Method Article

Eine Methode, um die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten zu untersuchen Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir zeigen einen Assay, um die ökologischen und genetischen Cues zu analysieren, die das Paarungsverhalten in der Fruchtfliege beeinflussen Drosophila melanogaster .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der sexuelle Antrieb eines Individuums wird durch Genotyp, Erfahrung und Umweltbedingungen beeinflusst. Wie diese Faktoren interagieren, um sexuelle Verhaltensweisen zu modulieren, bleibt schlecht verstanden. In Drosophila Melanogaster , Umwelt-Cues, wie die Verfügbarkeit der Lebensmittel, beeinflussen Paarung Aktivität bietet ein traktierbares System, um die Mechanismen zu modulieren sexuelles Verhalten zu untersuchen. In D. melanogaster werden ökologische Hinweise oft über die chemosensorischen Geschmacks- und Geruchsstoffe erkannt. Hier stellen wir eine Methode vor, um die Wirkung von umweltchemischen Stichworten auf das Paarungsverhalten zu testen. Der Assay besteht aus einer kleinen Paarungsarena mit Nahrungsmedium und einem Paarungspaar. Die Paarungsfrequenz für jedes Paar wird kontinuierlich für 24 Stunden überwacht. Hier stellen wir die Anwendbarkeit dieses Assays dar, um Umgebungsverbindungen aus einer externen Quelle durch ein Druckluftsystem zu testen und die Umweltkomponenten direkt in der Paarungsarena zu manipulieren. Das UEin Druckluftsystem ist besonders nützlich, um die Wirkung von sehr flüchtigen Verbindungen zu testen, während die Manipulation von Komponenten direkt in der Paarungsarena von Wert sein kann, um die Anwesenheit einer Verbindung zu ermitteln. Dieser Assay kann angepasst werden, um Fragen über den Einfluss von genetischen und ökologischen Cues auf Paarungsverhalten und Fruchtbarkeit sowie andere männliche und weibliche Fortpflanzungsverhalten zu beantworten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fortpflanzungsverhalten haben typischerweise hohe Energiekosten, vor allem für Frauen, die größere Gameten produzieren als Männer und müssen sorgfältig die Bedingungen wählen, um ihre sich entwickelnden Nachkommen zu erhöhen. Wegen der Energiekosten ist es nicht verwunderlich, dass die Reproduktion mit den Ernährungsbedingungen verbunden ist. Dies gilt in den meisten, wenn nicht alle Tiere , einschließlich Säugetiere, deren Pubertät durch Unterernährung verzögert werden kann und Sexualtrieb , dessen kann sich negativ durch Nahrungsbeschränkung 1 betroffen sein.

Die Reproduktion des genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster wird auch durch Ernährungsbedingungen beeinflusst. Males Gericht auf höherem Niveau in Gegenwart von Lebensmitteln flüchtige 2 , und Frauen sind mehr sexuell empfänglich in Gegenwart von Hefe, ein wichtiger Nährstoff für die Eiproduktion und Nachkommen Überleben 3 , 4 , 5 . DiesEvolutionäre konservierte Reproduktionsreaktion auf Nahrung bietet die Möglichkeit, Mechanismen zu untersuchen, die die Umweltnahrungsmittelverfügbarkeit mit der sexuellen Reproduktion in einem genetisch tragbaren und zeitsparenden Organismus verbinden. In der Tat hat die Arbeit in D. melanogaster den Insulinweg als wichtigen Regulator des Zusammenhangs zwischen Nahrung und Paarungsverhalten verwickelt 6 . Es hat auch gezeigt, dass der Akt der Paarung selbst die Nahrungspräferenz von Weibchen sowie die damit verbundenen chemosensorischen Neuronen 7 , 8 , 9 ändert.

Es ist klar, dass Lebensmittel-Cues Reproduktionsverhalten in D. melanogaster beeinflussen . Diese Effekte scheinen vor allem Frauen zu behandeln, speziell diejenigen, die bereits gepaart haben 5 . Um jedoch diese akuten Effekte von Umgebungsbedingungen zu testen, kann der Assay, der klassisch für weibliches Paarungsverhalten verwendet wird,Nicht sehr geeignet wegen der langen Unterbrechungen zwischen Paarung Episoden. In der klassischen Remoting-Assay, eine Jungfrau weiblich erste Kumpel mit einem Mann, und ist sofort isoliert und präsentiert mit einem neuen Mann 24 bis 48 Stunden später. Dieser klassische Assay wurde mit großem Erfolg verwendet, um Komponenten des männlichen Ejakulats zu identifizieren, die das weibliche Verhalten und die weibliche Antwort 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 modifizieren. Der hier vorgestellte kontinuierliche Paarungsassay ist daher eine Ergänzung zu klassischen Paarungsassays, mit denen die akute Wirkung von Umgebungsbedingungen auf das Fortpflanzungsverhalten untersucht werden kann.

Mit dem kontinuierlichen Assay für das Paarungsverhalten, das hier erklärt wird, haben wir vorher gezeigt, dass ein Paar Fliegen, die Hefe ausgesetzt sind, sAlltägliche Zeiten über einen 24-Stunden-Beobachtungszeitraum 5 , 19 , 20 , 21 , während Fliegen, die nicht der Nahrung ausgesetzt sind, nur einmal 5 Dieser Befund kann im Lichte eines großen Teils der D. melanogaster- Literatur rätselhaft sein, was darauf hinweist, dass Frauen sich nach einer anfänglichen Paarung (einige in den Ziffern 10 , 11 ) nicht wiederholen. Allerdings kann diese Diskrepanz leicht durch Assay-Bedingungen erklärt werden, wo eine Frau für ein bis mehrere Tage isoliert ist, bevor eine neue Paarungsmöglichkeit zur Verfügung gestellt wird. Wenn das Paar in dieser stundenlangen Beobachtungsperiode nicht passt, wird das Weibchen als nicht empfänglich charakterisiert. Darüber hinaus sollte die hohe Paarungsfrequenz nicht überraschen, da die Daten von wild gefangenen Fliegen zeigen, dass Frauen Spermien von 4 bis 6 Männchen in ihren Speicherorganen enthalten; Also inDass Frauen selbstverständlich mehrmals 22 , 23 .

Hier zeigen wir die Verwendung dieses kontinuierlichen zusammenpassenden Assays, um zu enträtseln, wie Fliegen sammeln und kombinieren Informationen über Umgebungsbedingungen, um Paarungsfrequenz zu modulieren. Dieser Assay erlaubt es, eine relativ große Anzahl von Paarungspaaren für genetische Studien zu testen und den Einfluss von flüchtigen und nicht-flüchtigen Umwelt-Cues zu testen. Der Assay läuft typischerweise für 24 h, kann aber auf 48 h verlängert werden, was die Prüfung von Zyklus-Umgebungs-Cues wie dem Hell-Dunkel-Zyklus ermöglicht. Wir zeigen diesen Assay, indem wir den Einfluss von flüchtigen Cues aus einer Hefekultur innerhalb eines Druckluftsystems in Kombination mit der Verfügbarkeit von nicht-flüchtigen Hefe-Nährstoffen in dem Nahrungsmittelsubstrat untersuchen.

Das Druckluftsystem pumpt kontinuierlich flüchtige Cues in eine passende Arena, die enthaltenSa-Food-Substrat und ein Test-Paar (dessen Paarungsverhalten überwacht wird). Um die Besonderheiten, durch die die Hefe beeinflusst, zu bestimmen, testen wir eine große flüchtige Verbindung von Hefe, nämlich Essigsäure 24 , in Kombination mit einem Aminosäuregehalt, der dem von Hefe im Nahrungsmittelsubstrat entspricht, in Form von Pepton (Amino Säuren, die aus der enzymatischen Verdauung von tierischen Proteinen gewonnen wurden). Gemeinsam zeigen diese Experimente, wie die Wirkung von Umwelteinflüssen auf das Paarungsverhalten von D. melanogaster mit diesem Assay getestet werden kann.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Umweltgesteuerte Paarungsbox

  1. Um eine kontrollierte und leicht zu reinigende Testfläche zu gewährleisten, richten Sie einen Edelstahl-Küchenschrank von 120 cm x 64 cm x 85 cm ein, wie in Abbildung 1A dargestellt.
    1. Bohren Sie ein Loch an der Rückseite des Schrankes knapp unter der Decke und vier Sätze von vier Löcher in die Seiten, jeweils mit einem Durchmesser von 2 cm. Bohren Sie die ersten beiden Sätze von vier Löchern, auf jeder Seite des Kastens in einer Höhe von 7 cm von der Unterseite des Kastens und mit 12.5 cm zwischen den Löchern. Bohren Sie die beiden anderen Sätze auf jeder Seite der Schachtel in einer Höhe von 35 cm von unten.
      HINWEIS: Die vier Sätze von vier Löchern werden für Kamerastromkabel und Luftpumpschlauch verwendet, um das Gehäuse zu betreten und zu verlassen. Das Loch auf der Rückseite wird für die Stromkabel einer Leuchttafel verwendet.
    2. Bilden Sie eine Leuchttafel mit 18 Reihen von 40 wechselnden weißen und roten Leuchtdioden (LED) mit 2,5 cm Abstand zwischen jedem Licht. Stellen Sie die weißen und roten LEDs in einem Kreislauf einT mit Stromversorgung. Verbinden Sie jede LED in Serie mit einem Widerstand von 560 Ω, 0,25W und 5% Toleranz.
      HINWEIS: Die Emissionswellenlängen des roten Lichts von 590-661 nm mit einem scharfen Peak bei 627 nm. Die daraus resultierende Lichtintensität im Experimentierbereich beträgt ca. 900 Lux bei beiden Lampen und 90 Lux mit nur den roten Lampen an; Dies wurde mit einem smartphone light meter app gemessen.
    3. Befestigen Sie die Lichtplatte an der Oberseite des Edelstahl-Schrankes und führen Sie die Stromkabel durch das Loch auf der Rückseite.
    4. Verbinden Sie den Adapter der weißen LEDs mit einem Power Control Timer, um das Wechseln der weißen LED während der Dunkelphase des Experiments zu ermöglichen. Verbinden Sie den Adapter des roten Lichts, das fliegt blind bis 25 , zu einer regelmäßigen Stromversorgung, um sie für die gesamte Dauer des Experiments zu halten.
    5. Fixieren Sie eine 110 cm und zwei 54 cm lange Metallhalterungen, jeweils mit einer Breite von 0,5 cm, bis zu den Innenseiten der Box auf einer Höhe 50Cm von der Unterseite der Box. Legen Sie eine Glasdiffusionsplatte (Maße von 119,0 cm x 54,5 cm x 0,5 cm) auf diese Klammern.
    6. Fügen Sie drei Schichten Filterpapier (120 cm x 50 cm) zwischen der Lichtplatte und der Glasplatte hinzu, um das Licht zu diffundieren und die Blendung auf der Oberfläche der zusammenpassenden Arenen zu begrenzen (siehe Abschnitt 4). Pin zwei Filter Papierblätter zusammen auf ihre lange Kante auf 120 cm lange Holzstangen mit Magneten (auf der Seite), um sie an den Innenseiten des Metall-Schrank zu kleben; Diese Aktion 3 mal durchführen.
    7. Befestigen Sie vier Lüfter an den Seiten der Box, um einen Luftstrom zu erzeugen, der ständig die passende Box entlüftet. Befestigen Sie den ersten Satz von 8 cm-Ventilatoren zwischen der Lichtplatte und der Glasplatte, mit dem Lufteinlass auf der linken Seite und dem Auspuff an der rechten Seite der Box, um den Aufbau der von der Leuchttafel erzeugten Wärme zu minimieren.
    8. Befestigen Sie den zweiten Satz von 12 cm Ventilatoren 25 cm über dem Boden des Schrankes, um einen äußeren Luftstrom zu erzeugen, der das i entlüftetNside des Schrankes und kühlt es zu einem stabilen 26 ° C. Bringen Sie die Lüfter an der Auspuffseite an einen Saugschlauch an und führen Sie den Luftstrom aus dem Raum, um ein erneutes Radfahren der Luft im Schrank zu verhindern.
  2. Stellen Sie zwei Ständer (ca. 48 cm hoch) mit zwei Klemmen auf, eine bei 28 cm und eine mit 30 cm von der Unterseite des Ständers. Fix eine Webcam auf jede der Klemmen. Verbinden Sie die 4 Kameras mit einem Computer, auf dem die Überwachungssoftware läuft.
  3. Platzieren Sie A4 Blätter unter jeder Webcam. Benutzen Sie unbedruckte weiße Blätter oder Blätter mit vornumeriertem Gitter von 7 von 5 Quadraten mit 4 cm-Achsen, um passende Arenen (siehe Abschnitt 4) aufzunehmen.
    HINWEIS: Eine HD-Webcam mit 78 ° Weitwinkel-Ansicht und 5-Millionen-Pixel-Auflösung kann eine Fläche von 21 cm x 30 cm entsprechend einem A4-Blatt und Monitor zwischen 20 und 35 Paarungs-Arenen abdecken.

2. Fliegen Aufzucht und Sammlung

  1. Platz 20 männlichen und 20 weiblichen Wild-Typ Canton-SFliegt in Fliegenaufzuchtflaschen, die 45 mL reiche Fliegenfuttermedium (siehe Abschnitt 3) für drei bis vier Tage enthalten. Übertragen Sie die gleichen Erwachsenen dreimal, indem Sie sie zuerst und dann in frische Flaschen klopfen.
    1. Legen Sie die Flaschen in einen Inkubator bei 25 ° C und 12 h: 12 h Hell-Dunkel-Zyklus mit Lichter an um 09:00 (Zeitgeber Zeit (ZT) 0). Eine neue Generation wird etwa 10 Tage später erscheinen.
  2. Anästhesieren Sie die daraus entstandenen neu entdeckten Fliegen auf Kohlendioxid-Pads für nicht länger als 5 Minuten und sammeln Sie sie in fliegen Lebensmittel Fläschchen mit einem Pinsel.
    1. Sammeln Sie jungfräuliche (neu erschlossene) Weibchen und Jungfrauen aus den Wildtyp- Canton-S- Lagerflaschen in 2,5 cm x 9,5 cm Fliegenaufzuchtfläschchen mit 6,5 ms reichhaltigem Futterfuttermedium.
  3. Alter der Fliegen in den gleichen Geschlechtsgruppen von 20 Fliegen jeweils in Fliegenaufzucht Fläschchen für 5 bis 8 Tage bei 25 ° C und 12 h: 12 h hell-dunkler Zyklus und Lichter an um 09:00 (ZT 0).
  4. TransfDie Fliegen zu frischen Fliegenaufzucht Fläschchen am Tag vor dem Experiment.

3. Lebensmittel Mittel Vorbereitung

  1. Bereiten Sie 1 L des reichen Fliegenmediums wie folgt vor.
    1. 1 l Leitungswasser in ein 2-l-Glasbecher mit einem Magnetrührer geben und den Becher auf eine Magnetplatte stellen. Halten Sie das Rühren aus und drehen Sie die Heizung auf 300 ° C, bis die Siedetemperatur erreicht ist.
      HINWEIS: Während der langen Siedezeit in den folgenden Schritten wird ein Wasseranteil verdampfen, aber zusammen mit den zugesetzten Zutaten führt dieses Protokoll zu 1 l reichem Fliegenmedium, wenn es bei Raumtemperatur von etwa 22 ° C hergestellt wird.
    2. Schalten Sie das Rühren auf 500 Runden pro Minute (U / min) ein und fügen Sie dem kochenden Wasser folgende Zutaten hinzu: 10 g Agar, 30 g Glukose, 15 g Saccharose, 15 g Maismehl, 10 g Weizenkeim, 10 g Sojamehl, 30 g Melasse, 35 g aktive Trockenhefe. Warten Sie auf die Hefe, um kräftig zu schäumen, dann drehen Sie die heiße PlattentempErature bis 120 ° C.
    3. Nach 10 min die heiße Platte auf 30 ° C abkühlen lassen und die Mischung rühren lassen, bis sie auf 48 ° C abgekühlt ist. Überwachen Sie die Temperatur, indem Sie ein Thermometer direkt in das Lebensmittel einführen.
    4. 2 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester (tegosept, 100%) in 10 ml 96% iges Ethanol auflösen. Fügen Sie diese und 5 ml 1 M Propionsäure der Mischung hinzu. Rühre für 3 min.
    5. Gießen Sie das Fliegenfuttermedium in die Arenen (beschrieben in Abschnitt 4), um eine 0,3 cm dicke Schicht an der Unterseite der Arena zu schaffen.
      1. Verwenden Sie zum Ausgießen ein 200 ml Glasbecher. Wenn genaue Mengen wichtig sind, verwenden Sie eine 10 mL serologische Pipette.
  2. Bereiten Sie Fliegenmedien minus Hefe genau wie in Schritt 3.1.1 bis 3.1.5 beschrieben, aber lassen Sie die Hefe in Schritt 3.1.2.
  3. Medium mit Agar mit oder ohne Pepton durch Mischen von 10 g Agar und 35 g Pepton in 1 l kochendem Wasser zubereiten und die Schritte 3.1.4 bis 3.1.5 durchführen.

4. MatinG Arena Vorbereitung

  1. Durchbohren Sie ein Loch von ca. 0,3 cm Durchmesser auf der Oberseite einer 3,5 cm x 1,0 cm breiten Plastik-Petrischale mit einer beheizten Präparationsnadel (erhitzt auf Rötung in einem Bunsenbrenner). Alternativ verwenden Sie auch einen Lötkolben.
  2. Bei der Zubereitung von Nahrungsmittelmedium mit geruchlosen Verbindungen wird die erste Pipette 30 μl (1% des endgültigen Nahrungsmittelmediums, z. B. Essigsäure Glazial 100%) der gewünschten Verbindung in die Schale für die Hälfte der Versuchsschalen pipettiert. Lassen Sie die andere Hälfte des Geschirrs zum Vergleich leer.
    HINWEIS: Mit dem hier beschriebenen Aufbau können maximal 140 Arenen sofort getestet werden.
  3. Unter Verwendung einer 10 mL serologischen Pipette gießen Sie 3 ml Lebensmittelmedium an der Unterseite der Schale auf die gewünschte Verbindung. Mit einem Käsetuch abdecken, um eine Kontamination zu vermeiden und das Medium ca. 1 h bei Raumtemperatur zu verfestigen.
  4. Legen Sie einen Deckel auf die Teller und Klebeband jeweils auf zwei Seiten zu schließen. Bereiten Sie kleine Paraffin-Filmstopfen vor, um die Löcher zu bedeckenDie Gerichte durch Walzen von Paraffin-Folien in 0,2 cm dicke Walzen und schneiden sie dann in 0,5 cm-Segmente.

5. Hefe-Kultur für Geruch

  1. Wachsen Sie trockene aktive Hefe auf Hefeextrakt Pepton Dextrose (YPD) Agar in einer 14,0 cm x 2,06 cm Petrischale. Tragen Sie Handschuhe, um Kontamination in diesem Schritt zu verhindern.
    1. YPD-Agarplatten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 22 g Glucose (0 (+) - Glucose-Monohydrat) und 15 g Agar (rein) zu 1 l kochendem Reinstwasser zubereiten. Legen Sie den Boden der Petrischale, sobald alles aufgelöst ist und lagern Sie sich im Kühlschrank bei 4 ° C, für bis zu 2 Monate.
    2. Streuen Sie ein paar Körner getrocknete Hefe auf eine YPD-Mediumplatte, lassen Sie sie auflösen. Dann strecke die mittlere Platte mit einer sterilen Schleife. Die Platte in einem 30 ° C Inkubator über Nacht aufbewahren. Danach die Kultur im Kühlschrank für nicht länger als 1 Woche aufbewahren.
  2. YPD flüssiges Medium vorbereiten iN 1 L-Flaschen durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 22 g Glucose (0 (+) - Glucose-Monohydrat) und einem Rührstab zu 1 l Reinstwasser.
    1. Autoklav für 25 min bei 120 ° C und 1 bar Druck. Danach die Flaschen bis zu 2 Monate bei 4 ° C aufbewahren.
  3. Die offenen Flaschendeckel (4,5 cm) mit einem 0,32 cm dicken Silikonseptum anbringen.
    1. Schneiden Sie zwei kleine Löcher im Septum, um eng an Stacheldraht-Armaturen anzupassen. Befestigen Sie die kleinen Polyvinylchlorid (PVC) Schläuche (Durchmesser: außen 0,8 cm und innere 0,5 cm) an beiden Ausgängen, die die Flasche verlassen und nur einen der Einlässe in die Flasche eindringen. Siehe Abbildung 1B zur Veranschaulichung.
    2. Wickeln Sie die mitgelieferten Kappen und Schläuche in Aluminiumfolie und Autoklav für 25 min bei 120 ° C und 1 bar Druck.
  4. Tragen Sie Handschuhe zum Schutz vor Kontamination in diesem Schritt. Tauchen Sie eine sterile 100 μl Pipettenspitze in eine der Hefekolonien aus der YPD-Agarplatte (dIn 5.1 beschrieben) und in die autoklavierte Flüssigmediumflasche YPD fallen lassen.
    1. Diese Hefe-inokulierte YPD-Flüssigmedium-Flasche sowie eine YPD-Medium-Kontrollflasche (Hefe nicht zugegeben) mit autoklavierten Kappen, die mit Ein- und Auslauf montiert sind (beschrieben in Schritt 5.3). Setzen Sie beide Flaschen auf getrennte magnetische Platten und rühren bei 100 U / min bei Raumtemperatur für 24 Stunden vor Beginn des Experiments, um die Hefekultur zu wachsen.
    2. Verbinden Sie die Einlässe beider Flaschen, um Aquariumpumpen zu trennen, um der Hefekultur Luft zuzuführen. Vergewissern Sie sich, den Auslass der experimentellen Hefeflasche mit einem Schlauch zu verbinden, der den Hefegeruch aus dem Versuchsraum entlüftet, um eine Störung des Experiments zu vermeiden.

6. Luftpumpenaufbau

  1. Bringen Sie den großen PVC-Schlauch (Durchmesser: ca. 1,2 cm und innen 0,9 cm) an eine Druckluftzufuhr an und führen Sie ihn durch zwei 1-l-Glas-Erlenmeyerkolben, die mit Aktivkohle bis zu 800 ml gefüllt sindUm die Luft zu reinigen. Verwenden Sie entweder Druckluft, die üblicherweise in Labors als Luftzufuhr geliefert wird, oder verbinden Sie die Rohre mit einer Luftpumpe (hier wurde Druckluft verwendet).
    HINWEIS: Schlauchmaterial sollte auf der Grundlage der chemischen Eigenschaften des flüchtigen Materials ausgewählt und getestet werden, um zu verhindern, dass das flüchtige Material an der Auskleidung des Schlauches anhaftet (z. B. Polytetrafluorethylen, Nylon oder Edelstahl).
  2. Machen Sie zwei Luftteiler aus 15 ml Röhren und jeweils drei 1.000 μl Pipettenspitzen.
    1. Machen Sie drei Löcher von ~ 1 cm Durchmesser. Zuerst zwei Löcher verbrennen, mit einer beheizten Präparationsnadel (beheizt rot in einem Bunsenbrenner), nebeneinander direkt unterhalb des Deckels des 15 mL Röhrchens. Dann machen Sie das dritte Loch, indem Sie den Boden des Tubus entfernen.
    2. Kleben Sie die 1.000 μl Pipettenspitzen in die Löcher mit dem schmalen Ende nach außen. Schneiden Sie das Ende der Pipettenspitzen, um einen größeren Luftstrom zu ermöglichen.
  3. Verbinden Sie den großen PVC-Schlauch vom Ausgang des cHarcoal-gefüllter Erlenmeyerkolben zur Pipettenspitze am Boden des 15-ml-Röhrchens. Fügen Sie kleine PVC-Schlauch-Auslässe zu den beiden horizontalen Pipettenspitzen hinzu und führen Sie sie zu einer Kontrolle und einer experimentellen Flasche.
  4. Um eine Verunreinigung des YPD-Mediums mit Mikroorganismen zu vermeiden, befestigen Sie den kleinen Schlauch an einem sterilen Spritzenfilter (0,45 μm Porengröße) mit einem plastischen Druck auf Schottschlauchverbinder, der in Richtung des Filters geht, und eine Schraube auf den Kunststoffschottverbinder, der den Filter verlässt. Dann befestigen Sie den Schlauch an den Einlass der YPD-Kulturflasche (siehe Abbildung 1B ).
  5. Um zu verhindern, dass luftgetragene Hefe aus dem Kulturkolben in die experimentelle Arena fährt, befestigen Sie ein Glasrohr (6,5 cm lang, Außendurchmesser = 0,5 cm und Innendurchmesser = 0,3 cm) zum Auslass jeder YPD-Kulturflasche mit kleinen Schläuchen. Befestigen Sie die PVC-Schläuche an der anderen Seite des Glasrohres und führen Sie diese in Richtung der unteren Löcher (gebohrt an jeder Seite) des Experimentierkastens.
    1. Füllen Sie das Röhrchen mit Glasfaser und autoklavieren Sie es vor Gebrauch.
  6. Fügen Sie einen weiteren 15-ml-Röhrenteiler (beschrieben in Abschnitt 6.2) zu den kleinen PVC-Schläuchen, auf jeder Seite der Versuchsbox, um zwei Röhrchen in die Schachtel sowohl auf der experimentellen Seite (am nächsten zu Auspuff der Fan-Luftstrom, rechts) Und die Steuerseite (am nächsten zum Einlass des Lüfterluftstroms, links).
  7. Bereiten Sie 8x 25 mL serologische Pipetten mit jeweils 10 Ausgängen vor, um 80 Paarpaare gleichzeitig zu testen, dh 40 für jede Klimaanlage.
    1. Brennen Sie 10 Löcher von ~ 0,8 cm Durchmesser, 2 cm auseinander in die Pipette.
    2. Schneiden Sie den äußeren Teil einer 1-ml-Spritze in einen kleinen (2,5 cm) und einen großen (5 cm) Auslass.
    3. Kleben Sie diese Steckdosen in die Löcher mit Heißleim.
    4. Wickeln Sie ein kleines Band aus Plastik-Paraffin-Film um das Ende der Steckdosen und befestigen Sie eine 1.000 μl Pipettenspitze. Der Durchmesser der Spitzenöffnung beträgt 0,1 cm. Verwenden Sie für jeden Versuch saubere Tipps.
  8. Befestigen Sie zwei serologische Pipetten, mit einem T-Splitter mit Außendurchmesser ≥ 0,5 cm und kurzen Stücken von kleinen PVC-Schläuchen, an jedem der beiden Auslässe auf beiden Seiten. Tip die Pipetten flach auf dem weißen Papierblatt (unter den Kameras im Stahlkasten).
  9. Mit einem Luftstrommonitor den Luftstrom so einstellen, dass die Luftgeschwindigkeit am Ausgang der 1000 μl Pipettenspitze 0,5 m / s beträgt. Dies entspricht einem Luftstrom von 0,0017 L / s pro Spitze.

7. Überwachung des Paarungsverhaltens

  1. Verwenden Sie eine Mundpipette (wie in Referenz 26 beschrieben ), um eine experimentelle Frau in eine kleine Petrischale (beschrieben in Abschnitt 4) um 15:00 Uhr (ZT 6) zu stellen und ihr 1 h zu geben, um sich an die Paarungsarena zu akklimatisieren.
  2. Richten Sie die Versuchsbox (siehe Abschnitt 1) ​​wie folgt ein:
    1. Schalten Sie die Lichter ein, dh weiße Licht-LEDs auf einem 12h: 12 h Hell-Dunkel-Zyklus, der mit einem Timer verbunden ist, der einschaltetLicht um 09:00 (ZT0) und kontinuierliche Rotlicht-LEDs zur Überwachung der Fliegen während der Dunkelphase des Experiments. Schalten Sie die Lüfter ein, um das Aufheizen des Schranks durch die Lichtquelle zu begrenzen und um sicherzustellen, dass überschüssige Gerüche außerhalb des Testbereichs entlüftet werden.
    2. Verbinden Sie Webcam-Kameras mit einem Computer und starten Sie sie mit der Überwachungssoftware für die Bildüberwachung.
    3. Für jede Kamera stellen Sie den Fokus, die Helligkeit ein und vergrößern Sie die Überwachungssoftware.
      1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Kamerabildschirm, öffnen Sie "Kameraleigenschaften" und klicken Sie auf "automatischer Fokus". Passen Sie den "Fokus" an, um das Raster oder irgendwelche schriftlichen Wörter auf dem Papierblatt zu klären. Ändern Sie ggf. "Helligkeit" und "Zoom".
    4. Stellen Sie das Programm der Überwachungssoftware ein, um 1 Bild alle 2 min zu erfassen. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jeden Kamerabildschirm und wählen Sie "Kamera bearbeiten" und dann die Option "Aktionen". Klicken Sie hier, um die Aktionen zu startenErvals "und ändern Sie die Zeit auf" 2 ​​Minuten ". Wählen Sie" Take Photo "für ausgewählte Aktionen ausführen und schließlich auf" ok "klicken.
    5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jeden Kamerabildschirm und wählen Sie "Monitor starten".
  3. Nach 1 h (bei ZT 7), transferiere einen Wildtyp-Mann in die Petrischale mit der Mundpipette, platziere das Teller auf die A4-Papierblätter unter den Webcam-Kameras und klicke auf "Start-Monitoring" für 24 Stunden. Für das Luftpumpen-Experiment legen Sie die Schale so, dass ein Pipettenauslass mit dem Eingangsloch der Gegenarena verbunden ist.
  4. Um das Paarungsverhalten des Paares zu analysieren, gehen Sie wie folgt vor.
    1. Wählen Sie alle Bilder in einer Bildbetrachtungssoftware aus und öffnen Sie sie in chronologischer Reihenfolge.
    2. Notieren Sie das Datum, die Versuchsnummer, die Tellernummer und die Startzeit in eine Tabellenkalkulation innerhalb derselben Zeile. Nehmen Sie die Startzeit jeder Arena aus dem Moment, dass es unter der Webca platziert istM Kamera. Notieren Sie den Zeitstempel aus den Bildern.
    3. Markieren Sie die Startzeit jeder Kopulation in der gleichen Zeile in die Kalkulationstabelle. Zählen Sie eine Paarung als ein Ereignis, wenn das Männchen hat die weibliche und das Paar bleibt mäßig stationär und in der gleichen Haltung für mindestens fünf aufeinander folgenden Frames (10 min).
      HINWEIS: Dieses Kriterium basiert auf der gemeldeten Länge der Kopulation, von 12 bis 27 min in D. melanogaster und die Beobachtung, dass Kopulationen von 10 min und mehr fruchtbar sind 27 , 28 .
    4. Zählen Sie die Anzahl der Kopulationen für jede Zeile in der Kalkulationstabelle, um die Paarungsfrequenz zu bestimmen. Alternativ subtrahieren Sie die Startzeit des Experiments von der Zeit der ersten Paarung für jede Zeile als Maß für die Paarungslatenz, oder subtrahieren Sie die Zeit der ersten Paarung von der Zeit der zweiten Paarung als ein Maß für die Beantwortung der Latenz.
      1. Um die Latenzzeit zu berechnen, stellen Sie sicherDefinieren die Daten der ersten und der zweiten Paarung als aufeinanderfolgende Tage in der Tabellenkalkulationssoftware.
    5. Analysieren Sie die Daten mit Mixed-Effects-Modellen, unter der Annahme einer normalen Verteilung der Daten und einschließlich des Datums des Experiments als zufälliger Faktor unter Verwendung einer statistischen Software (siehe Tabelle der Materialien), um die statistische Signifikanz der unabhängigen Variablen zu bestimmen - Lebensmittelmedium, Lufttyp und Interaktion - wie zuvor beschrieben 5 .
    6. Wählen Sie das beste erklärende Modell aus, indem Sie die Rückwärts-Beseitigung von nicht signifikanten unabhängigen Variablen mit Hilfe von Log-Likelihood-Ratio-Tests und den zugehörigen Akaike-Informationen durchführen. Nach dem Ausführen des Modells visuell die Datenreste überprüfen, um die Normalität zu bestätigen. Bestätigen Sie die Homogenität der Abweichungen mit dem Levene-Test. Im Falle einer ungleichen Homogenität verwandelt die Quadratwurzel die Daten.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mit diesem kontinuierlichen Assay, Paarungsverhalten und Paarungsfrequenz im spezifischen, kann unter experimentellen Umgebungsbedingungen bestimmt werden. Um die Umgebungsbedingungen zu kontrollieren, haben wir einen Edelstahl-Küchenschrank in einen Testbereich mit eigener Lichtquelle und Diffusion verwandelt, der eine hohe Lichtmenge und eine minimale Blendung von der Oberseite der Paarungsarenen gewährleistet ( Abbildung 1A ) . Der innere Testbereich ist komplett aus ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt einen Assay, um das Paarungsverhalten über 24 h zu testen, während kontinuierlich die Umgebungsbedürfnisse kontrolliert werden, dass ein Paarungspaar hypothetisch verwendet wird, um die Paarungsfrequenz zu bestimmen. Es ist möglich, die Gegenfrequenz in Reaktion auf Hefeluft zu erhöhen, die durch ein Druckluftsystem zugeführt wird, wenn das Medium auch Hefe enthält ( 2B ). Zusätzlich kann eine ähnliche Antwort in der Paarungsfrequenz mit einem vereinfachten Nahrungsmittelmedi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen zu offenbaren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken der Bloomington Drosophila Stock Center für die Fliegenbestände; C. Gahr, JT Alkema und S. van Hasselt für ihren frühen Versuch, den Druckluft-Assay zu entwickeln; Jasper Bosman für den Rat zum Anbau von Hefe; Und Rezza Azanchi und Joel Levine für die ursprüngliche Entwicklung der Zeitraffer-Überwachung von Drosophila Paarung Verhalten. JA Gorter wurde von einer Neuroscience Research School BCN / NWO Graduate Program Grant unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise von der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) (Referenz: 821.02.020) an JC Billeter unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Schrank
Küchenschrank aus EdelstahlHorecaworld7412.0105
Weiße LEDsLucky Lightll-583wc2c-001Kaltweiß, 20 mAmpere und 2 V
Rote LEDsLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daWellenlänge zwischen 625 nm, 20 mAmp und 6 V
WiderstandRoyal OhmCFR0W4J0561A50560 Ohm, 0,25 W, 250 V und 5 % Toleranz
Smartphone Belichtungsmesser AppPatrick GiudicelliLight/Lux Meter FREE, Version 1.1.1
PowertimerAlectoTS-121
MetallhalterungenSpitzwinkel 5 x 5 mm, 2 x 5450 und 1 x 1100 mm lang
Milchglasplatte1190 x 545 x 5 mm
Filterpapier BlätterLEE-Filter220Weiß frost
Kleiner LüfterNanoxia Deep Quiet426028529282880 mm Ultra-Quiet PC-Lüfter, 1200 RPM
Großer LüfterNanoxia Deep Silence4260285292910120 mm Ultra-Quiet PC-Lüfter, 650-1500 U/min Webcam-Kamera
Logitech950270B910 HD WEBCAM OEM, Winkel: 78 Grad, Auflösung: 5-Millionen-Pixel   
KamerasoftwareDeskShareSicherheitsmonitor pro
Name<>UnternehmenKatalognummerKommentare
Fliegenaufzucht
FliegenaufzuchtflaschenFlystuff32-1306oz Drosophila Lager Flasche
FlypadFlystuff59-114
Wildtyp-FliegenCanton-S
FliegenaufzuchtfläschchenDominique Dutscher789008Drosophila Röhren schmal 25x95 mm
InkubatorSanyoMIR-154
Magnetische HeizplatteHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Zutaten B.V.010001.26.0
GlukoseGezond& wel1019155Dextrose/Druivensuiker Saccharose
Van GilseKristallzucker
MaismehlFliegenzeug62-100
WeizenkeimeGezond& wel1017683
SojamehlFliegenfutter 62-115
MelasseFliegenfutter62-117
Aktive TrockenhefeRoter Stern
TegoseptFliegenzeug20-258100%
Pepton (Bacto)BD211677
EssigsäureMerck1000631000Glacial, 100%
Petriden-Greiner bio-one35 x 10 mm mit Belüftungsöffnungen
ParaffinfolieBemis NAParafilm
Name<strong>Firma<strong>KatalognummerKommentare
>strong>
Bigpetridish GosselinBP140-01140 x 20,6 mm
ReinstwasserMillipore CorporationMiliQ
HefeextraktBD212750
Agar (rein)BD214530Bacto
Glukose (0(+)-Glukosemonohydrat) Merck18270000004
Open CapsSchott29 240 28 GL45
Silikon-SeptumVWR548-0662
Schottverschraubungen mit WiderhakenNalgene6149-0002
Durchmesser großer: außen 1,2 cm und innen 0,9 cm
Durchmesser kleiner PVC-Schläuche: außen 0,8 cm und innen 0,5 cm
15 ml TubeFalcon
Aquarium PumpeSera precisionsera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W und Druck >100 mbar
AktivkohleSuperfishA8040400Norit Aktivkohle
Einweg-FiltereinheitWhatman10462100
Serologische PipettenVWR612-1600
SpritzeBD Plastipak300013
HeißkleberPattex
SpritzenvorsatzfilterWhatmanFP 30/Porengröße 0,45 mm CA-S
NameUnternehmen<strong>KatalognummerKommentare
>Analyse
Statistics SoftwareRlme4 Paket
Kleiner 627102 PVC-Schläuche

References

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