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Methodenartikel

Dissektion und Kultur der Maus Embryonale Niere

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DOI:

10.3791/55715

⸱

17. Mai 2017

 , 
1Department of Neuroscience, Uppsala University, 2Department of Organismal Biology, Evolutionary Biology Center, Uppsala University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von metanephrischen Rudimente aus Mäuseembryonen.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine Methode für die Sektion, Isolierung und Kultur der Maus metanephrischen Rudimente zu beschreiben.

Während der Säugetier-Nieren-Entwicklung, die beiden Vorläufer-Gewebe, die ureterische Knospe und das metanephrische Mesenchym, kommunizieren und wechselseitig zelluläre Mechanismen induzieren, um schließlich das Sammelsystem und die Nephrone der Niere zu bilden. Da Säugetier-Embryonen intrauterin wachsen und daher für den Beobachter unzugänglich sind, wurde eine Orgelkultur entwickelt. Mit dieser Methode ist es möglich, epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen und zelluläres Verhalten während der Nierenorganogenese zu untersuchen. Darüber hinaus kann der Ursprung von angeborenen Nieren- und Urogenitaltrakt-Fehlbildungen untersucht werden. Nach sorgfältiger Dissektion werden die metanephrischen Rudimente auf einen Filter übertragen, der auf Kulturmedium schwimmt und in einem Zellkulturinkubator für mehrere Tage gehalten werden kann. Allerdings muss man sich bewusst sein, dass die Bedingungen sindKünstlich und könnte den Stoffwechsel im Gewebe beeinflussen. Auch konnte das Eindringen von Testsubstanzen aufgrund der extrazellulären Matrix und der im Explantat vorhandenen Basalmembran begrenzt werden.

Ein wesentlicher Vorteil der Orgelkultur ist, dass der Experimentator direkten Zugang zum Orgel haben kann. Diese Technologie ist billig, einfach und erlaubt eine Vielzahl von Modifikationen, wie die Zugabe von biologisch aktiven Substanzen, die Untersuchung von genetischen Varianten und die Anwendung fortschrittlicher bildgebender Verfahren.

Einleitung

Die Säugetierniere stammt von zwei primordialen Strukturen mesodermalen Ursprungs ab: der röhrenförmigen epithelialen Harnleiterknospe und dem metanephrischen Mesenchym. Während der Nephrogenese dringt die Harnleiterknospe in das metanephrische Mesenchym ein und verzweigt sich, um das Sammelsystem zu bilden. Aus dem metanephrischen Mesenchym entstehen die epithelialen Elemente der Nephrone. Diese Prozesse laufen zeitlich und räumlich abgestimmt ab und werden durch reziproke induktive Mechanismen in Gang gesetzt. Beide Gewebekomponenten kommunizieren und beeinflussen die Zellmorphogenese des jeweils anderen.

In den 1920er Jahren war es Boyden, der die in vivo Obstruktion des Ductus mesonephricus bei Hühnern durchführte und damit den ersten Hinweis auf induktive Wechselwirkungen lieferte, da getrennte nephrische Blasteme nicht differenzieren konnten1. Etwa zur gleichen Zeit wurden die ersten erfolgreichen Versuche veröffentlicht, nephrische Rudimente von Hühnern in einem hängenden Tropfen zu kultivieren. Anschließend wurde die Organkultur entwickelt, um Gewebeinteraktionen bei der Organogenese von Säugetieren zu untersuchen. In den 1950er Jahren entwickelte Grobstein eine Technik, mit der metanephrische Rudimente auf einem Filter kultiviert werden konnten. Diese Technik wurde von Saxén modifiziert, indem er den Filter auf einem Trowell-artigen Sieb in einer Kulturschale platzierte1. Im Laufe der Jahre sind viele Modifikationen und Anwendungen für die Organkultur entstanden. Die hier beschriebene Methode basiert auf der Saxén-Technik, ist aber vereinfacht, da die Filter frei auf dem Medium schwimmen und der Durchmesser der Kulturvertiefung den Durchmesser des Filters nur geringfügig übersteigt, wodurch unerwünschte Bewegungen des Filters begrenzt werden.

Ganzorgankultur ist ein klassisches, billiges und einfaches, aber leistungsfähiges Werkzeug, um zelluläre Prozesse und interzelluläre Kommunikation während der Organogenese zu untersuchen. Die Organkultur ermöglicht die Behandlung mit biologischen Wirkstoffen wie Wachstumsfaktoren, Antikörpern, Antisense-Oligonukleotiden, Viren und Peptiden sowie mit pharmazeutischen Verbindungen und anderen Chemikalien. Die Genfunktion kann auch unter Verwendung von Explantaten untersucht werden, die von genetisch veränderten Mäusen stammen, oder unter Verwendung einer induzierbaren Geninaktivierungstechnologie, wie z. B. dem Cre-loxP-System. Dies ermöglicht die Untersuchung genetischer Mutationen, die vor der Entwicklung der Niere eine embryonale Letalität verursachen. Organkulturen können auch mit Fluoreszenzmarkierungen für die Rückverfolgung von Genfunktionen oder Abstammungslinien und modernen bildgebenden Verfahren kombiniert werden, die eine Echtzeitüberwachung des Zellverhaltens ermöglichen2.

In dem hier bereitgestellten speziellen Beispiel wurde die Wirkung des EphrinB2-aktivierten Eph-Rezeptor-Signalwegs auf die Verzweigungsmorphologie der Harnleiterknospe untersucht. Die Morphologie der EphA4/EphB2-Doppel-Knockout-Mäuse deutete auf mehrere schwere Defekte in der Nierenentwicklung hin, die bereits am embryonalen Tag 11 (E11) nachweisbar waren und die Harnleiterknospe, den Harnleiter und den Ductus nephricus communis betrafen3. Die Signalübertragung über Eph-Rezeptoren erfordert die Clusterbildung des Liganden-Rezeptors dimer4. Um den Eph-Signalweg zu überaktivieren, wurden die Nierenrudimente von E11.5-Mausembryonen in Gegenwart von geclustertem rekombinantem EphrinB2-Fc kultiviert. EphrinB2 ist ein bekannter Ligand für den EphA4-Rezeptor, der in den Harnleiterknospen tips3 exprimiert wird.

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Protokoll

Die Mäuse wurden nach den schwedischen Vorschriften und den Rechtsvorschriften der Europäischen Union (2010/63 / EU) aufrechterhalten. Alle Verfahren wurden nach den Richtlinien des schwedischen Ethikausschusses durchgeführt (Genehmigungen C79 / 9, C248 / 11 und C135 / 14). Die Verfahren an der Universität Heidelberg mit Tierfächern wurden vom Regierungspräsidium Karlsruhe und den Tierschutzbeauftragten an der Universität Heidelberg genehmigt.

1. Vorbereitung von Reagenzien und Materialien für Kultur

HINWEIS: Verwenden Sie eine laminare Strömungshaube, um die Kontamination zu minimieren.

  1. Am Tag der Sezierung wurde das menschliche Fc allein oder rekombinantes chimäres Ephrinprotein, das mit menschlichem Fc fusioniert ist, durch Mischen mit anti-humanen Fc-Ziegen-Antikörpern in einem Molverhältnis von 1: 5 in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt. 1 Stunde bei 37 ° C inkubieren 5 .
  2. Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient ergänzenMischung F-12 (DMEM / F12) mit 1% Penicillin / Streptomycin (v / v), 1% Glutamin (v / v), 1% Insulin-Transferrin-Selen (v / v), 50 μg / ml menschliches Holo- Transferrin und 1,5 μg / ml Amphotericin.
    HINWEIS: 10 ml Medium reicht für 16 Embryonen aus.
  3. Fügen Sie gruppierte rekombinante Ephrinlösung in einer Endkonzentration von 20 μg / ml zum Kulturmedium hinzu. Verwenden Sie Clustered Human Fc als Kontrolle.
  4. Bereiten Sie Kulturplatten vor, indem Sie 500 & mgr; l Kulturmedium zu jeder Vertiefung einer sterilen, unbeschichteten, flachen Boden-Polystyrol-4-Well-Platte hinzufügen.
  5. Mit sterilen Pinzetten sorgfältig einen Polycarbonat-Membranfilter mit einer Porengröße von 5 μm pro Well auf das Medium legen. Übertragen Sie die vorbereitete Platte in den Inkubator (37 ° C / 5% CO 2 ). Stellen Sie sicher, dass der Filter auf der Oberseite trocken bleibt und schwimmt.
    HINWEIS: Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus.
  6. Mit einer Rasierklinge schneiden Sie ca. 30 Pipettenspitzen (Volumen: 100 μl) approximatelY 1 mm von der Spitze, um zu einer breiteren Öffnung zu führen. Legen Sie die Spitzen wieder in ein Pipetten-Tip-Rack.

2. Dissektion von metanephrischen Rudimente bei E11.5

  1. Opfer eine zeitlich-schwangere Maus bei E11.5 durch zervikale Versetzung (oder mit einer Methode, die von der lokalen Ethik-Ausschuss genehmigt).
  2. Entfernen Sie den Uterus und die Embryonen, wie von Brown et al. 6 beschrieben. Von diesem Punkt aus, arbeiten Sie unter einem Sektionsmikroskop.
  3. Mit der Nr. 5 Uhrmacherzange, schneide den Embryo direkt unter die Vorderbeine. Verwenden Sie für jeden Embryo eine frische Petrischale. Entfernen Sie die Beine und den Schwanz des Embryos. Um dies zu tun, greifen Sie das Gewebe mit einem Paar von Nr. 5 Uhrmacher Pinzette entfernt werden und verwenden Sie die Spitzen eines zweiten Paares zu schneiden.
  4. Um die ventrale Organmasse zu entfernen, benutze die Spitzen einer Pinzette, um die Körperwand des Embryos in einer rostral-to-caudalen Richtung zu öffnen.
    1. Schnitt oberflächlich, parallel zu tEr dorsale aorta Verwenden Sie die Blut-gefüllte und daher sichtbare dorsale Aorta zur Orientierung. Sorgfältig trennen Sie den ventralen Teil der Körperwand von der dorsalen Teil mit den Spitzen der geschlossenen Pinzette und drehen Sie den Embryo über. Schneiden Sie die Körperwand seitlich in einer rostralen bis kaudalen Richtung und verwenden Sie die dorsale Aorta zur Orientierung, wie für die vorherige Seite.
  5. Sobald die ventrale Körperwand vom dorsalen Körper getrennt ist, packt sie mit einer Pinzette und zieht sie sorgfältig zusammen, um sie zusammen mit der Orgelmasse zu entfernen.
    HINWEIS: Die metanephrischen Anlagen bleiben gewöhnlich an der dorsalen Körperwand befestigt. Sie sind ovale, 200 μm lange Strukturen, die sich auf der Höhe der Hinterbeine befinden.
  6. Halten Sie die dorsale Körperwand mit einer Pinzette, mit der ventralen Seite nach oben. Mit dem anderen Paar Pinzette, greifen die dorsale Aorta an seinem rostralen Ende und sorgfältig schälen die dorsale Aorta aus der dorsalen Körperwand.
    ANMERKUNG: Beide metanephrischen Nieren bleiben in der Regel angebrachtAuf die dorsale aorta
  7. Mit einem Paar Pinzette, schneiden rostral auf die Niere anlagen, um die Aorta zu entfernen. Dann trennen Sie sorgfältig die beiden Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette.
  8. Vorsichtig vor unerwünschtes Gewebe aus der Niere anlagen mit den Spitzen der Pinzette abziehen. Achten Sie darauf, das Mesenchym nicht zu beschädigen, da Schäden zu einem schlechten Wachstum und Ausschluss des Explantats aus einer weiteren Analyse führen können.
  9. Übertragen Sie die Niere anlagen separat mit einer Mikroliterpipette und einer weit geöffneten Pipettenspitze in 10 μl PBS zum Polycarbonat-Membranfilter in einer 4-Well-Platte.
    HINWEIS: Durch die Oberflächenspannung wird das Explantat mit einer dünnen Schicht von Medium bedeckt. Ein Filter reicht für zwei Nierenanlagen aus.
    1. Legen Sie jedes der beiden Nieren-Anlagen in die Mitte jeder jeweiligen Hälfte des Filters. Übertragen Sie die Platte wieder auf den Inkubator bei 37 ° C / 5% CO 2 . Verlasse den Teller im Inkubator bis zum metanephrischen RudIments aus dem nächsten Embryo sind bereit, auf den Filter gelegt zu werden.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.9.1 für jeden Embryo.
    ANMERKUNG: Bei einigen Übungen dauert das Dissektionsverfahren etwa 5 min pro Embryo.
  11. Inkubation der Niere anlagen für 3 Tage bei 37 ° C / 5% CO 2 .

3. Vorbereitung der Reagenzien zur Fixierung und Färbung

  1. Zur Herstellung von 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS ohne Calcium und Magnesium (w / v), löst man die PFA bei 60 ° C in PBS, kontinuierlich rühren. Auf Raumtemperatur abkühlen und mit einem Papierfilter die restlichen Partikel entfernen. Aliquot und bei 4 ° C zur sofortigen Anwendung aufbewahren oder zur Langzeitlagerung einfrieren.
    ACHTUNG: PFA ist giftig. Tragen Sie die persönliche Schutzausrüstung, die in den örtlichen Sicherheitsnormen angegeben ist, und arbeiten Sie in einer Abzugshaube. Verwerfung von Abfällen nach institutionellen Richtlinien und Verwendung von Abfallbehältern.
  2. Zur Vorbereitung der Permeabilisierungslösung verdünnen Sie Triton X-100In PBS ohne Kalzium und Magnesium bis 0,3% (v / v).
  3. Zur Herstellung der Blockierungslösung 5% (v / v) Ziegenserum und 0,1% Triton X-100 zu PBS ohne Calcium und Magnesium zugeben. Füge Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. Bei 4 ° C aufbewahren.
    ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Behandeln Sie Natriumazid gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen.
    HINWEIS: Bei der Verwendung von Antikörpern für die Färbung, verwenden Sie 5% Serum aus der Spezies der sekundäre Antikörper wurde abgeleitet, um Sperrlösung zu machen.
  4. Verdünnen Sie biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin 1: 200 in Blockierungslösung. Verdünnen Sie Alexa488-konjugiertes Streptavidin 1: 200 in Blockierungslösung.
  5. Zur Herstellung von gebrauchsfertigem Einbettungsmedium (siehe Tabelle der Materialien) werden 0,1 g wasserlösliches Polyvinylalkohol-basiertes Mukoadhäsiv / ml bis 25% (w / v) Glycerin in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) . Unter ständigem Rühren für 1 h auf 50 ° C erhitzen, abkühlen lassen und den pH-Wert auf 8,0-8,5 einstellenM NaOH. Vermeiden Sie höhere NaOH-Konzentrationen. Füge 100 μg / ml N-Propylgallat und Thimerosal zu einer Endkonzentration von 0,02% (w / v) hinzu. 30 min bei Raumtemperatur umrühren.
    ACHTUNG: Thimerosal ist giftig. Behandeln Sie es gemäß den örtlichen Sicherheits- und Umweltschutzbestimmungen.
    1. Füllen Sie das Einbettungsmedium in 50 ml Röhrchen, balancieren Sie den Rotor und zentrifugieren Sie bei 3.200 xg und Raumtemperatur für 10 min. Die klare Lösung in 15 ml Röhrchen dekantieren und das Pellet entsorgen. Aliquot und bei -20 ° C für mehrere Wochen aufbewahren. Einmal aufgetaut, halten Sie die Lösung bei 4 ° C. Warm bis ~ 30 ° C sofort vor Gebrauch.
  6. Bereiten Sie so viele Glasrutschen vor, wie Filter mit Explantaten montiert werden sollen. Dazu kleben Sie zwei kleine Deckgläser, 18 x 18 mm, auf beiden Seiten des Glasschiebers mit Instant-Klebstoff, lassen Sie einen Durchmesser von 15 mm für den Filter dazwischen.

4. Fixierung und Färbung

  1. Nach einer Kultivierungszeit von 3Tage in vitro (div), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator und sorgfältig aspirieren das Kulturmedium aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette. Achten Sie darauf, den Filter nicht zu berühren und halten Sie die Spitze in Richtung der Wand des Brunnens.
  2. Fügen Sie 500 μl 4% PFA / PBS zu jeder Vertiefung hinzu. Die Filter schweben auf dem Fixiermittel. Verwenden Sie eine Mikropipette, fügen Sie vorsichtig das PFA-Fixiermittel hinzu, um die Filter zu tauchen. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min.
    HINWEIS: Für alle folgenden Schritte ist darauf zu achten, dass die Explantate nicht aus dem Filter abgewaschen werden. Halten Sie das Öffnen der Pipettenspitze zur Wand des Brunnens.
  3. Entfernen Sie die PFA und spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS, tauchen Sie den Filter ein. Füge 500 μl Permeabilisierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere bei Raumtemperatur für 1 h.
  4. Spülen Sie zweimal mit 500 & mgr; l PBS und fügen Sie 500 & mgr; l Blockierungslösung zu jeder Vertiefung hinzu. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h.
  5. Ersetzen Sie die Sperrlösung durch250 μl biotinyliertes Dolichorus biflorus Agglutinin verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubieren bei 4 ° C für 24 h.
  6. Die Dolichorus biflorus Agglutininlösung entfernen und zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung ausspülen.
  7. Füge 250 μl Alexa488-konjugiertes Streptavidin hinzu, verdünnt 1: 200 in Blockierungslösung und inkubiere bei 4 ° C für 24 h. Alternativ bei Raumtemperatur für 2 h inkubieren.
    HINWEIS: Ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis wird erreicht, wenn es bei 4 ° C inkubiert wird.
  8. Spülen Sie zweimal mit 500 μl PBS pro Vertiefung. Mit Pinzette, die Filter auf die vorbereiteten Glasrutschen übertragen, mit den Explantaten nach oben. Montage mit ~ 50-100 μl Einbettmedium. Deckel mit 60 mm langen Nr. 1,5 Deckgläschen. Man läßt die Einbettmediumlösung 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln erstarren. Gehen Sie zum Abbilden oder lagern Sie die Folien, in Folie verpackt, bei 4 ° C bis zum Bild.
  9. Bild mit einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop 7 </ Sup> gekoppelt an eine Hg-Lampe und verwenden eine Spiegeleinheit für die blaue Anregung (Anregungsbandpass, 460 - 495 nm, dichromatischer Spiegel, 505 nm und Emissionsbandpass, 510 - 550 nm) und 20X Plan-Apochromat-Linsen, 0,75 numerisch Öffnung.

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Ergebnisse

Metanephrische Nierenanlagen wurden von schwangeren Black-6-Inzuchtmäusen bei E11.5 abgeleitet und wurden kultiviert. Nach 3 Tagen hatte sich die Harnröhre bis zu 5 Mal verzweigt, was zu einer Verzweigung der anfänglich T-förmigen Harnröhre führte. Jedes Explantat wurde fotografiert, und die Anzahl der Segmente und Endpunkte wurde quantifiziert, um die Verzweigungsgenerationen zu bestimmen und die Anzahl der Endpunkte pro Zweig zu berechnen (Abbildung 1 ). Die Erzeugung ...

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Diskussion

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode, um das sich entwickelnde metanephrische Anlagen aus dem Maus-Embryo zu isolieren und die Orgel-Rudimente zu kultivieren. Diese Methode ist eine Standardtechnik, wie sie von Grobstein 8 und Saxén 9 , 10 entwickelt wurde und von vielen anderen 11 , 12 angepasst und modifiziert wurde. Der Erfolg der Methode hängt hauptsächlich von der Dauer ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Leif Oxburgh und Derek Adams für ihre Kenntnisse, Leif Oxburgh für die hilfreichen Kommentare zum Manuskript und Stefan Wölfl und Ulrike Müller für ihre technische Unterstützung und Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer und Viola Mayer für die Hilfe in der Labor. Diese Arbeit wurde von der Entwicklung, der Gesellschaft der Biologen (nach CP) unterstützt .

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific21331020
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140148
GlutaMAX SupplementThermo FisherScientific 35050061
Calcium,Magnesium Thermo Fisher Scientific14040117Verwendung zur Dissektion
Holo-Transferrin humanSigma-AldrichT0665
Insulin-Transferrin-Selen (ITS-G) (100x)Thermo Fisher Scientific41400045
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
Amphotericin B-LösungSigma-AldrichA2942
Triton X-100Sigma-AldrichX100
NatriumazidSigma-AldrichS8032
ThiomersalSigma-AldrichT5125
PropylgallatSigma-Aldrich2370
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381
GlycerinSigma-AldrichG5516
Biotinyliertes Dolichorus biflorus AgglutininVector LaboratoriesB-1035
Alexa488 konjugiertes StreptavidinJackson Immuno Research016-540-084
Rekombinantes Maus-Ephrin-B2 Fc-Chimären-Protein, CFR& D Systems496-EB
Rekombinantes humanes IgG1 Fc, CFR& D Systems110-HG-100
Ziege Anti-Human-IgG Fc AntikörperR& T D SystemsG-102-C
Phosphatgepufferte KochsalztablettenSigma-AldrichP4417zur Fixierung und Immunfärbung
Dumont #5, biologie
Spitzen, INOX, 11 cm		agnthos.se0208-5-PS2 Paar Pinzetten werden benötigt
Irisschere, gerade, 12 cmagnthos.se03-320-120
Verbandzange,
gerade, zart, 13 cm		agnthos.se08-032-130
Petrischalen Nunclo Delta behandeltThermo Fisher Scientific150679
TMTP01300 Isoporen-Membranfilter, Polycarbonat, hydrophil, 5.0 & Mikro; m, 13 mm, weiß, blankMerckMilliporeTMTP01300
Nunclon Multidish
4 Vertiefungen, flacher Boden		Sigma-AldrichD6789-1CS
Mikroskop-Deckglas 24 x 50 mm dick. Nr.1.5H 0.17+/-0.005 mmnordicbiolabs107222
Deckgläser Nr.1.5, 18 mm x 18 mmnordicbiolabs102032
Objektträger ~76 x 26 x 1, 1/2-w. geschliffen glattnordicbiolabs1030418
VWR RasierklingenVWR55411-055
50 mL ZentrifugenröhrchenSigma-AldrichCLS430828
15 mL ZentrifugenröhrchenSigma-AldrichCLS430055
Whatman vorgefaltetes qualitatives Filterpapier, Güteklasse 113V, kreppiertesSigma-AldrichWHA1213125
Festtisch-ForschungsmikroskopOlympusBX61WI
Schwarz 6 Inzuchtmäuse, männlich, C57BL/6NTacTaconicB6-M
Schwarz 6 Inzuchtmäuse, weiblich, C57BL/6NTacTaconicB6-F
Greenough StereomikroskopLeicaLeica S6 E
DPBS,

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Metanephrische RudimenteVerzweigung der UreterknospeOrgankultursystemEmbryonaltag 115Polycarbonat-MembranfilterZellkulturinkubatorImmunfluoreszenzfärbungkonfokale MikroskopieNierenorganogenese
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