. Die Probe für 2 min bei 4 ° C und 16000 x g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
    7. Das Pellet für 5-10 min bei RT trocknen. Das Pellet wird in 30 μl dH 2 O resuspendiert.
  6. Verwenden Sie ein 5 und 10 μl Aliquot der gereinigten DNA für die Gelelektrophorese mit einem 1% TAEAgarosegel
    HINWEIS: Erfolgreiche Chromatin-Scherung führt zu einem 200-1.500 bp DNA-Muster. Wenn die Scherung nicht erfolgreich ist, bestimmen Sie die optimalen Scherbedingungen für die spezifischen Zellen durch Modifizieren der Inkubationszeit des Scherungsschrittes (Schritt 2.12) auf 5, 10 und 15 min.
  7. Verwenden Sie die restliche Probe, um die DNA-Konzentration der Probe zu analysieren. Reverse-berechnen die DNA-Konzentration in der Scher-Chromatin-Probe (Schritt 2.16); Für jede Behandlungsgruppe für die Immunpräzipitation die gleichen DNA-Mengen verwenden (Abschnitt 4).

4. Immunpräzipitation

  1. Kombinieren Sie 10-25 μg des gescherten, vernetzten Chromatins (Schritt 2.16) mit 25 μl ChIP-Grad-Protein G-Magnetperlen, 10 μl Immunpräzipitations-Verdünnungspuffer (Stammlösung: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 mM EDTA und 167 mM NaCl) und 1 & mgr; l PIC.
  2. Nach 4 h Inkubation fügen 1-10 μg Antikörper (der Antikörper-Konzentrat) hinzuWird auf der Grundlage der Affinität des Antikörpers variieren; Es sollte zunächst nach Herstellerempfehlungen verwendet und gegebenenfalls experimentell optimiert werden) in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und dH 2 O zu einem Endvolumen von 100 μl zugegeben.
    ANMERKUNG: Anstelle des oben beschriebenen direkten Immunpräzipitationsverfahrens kann das indirekte Immunpräzipitationsverfahren verwendet werden, indem zuerst das Chromatin mit den Antikörpern kombiniert und anschließend Protein G magnetische Perlen zugesetzt werden.
  3. Inkubieren Sie die Proben auf einem End-to-End-Rotator für 4-12 h bei 4 ° C.

5. Elution

  1. Legen Sie die Rohre auf einen Magnetständer. Sobald die magnetischen Perlen auf der Seite des Rohres aggregieren, entfernen und entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
  2. Waschen Sie die Perlen dreimal mit 800 μl Waschpuffer 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 und 150 mM NaCl); Mischen, indem man das Röhrchen mehrmals umkehrt. Legen Sie den Schlauch auf den Magnetständer aEntfernen Sie den Waschpuffer sorgfältig und entsorgen Sie ihn, sobald die magnetischen Perlen auf der Seite des Röhrchens aggregieren.
  3. Waschen Sie die Kügelchen einmal mit 800 μl Waschpuffer 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 und 500 mM NaCl); Mischen, indem man das Röhrchen mehrmals umkehrt. Legen Sie den Schlauch auf den Magnetständer und entfernen Sie den Waschpuffer vorsichtig und entsorgen Sie ihn, sobald sich die magnetischen Perlen auf der Seite des Rohres zusammensetzen.
  4. Die Perlen in 50 & mgr; l Elutionspuffer (1% SDS und 100 mM NaHCO 3 ) resuspendieren und die Proben auf einem End-to-End-Rotator für 15 min bei RT inkubieren.
  5. Legen Sie die Röhrchen auf einen Magnetständer, und sobald sich die magnetischen Perlen an der Seite des Röhrchens sammeln, übergeben Sie den Überstand in ein frisches Rohr.
  6. Fügen Sie 6 μl 5 M NaCl hinzu, um die Vernetzung umzukehren, und 2 μl Proteinase K (0,5 μg / μL). Nach dem Mischen der Proben die Proben für 2 h bei 65 ° C inkubieren.
  7. Zur Reinigung der DNA eine Phe durchführenNol / Chloroform-Extraktion 12 (Schritt 3.5) und anschließend das Pellet in 30 μl dH 2 O resuspendieren.
    HINWEIS: Die Proben können direkt auf Proteinbindungsstellen (Abschnitt 5) analysiert oder bei -20 ° C gelagert werden.

6. Binding-Site-Analyse

  1. Führen Sie eine Analyse für spezifische Bindungsstellen innerhalb einer bekannten Nukleinsäuresequenz unter Verwendung von PCR oder qRT-PCR durch. Für das Primer-Design folgen Sie konventionellen PCR- oder qRT-PCR-Protokollen. Entwerfen Sie die Primer, um ein 150-400 bp Amplikon zu synthetisieren, das die Proteinbindungsstelle von Interesse überbrückt ( Abbildung 1 ).
  2. Stellen Sie die PCR mit vier verschiedenen DNA-Matrizen ein, um die Spezifität zu gewährleisten: i) DNA aus ChIP, die mit dem interessierenden Antikörper immunpräzipitiert wurde, ii) DNA aus ChIP, immunpräzipitiert mit einem unspezifischen IgG-Antikörper, iii) Input-DNA und iv) H 2 O als a Negativkontrolle für die PCR, um die Kontamination auszuschließen. Im Falle der Bahnstimulation, Wählen Sie eine fünfte Schablone mit einem anderen Satz von Primern, die für eine bekannte Bindungsstelle des immunpräzipitierten Proteins spezifisch sind.
    HINWEIS: Im Falle der c-KIT-Liganden-Promotor-Analyse verwenden Sie herkömmliche PCR, um die TGF-β-induzierte SMAD-Bindung an der SBE innerhalb der c-KIT-Liganden-Promotorregion zu demonstrieren. Als Positivkontrolle führen wir PCR auf Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) als bekanntes Ziel der TGF-β-induzierten SMAD-Bindung durch.

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Ergebnisse

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Die Bindung des TGF-β1-Liganden an seinen kognitiven Rezeptorkomplex führt zur Serin-Phosphorylierung von SMAD2 / 3-Transkriptionsfaktoren, gefolgt von deren Assoziation mit dem gemeinsamen Mediator SMAD4. Der SMAD-Komplex verschiebt sich zum Kern. TGF-β kann die Gentranskription entweder direkt über SMAD-Bindung an SBEs innerhalb regulatorischer Regionen der Zielgene oder indirekt durch die SMAD-regulierte Expression von Transkriptionsaktivatoren oder Repressoren regulieren, die anschli...

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Diskussion

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In diesem Bericht zeigen wir die TGF-β1-induzierte Bindung von SMAD2 an eine SBE innerhalb des c-KIT-Liganden-Promotors und TGF-β1-induzierte Bindung von STAT3 an seine Erkennungssequenz innerhalb des TGF-β1-Liganden-Gens. Wir zeigen die Cytokin-induzierte Bindung beider Transkriptionsfaktoren unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation.

Chromatin-Immunpräzipitation ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die direkte Bindung eines Proteins von Interesse für DNA zu demonstrieren, um die R...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (Startup Fonds, BB) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HepG2-ZellenATCCHB-8065
Hep3B-ZellenATCCHB-8064
TGF-β 1Forschung und Entwicklung D Systems101-B1Wird in einer Konzentration von 10 ng/mL
verwendet Anti-SMAD2-AntikörperCell Signalling Technology5339Verwendete Menge/IP: 3 & Mikro; g
Anti-STAT3-AntikörperCell Signalling Technology4904Verwendete Menge/IP: 3 µ g
ChIP-IT-Protein g Magnetische KügelchenAktives Motiv53033
Protease-Inhibitor-CocktailAktives Motiv37490
Mikrokokken-Nuklease-Zellsignaltechnologie10011
PCR-Vorwärtsprimer: PAI-1Sequenz: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
PCR-Reverse-Primer: PAI-1Sequenz: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
PCR-Forward-Primer: SCF-Sequenz: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'  
PCR-Reverse-Primer: SCF-Sequenz: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
PCR-Forward-Primer: TGF-β 1 (STB-1)Sequenz: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'  
PCR-Reverse-Primer: TGF-β 1 (STB-1)Sequenz: 5'-TAGCTTTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'  
PCR-Forward-Primer: TGF-β 1 (STB-2)Sequenz: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'        
PCR-Reverse-Primer: TGF-β 1 (STB-2)Sequenz: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTC-3'    

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Schlagwörter

c KIT PromotorDNA Protein InteraktionSMAD2 BindungTGF Beta SignalisierungStem Cell FactorTranskriptionsfaktorbindungPromotor AssaySTAT3 BindungZelldifferenzierung

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