Methodenartikel

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

DOI:

10.3791/55697

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13. Juni 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Verfahren beschreibt, wie man schnell Neuriten initiiert, verlängert und verbindet, die in mikrofluidischen Kammern organisiert sind, wobei Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen an Mikropipetten befestigt sind, die die Neuritendehnung begleiten.

Zusammenfassung

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Gehirn- und Rückenmarksverletzungen können zu dauerhafter Behinderung und Tod führen, weil es immer noch nicht möglich ist, Neuronen über lange Distanzen zu regenerieren und sie mit einem geeigneten Ziel genau wieder zu verbinden. Hier wird beschrieben, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über lange Distanzen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Die erreichten Verlängerungsraten reichen über 1,2 mm / h, 30-60 mal schneller als die In-vivo- Raten der am schnellsten wachsenden Axone aus dem peripheren Nervensystem (0,02 bis 0,04 mm / h) 28 und 10-mal schneller als bisher berichtet Neuronaler Typus in einem früheren Entwicklungsstadium 4 . Zuerst werden isolierte Populationen von Ratten-Hippocampus-Neuronen für 2-3 Wochen in mikrofluidischen Vorrichtungen gewachsen, um die Zellen präzise zu positionieren, was eine einfache Mikromanipulation und experimentelle Reproduzierbarkeit ermöglicht. Als nächstes werden Perlen, die mit Poly-D-lysin (PDL) beschichtet sind, auf Neuriten gelegt, um Klebstoff zu bildenHandlungen und Pipetten-Mikromanipulation wird verwendet, um den resultierenden Wulst-Neurit-Komplex zu bewegen. Als der Wulst bewegt wird, zieht er einen neuen Neuriten heraus, der über Hunderte Mikrometer erweitert werden kann und funktionell mit einer Zielzelle in weniger als 1 h verbunden ist. Dieser Prozess ermöglicht die experimentelle Reproduzierbarkeit und die Leichtigkeit der Manipulation, während sie langsamere chemische Strategien umgehen, um das Neuritenwachstum zu induzieren. Vorläufige Messungen zeigen hier eine neuronale Wachstumsrate, die weit über physiologische hinausgeht. Die Kombination dieser Innovationen ermöglicht die präzise Etablierung von neuronalen Netzwerken in Kultur mit einem noch nie dagewesenen Maß an Kontrolle. Es ist eine neuartige Methode, die die Tür zu einer Fülle von Informationen und Einsichten in die Signalübertragung und Kommunikation im neuronalen Netzwerk öffnet und auch ein Spielplatz ist, um die Grenzen des neuronalen Wachstums zu erforschen. Die potenziellen Anwendungen und Experimente sind weit verbreitet mit direkten Implikationen für Therapien, die darauf abzielen, neurona wieder anzuschließenL Kreisläufe nach Trauma oder bei neurodegenerativen Erkrankungen

Einleitung

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Verletzungen des erwachsenen zentralen Nervensystems (ZNS) können zu einer dauerhaften Behinderung führen, die auf mehrere Mechanismen zurückzuführen ist, die das axonale Nachwachsen begrenzen. Nach der Verletzung bilden viele ZNS-Axone keinen neuen Wachstumskegel und scheitern eine effektive regenerative Antwort 2 . Darüber hinaus hemmen Schäden und Narbengewebe, die ZNS-Läsionen umgeben, das axonale Wachstum signifikant 1 , 2 , 3 . Aktuelle Therapien zur Förderung der ZNS-Regeneration nach Verletzung konzentrierten sich auf die Verbesserung der intrinsischen Wachstumspotential des verletzten Neurons und auf Maskierung der Inhibitoren der axonalen Erweiterung mit Myelin-Trümmer und die gliale Narbe 1 , 3 verbunden. Trotzdem bleibt die Fähigkeit, lange Axone zu entfernten Zielen zu regenerieren und geeignete funktionelle Synapsen zu bilden, nach wie vor stark eingeschränkt 4 , 5 , 6 , 7

In der vorliegenden Arbeit werden Mikroperlen, Pipettenmikromanipulation und mikrofluidische Vorrichtungen verwendet, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über lange Distanzen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass Poly-D-Lysin-beschichtete Perlen (PDL-Perlen) die Membranadhäsion induzieren, gefolgt von der Clusterbildung von synaptischen Vesikelkomplexen und der Bildung von funktionellen präsynaptischen Boutons 8 . Es wurde auch gezeigt, dass, wenn die PDL-Perle nach der präsynaptischen Differenzierung mechanisch weggezogen wird, der synaptische Proteincluster dem Wulst folgt und einen neuen Neuriten initiiert. Das folgende Verfahren nutzt diese Tatsache zusammen mit der Fähigkeit, embryonale hippocampale Neuronen von Ratten in organisierte Regionen auf einem Deckglas unter Verwendung von Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen zu kultivieren, um eine Neuronale genau umzuwickelnSchaltung.

Diese PDMS-Mikrofluidik-Geräte sind ungiftig, optisch transparent und bestehen aus zwei Kammern, die durch ein System von Mikrokanälen verbunden sind. Nach dem Zusammenbau auf einem Deckglas dient jede Vorrichtung als Form, um das neuronale Wachstum zu leiten und gesunde neuronale Kulturen auf präzisen Mustern für länger als 4 Wochen in vitro zu pflegen.

Hier wird ein Rahmen vorgestellt, in dem die Grenzen der Erweiterung und Funktionalität des neuen Neuriten untersucht werden sollen. Neue, funktionale Neuriten werden erstellt und positioniert, um die neuronalen Netzwerke kontrollierbar zu erneuern. Die erreichten Verlängerungsraten sind schneller als 20 μm / min über Millimeter-Skalen und funktionale Verbindungen hergestellt. Diese Ergebnisse zeigen, unerwartet, dass die intrinsische Kapazität dieser Neuriten für die Dehnung viel schneller ist als bisher angenommen. Dieser vorgeschlagene mechanische Ansatz umgibt langsame chemische Strategien und ermöglicht eine kontrollierte Verbindung zu einem bestimmten Ziel. ThIst die Technik eröffnet neue Wege für die in-vitro- Studie von neuartigen Therapien, um neuronale Konnektivität nach Verletzung wiederherzustellen. Es ermöglicht auch die Manipulation und Umverdrahtung von neuronalen Netzwerken, um grundlegende Aspekte der neuronalen Signalverarbeitung und der neuronalen Funktion in vitro zu untersuchen.

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Protokoll

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Alle nachfolgend beschriebenen Verfahren wurden vom Tierpflegeausschuss der McGill University genehmigt und entsprechen den Richtlinien des Canadian Council of Animal Care.

1. Standardisierung von neuronalen Kulturen mit mikrofluidischen Geräten: Gerätemontage

  1. Wählen Sie eine geeignete mikrofluidische Vorrichtung für das gewünschte Experiment aus. Um Neuronen in der gleichen Population zu verbinden, verwenden Sie die Neuro-Geräte (Abbildung 1 ) und verbinden Sie die Neuronen in verschiedenen Populationen mit den Co-Kultur-Geräten (Abbildung 6 ).
  2. Reinigen und vorbereiten die gewünschte Anzahl von sterilen Deckgläschen oder Glasbodenschalen. Für beste Ergebnisse auf Kunststoffoberflächen verwenden Sie 35 mm Geschirr, auf Glas verwenden Sie 25 mm Deckgläser oder 35 mm Glasbodenschalen. Wählen Sie die Glasdicke auf der Grundlage des Bildgebungssystems, z. B. 0,15 mm.
  3. Die Schalen oder Deckgläser mit 0,5-1 ml 100 μg / ml PDL für 2 h oder über Nacht bei Raumtemperatur auftragenAture
    Hinweis: Protokoll kann hier pausiert und am folgenden Tag wieder aufgenommen werden. Außerdem können Gerichte mit Borat-Puffer-verdünnter PDL, Poly-L-Lysin (PLL), Laminin oder einem anderen Zelladhäsionsmolekül beschichtet werden.
  4. Waschen Sie das Geschirr zweimal mit Wasser (verwenden Sie keine phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS), da Salzkristalle die Kanäle blockieren können), entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit und lassen Sie sie in einer sterilen Umgebung wie einem Biosicherheitsschrank für 5-10 Minuten oder bis zu trocknen Die Oberfläche ist völlig trocken.
    Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Deckgläser absolut trocken sind, da jede verbleibende Flüssigkeit die Einhaltung der mikrofluidischen Systeme beeinträchtigen wird.
  5. Legen Sie mikrofluidische Geräte mit Mustern nach oben unter UV-Licht in einer sterilen Umgebung (Biosicherheit Schrank) für 10 min. Achten Sie darauf, sterile Verfahren bei der Arbeit im Biosicherheitsschrank 10 zu folgen.
  6. Mit Pinzetten legen Sie eine mikrofluidische Gerät mit Muster nach unten in Kontakt mit dem sauberen DeckelIp / dish Benutzen Sie die Pinzette, um das Gerät sanft zu drücken, damit es an dem Glas haftet.
    Hinweis: Die Transparenz der angeklebten Region ist sichtbar, wenn man gegen das Licht schaut. Stellen Sie sicher, dass alle Ecken das Glas berühren. Tun Sie dies für alle mikrofluidischen Geräte. Siehe Abbildung 1a .
  7. Um das einzelne Populationsgerät mit Medium zu füllen, punktiere die Pipette auf die Kanäle und füge 50 μl vollständiges Zellmedium, ergänzt mit serumfreiem B-27 (Volumenverhältnis 1:50) und 500 μg / ml Penicillin / Streptomycin / Glutamin (zusammen Genannt NBM) in die rechte obere Vertiefung, und füge dann weitere 50 μl zu der gut diagonal liegenden Wanne hinzu. Tun Sie dies für alle Geräte, um sicherzustellen, dass das Medium zwischen Brunnen fließt. Als nächstes werden 50 μl Medium zu den restlichen 2 Vertiefungen gegeben. Siehe Abbildung 2a .
    1. Um das Mehrfach-Populationsgerät mit Medium zu füllen, punkte die Pipette auf die Kanäle und füge 30 μl hinzuDer vollständigen NBM zu den rechten Brunnen, siehe Abbildung 6a . Tun Sie dies für alle Geräte, um sicherzustellen, dass das Medium zwischen Brunnen fließt. Als nächstes werden 50 μl Medium zu den restlichen 4 Vertiefungen gegeben.
  8. Legen Sie die Geräte in eine größere Platte mit einer offenen Schale mit autoklaviertem Wasser (Nasskammer) und legen Sie in den Inkubator (37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit) für 1-2 h bei der Herstellung der Zellkultur. Siehe Abbildung 2b .

2. Überzug Neuronen in mikrofluidischen Systemen

  1. Nach dem in Ref. 8 , erhalten dissoziierte hippocampale oder kortikale Neuronen von Sprague Dawley Rattenembryonen (entweder Geschlecht).
  2. Wiederholen embryonale Neuronen in NBM in einer Konzentration von 1-2 Millionen Neuronen / ml. Überprüfen Sie die Zellkonzentrationen im Mikroskop mit einem Hämocytometer und nach Referenz 8 . Stellen Sie die Zellkonzentration einG auf die gewünschte Zelldichte. Um die Chancen zu erhöhen, einzelne Hippocampus-Axone pro Kanal zu erhalten, schicke man 10.000 Neuronen pro Gerät. Um mehrere Axone im selben Kanal zu haben, tafel 60.000 Neuronen pro Gerät.
    Anmerkung: Diese Zahlen variieren je nach dem verwendeten neuronalen Typ.
  3. Entfernen Sie das Medium von den mikrofluidischen Geräten, ohne die Brunnen zu entleeren. Lassen Sie ca. 5 μl in jedem.
  4. Um Zellen in der einzelnen Populationsvorrichtung zu trennen, füge 50 & mgr; l NBM zu der unteren rechten Vertiefung hinzu. An diesem Punkt fließt das Medium von selbst, um den anderen unteren Brunnen zu füllen. Füge 20 μl der Konzentratzelllösung in die obere rechte Vertiefung der mikrofluidischen Vorrichtung ein, wie in Abbildung 1b angegeben.
    1. Um Zellen in der Mehrfachbevölkerungsvorrichtung zu trennen, fügen Sie 20 & mgr; l der Konzentratzelllösung in jede der rechten Vertiefungen in 6a hinzu.
  5. Überprüfen Sie das Mikroskop, wenn ZellenBefinden sich in den Kammern und legen die Geräte 15-30 min in den Inkubator, um die Zellbefestigung auf dem Substrat zu fördern.
  6. Überprüfen Sie das Mikroskop, wenn genügend Zellen in den Kammern vorhanden sind. Wenn mehr erforderlich sind, wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5.
  7. Füge 50 μl NBM zu den 2 Top-Vertiefungen der einzelnen Populations-Apparatur und 20 & mgr; l NBM in dieselbe hinzu, wie die Zellen in die Mehrfach-Populations-Vorrichtung injiziert wurden. Die Medien ragen leicht aus, um einen positiven Meniskus zu bilden, der den Brunnen einen Muffin-Top-Aspekt verleiht. Wieder siehe Abbildung 2a .
  8. Halten Sie die Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit.

3. Erhaltung der neuronalen Kulturen

  1. NBM (ca. 30 μl mit einer Pipette) aus den Zellen entfernen und am Tag nach der Einführung in die Geräte eine neue vorgewärmte NBM auftragen (das ist 1 d nach Schritt 2).
  2. Überprüfen Sie alle 2 Tage, wenn genügend Medium in jedem Kanal vorhanden ist. Wenn das Muffin tOp ist niedrig nur noch mehr Mittel zu den Top-Brunnen hinzufügen.
  3. Kulturzellen für mindestens 7 d vor dem Entfernen der mikrofluidischen Geräte. Die Zellen können in diesen Geräten für mehrere Wochen überleben. Entfernen Sie die Geräte 1-2 Tage, bevor die Versuche an Proben durchgeführt werden.

4. Entfernung von mikrofluidischen Geräten

  1. 1 - 2 d vor dem Entfernen von mikrofluidischen Geräten, fügen Sie 2 mL NBM vorgewärmt auf 37 ° C zu jeder Probe Schale, Überschwemmung der Kammern, und pflegen die Geräte in den Inkubator.
  2. Verwenden Sie sterile Pinzette und eine Spitze, um die mikrofluidischen Geräte aus den Deckgläsern zu entfernen und eine gemusterte Konfiguration von Neuronen zu hinterlassen. Benutze die Spitze, um das Deckglas an Ort und Stelle zu halten, und die Pinzette, um die Kante des Geräts an der unteren linken Ecke des Brunnens zu verschließen. Wenden Sie die Torsion sorgfältig an und heben Sie das Gerät mit der Pinzette an, damit es das Deckglas abzieht. Siehe Abbildung 2c - 2d .
  3. Alle 2-3 Tage, ersetzen Sie haWenn die NBM bis zur Probe für Experimente verwendet wird.
  4. Bevor Sie Umverdrahtungsversuche an der Probe durchführen, stellen Sie sicher, dass Neuriten in den einzelnen Populationsgerätskanälen und den neuronalen Populationen in der Mehrfachbevölkerungsvorrichtung isoliert werden, indem die Lücken zwischen ihnen im Mikroskop untersucht werden, um sicherzustellen, dass keine Filamente vorhanden sind, die neuronale Populationen verbinden.

5. Vorbereitung von PDL-beschichteten Perlen

  1. Füge 2 x 50 & mgr; l Tropfen von 4, 10 oder 20 & mgr; m Polystyrolkugeln hinzu, die in Wasser (1: 500) verdünnt wurden, zu 1 ml PDL (100 & mgr; g / ml). Lassen Sie mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
    Hinweis: Protokoll kann hier pausiert und am nächsten Tag wieder aufgenommen werden.
  2. Die Lösung bei 8.820 xg für 1 min zentrifugieren Den Überstand vorsichtig entfernen, ohne die an der Unterseite des Behälters angesammelten Perlen zu stören.
  3. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml steriler 10 mM HEPES pH 8.4 Lösung.
  4. Resuspendieren der PDL-beschichteten Perlen in 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4Lösung.

6. Vorbereitung von Mikropipetten

  1. Pipetten aus Glas-Kapillarrohren (1 mm Innendurchmesser, 1,5 mm Außendurchmesser) mit einem horizontalen Elektrodenabzieher vorbereiten. Stellen Sie die Einstellungen so ein, dass die äußere Spitze der gezogenen Mikropipette ~ 2-5 μm beträgt. Vor dem Ziehen sicherstellen, dass die Glasrohre sauber sind.
  2. Fixieren Sie Pipetten auf Glasrutschen für die Lagerung und stellen Sie sicher, dass die Spitze nicht die Oberfläche der Folie berührt, da die Spitze zerbrechlich ist. Bei Raumtemperatur in einem überdachten Behälter aufbewahren, um vor Staub zu schützen. Verwenden Sie Pipetten am selben Tag, an dem sie gezogen werden.

7. PDL-Wulst Adhäsion an Neuronen

  1. Fügen Sie 40-60 μl PDL-beschichtete Perlen in Schritt 5 zu einer in Schritt 4 hergestellten Zellkultur hinzu. Zentrieren Sie die Pipettenspitze über die Neuronen, die auf dem Deckglas schwach sichtbar sind, und fügen Sie die Perlen hinzu (siehe Abbildung 3 ).
  2. Bringt die Probe 1 Stunde lang in den Inkubator zurück, um die Bildung von sy zu fördernNaptische Kontakte 8 , 9 .
  3. Nach der Inkubation entfernen Sie alle nicht aufgeklebten Perlen, indem Sie die Kultur vorsichtig mit vorgewärmtem NBM waschen.

8. Vorbereitung der physiologischen Kochsalzlösung (für Raumtemperaturversuche)

  1. Vorbereitung der physiologischen Kochsalzlösung durch Kombination der in den Literaturstellen 7 , 8 aufgeführten Zutaten. Dies soll die Zellumgebung außerhalb des Inkubators regeln.
  2. Überprüfen Sie die Osmolarität und den pH-Wert, wie in den Literaturstellen 7 , 8 angegeben.
  3. Kontinuierlich Lösung mit O 2 , um pH-Schwankungen bei der Durchführung von Experimenten zu minimieren.
  4. Auf Raumtemperatur erhitzen
  5. Stellen Sie das Perfusionssystem ein, indem Sie ein Ende eines Plastikschlauches (optionale Abmessungen) in O 2 einfließende physiologische Lösung einsetzen und die andere eNd zu einer Nadel, die in den Probenhalter eingefügt ist. Stellen Sie den Schlauch und die Lösung höher als die Probe (siehe Abbildung 4 ).
    1. Trennen Sie den Schlauch von der Nadel und verbinden Sie ihn mit einer Spritze. Verwenden Sie die Spritze, um Druck auszuüben und Flüssigkeit zu füllen, füllen Sie den Schlauch. Mit einer Rollenklemme abdichten und die Nadel wieder anschließen.

9. Perlenmikromanipulation

  1. Setzen Sie die Probe in eine Versuchsanordnung ein, so dass die Zellen von oben durch zwei Mikromipipetten, die in Mikromanipulatoren montiert sind, zugegriffen und optisch unterhalb, beispielsweise mit dem 40X-Phasenobjektiv (numerische Apertur von 0,6) eines invertierten optischen Mikroskops, zugegriffen werden können. In dieser Konfiguration montieren Sie eine CCD-Kamera für die Bildaufnahme am Seitenanschluss des Mikroskops. Verbinden Sie jede Pipette mit 1 ml Spritzen über Plastikschläuche. Bei diesem Schritt ersetzen Sie NBM mit physiologischer Kochsalzlösung (1-2 ml) (siehe Abbildung 4 ).
  2. Während der experiKontinuierlich perfuse Zellen mit der in Schritt 8 hergestellten physiologischen Kochsalzlösung mit einer Geschwindigkeit von 0,5-1 mL / min.
  3. Wähle einen PDL-Bead, der NICHT an ein Neuron im Sichtfeld angehängt ist. Richten Sie den Wulst mit einer Mikropipettenspitze aus, indem Sie auf die Perle auf die Mikropipette fokussieren. Bringen Sie die Spitze so nah wie möglich an die Perle, indem Sie sie durch das Mikroskop überwachen.
  4. Unterdruck mit der 1-ml-Spritze auftragen, die mit der Pipette verbunden ist, um den Wulst aufzunehmen. Unterdruck während des gesamten Experiments beibehalten.

10. Ziehen von Neuriten

  1. Wählen Sie eine PDL-Perle, die an einem Neuron im Sichtfeld befestigt ist, und befestigen Sie es mit der Sekunde, wie in den Schritten 9.3-9.4 beschrieben, an die zweite Mikropipette.
  2. Ziehen Sie den PDL-Wulst-Neuron-Komplex langsam (~ 0,5 μm / min), indem Sie entweder den Mikromanipulator oder die Probenstufe um 1 μm bewegen und für 5 min anhalten, um die Neuritinitiierung zu ermöglichen.
  3. Wiederholen Sie Schritt 10.2 zweimal.
    Hinweis: Die ersten 3 &# 181; m müssen sehr langsam gezogen werden, um den experimentellen Erfolg zu garantieren, der über 95% der Zeit auftritt.
  4. Ziehen Sie den PDL-Wulst-Neuron-Komplex langsam (~ 0,5 μm / min), indem Sie entweder den Mikromanipulator oder die Probenstufe um 2 μm bewegen und für 5 min anhalten, um eine Neuritendehnung zu ermöglichen.
  5. Nach erfolgreicher Initiation und Neuritenverlängerung für die ersten 5 μm ziehen Sie den Neuriten mit 20 μm / min über Millimeter-Skalen zurück.
    Hinweis: Das Ziehen kann kontinuierlich oder in Schritten und mit unterschiedlichen Raten durchgeführt werden. Siehe Abbildung 5b -5c .

11. Neuronen verbinden

  1. Wählen Sie eine Region, die reich an Neuriten ist, und senken Sie den PDL-Wulst-Neuriten-Komplex, so dass es physisch Kontakte hat. Verwenden Sie andere Perlen, um die Spitze Höhe über Deckglasoberfläche zu messen. Siehe Abbildung 5d .
  2. Verlassen Sie den PDL-Wulst-Neurit-Komplex in Kontakt mit dem Ziel-Neuriten bei der Manipulation der zweiten MikropiPette Senken Sie die zweite Pipette mit dem zweiten PDL-Wulst auf den neu gebildeten Neuriten um ca. 20 μm aus der ersten Perle. Benutze den zweiten PDL-Wulst, um den neuen Neuritenfaden auf die Zielzelle zu drücken.
  3. Halten Sie beide Perlen mindestens 1 Stunde an Ort und Stelle. Überprüfen Sie die Abwesenheit der fokalen Schwellung, eine Verdickung der Neuriten, die mit dem Wulst in Berührung kommen, mit dem Mikroskop 16 .
  4. Während dieser Zeit, verwenden Sie Perfusion, um langsam das Medium der Probe von physiologischen Kochsalzlösung zu vorgewärmten, CO 2 -equilibrierten NBM zu ändern.
  5. Lösen Sie die Perle aus der zweiten Pipette, indem Sie die Saugwalze lösen. Wenn der neue Neurit anhängt, lassen Sie auch die erste Perle los. Siehe Abbildung 5e .
  6. Entfernen Sie vorsichtig Salzlösung und ersetzen Sie sie durch NBM (~ 2 ml).
  7. Setzen Sie die Probe vorsichtig wieder in den Inkubator, um die neuronale Verbindung für zukünftige Experimente zu verstärken. Diese Verbindung ist stabil für> 24 h 7

12. Überprüfen der Funktionalität der neuen Verbindung über ganzzellige gepaarte Patch-Clamp-Aufnahmen

  1. Verweise beachten 7 , 18 , 19 . Um eine elektrophysiologische Einrichtung zusammenzustellen.
  2. Verweise beachten 7 . Um die vor- und postsynaptischen Elektroden vorzubereiten.
  3. Sammle Patch-Clamp-Daten, wieder nach den Referenzen 18 , 19 .
  4. Vergleichen Sie die Ergebnisse mit den natürlich vorkommenden Signalen 7 , um den Verbindungstyp zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Embryonale Ratten-Hippocampus-Neuronen werden in mikrofluidischen Vorrichtungen kultiviert, um eine präzise Positionierung von Zellen, PDL-Kügelchen und Mikromanipulatoren zu ermöglichen. Der erste Schritt besteht darin, die mikrofluidische Vorrichtung auf einem Glasdeckel oder einer Schale richtig zusammenzubauen. Es ist wesentlich, dass die mikrofluidische Vorrichtung gut an dem Substrat befestigt ist, um zu vermeiden, dass Zellen aus den Kammern austreten und sich unter den Teilen der...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unter Verwendung von Standardmikromanipulation und innovativen mikrofluidischen Geräten wurde eine neue Technik entwickelt, um schnell neue funktionelle neuronale Schaltkreise über große Entfernungen zu initiieren, zu verlängern und präzise zu verbinden. Pipettenmikromanipulation ist ein allgemeines Werkzeug in den meisten Neurowissenschaften Labors 4 , 13 . Die eigentliche Herausforderung für die Erreichung reproduzierbarer und zuverlässiger Ergebnisse war die ...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Autor Margaret H Magdesian ist der CEO von Ananda Devices, der Instrumente produziert, die in diesem Artikel verwendet werden.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Yoichi Miyahara für viele hilfreiche Diskussionen und Einsichten. MA und PG bestätigen die Finanzierung von NSERC.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Co-KulturgeräteAnanda DevicesKommerziell erhältlich bei http://www.anandadevices.com
Neuro DevicesAnanda DevicesKommerziell erhältlich bei http://www.anandadevices.com
Nr. 1 Glasdeckglas 25 mm RundWarner Instruments64-0705
35 mm Glasbodenschalen #0, unbeschichtet, gammabestrahltMatTex IncorporationP35G-0-20-C
35-mm-Zellkulturschale, nicht pyrogen, sterilCorning Inc430165
95 mm x 15 mm Petrischale, verschiebbarer Deckel, steriles PolystyrolFisherbrandFB0875714G
50 mL Zentrifugenröhrchen mit aufgedruckten Graduierungen und flachen KappenVWR89039-656
15 mL konisches Polypropylen-Röhrchen, 17 x 120 mm Bauform, nicht pyrogen, sterilFalcon
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049Extrazelluläre Lösung
B-27 Supplement (50X), serumfreiesB-27 Supplement (50X), serumfreies17504044extrazelluläre Lösung
Pennicilin, Streptomyocin, GlutaminThermo Fisher Scientsp;11995-065Extrazelluläre Lösung
200 μmu; L PipettenVWR89079-458
2 - 20 μ L PipettiererAerosolbeständige Spitzen2149P
BD Falcon 3mL Transferpipetten [unsteril]BD Falcon357524
GlucoseGibco15023-021Extrazelluläre Lösung
HEPESSigma7365-45-9Extrazelluläre Lösung/Beads
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Extrazelluläre Lösung
KClSigma-Aldrich7447-40-7Extrazelluläre Lösung
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Extrazelluläre Lösung
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Extrazelluläre Lösung
#5 Dumont Dumostar Pinzette 11 cmWorld Precision Instruments500233
PräparierwerkzeugeBraun, Aesculap
Poly-D-Lysin-HydrobromidSigma-AldrichP6407
Mikropartikel auf Basis von Polystyrol, 10 μ mSigma-Aldrich72986
BorosilikatrohreKing Precision Glass, Inc.14696-2
Horizontaler PipettenabzieherSutter InstrumentsBrown-Flaming P-97
Mikromanipulatoren, PCS-5000 SerieSD InstrumentsMC7600R
1 mL SpritzeBD Luer-Lok309628
Inverses MikroskopOlympus IX71
ObjektivOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
CCD KameraPhotometrieKaskade II: 512
Leibovitz's (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Rattendissektion
Typsin-EDTA (0,05%), PhenolrotLife Technologies25300054Rattendissektion
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4,5 g/L D-Glucose, + L-Glutamin, + 110 mg/L Natriumpyruvat]Life Technologies11995-065Rattendissektion
HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calciumchlorid, - Magnesiumchlorid, - Magnesiumsulfat]Life Technologies14170-112Rattendissektion
352097

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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