Neuartige Objekt Anerkennung Test zur Untersuchung von lernen und Gedächtnis bei Mäusen

Summary

Die Objekt-Anerkennung-Test (ORT) ist eine einfache und effiziente Assays für die Bewertung von lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Die Methodik wird nachfolgend beschrieben.

Abstract

Die Objekt-Anerkennung-Test (ORT) ist ein häufig verwendete behavioral Assay für die Untersuchung verschiedener Aspekte von lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Der ORT ist ziemlich einfach und kann über 3 Tage abgeschlossen werden: Gewöhnung Day, Training Day und Testtag. Während des Trainings darf die Maus 2 identische Objekte zu erkunden. Am Testtag ist eines der Schulungsobjekte mit einem neuartigen Objekt ersetzt. Da Mäuse eine angeborene Vorliebe für die Neuheit, haben wenn die Maus das bekannte Objekt erkennt, verbringen sie die meiste Zeit auf das neue Objekt. Aufgrund dieser angeborene Vorliebe gibt es keine Notwendigkeit für positive oder negative Verstärkung oder lange Trainingspläne. Darüber hinaus kann der ORT auch für zahlreiche Anwendungen geändert werden. Die Aufbewahrung Intervall kann verkürzt um Kurzzeitgedächtnis zu untersuchen, oder Langzeitgedächtnis Sonde verlängert. Pharmakologische Intervention mehrmals vor dem Training, nach dem Training oder vor dem Rückruf einsetzbar bei verschiedene Phasen des Lernens (d.h., Erwerb, früh oder spät Konsolidierung oder Rückruf) zu untersuchen. Insgesamt, der ORT ist ein relativ niedrig-Stress, effiziente Test für Speicher in Mäusen und eignet sich für die Erkennung von neuropsychologischen Veränderungen nach pharmakologischen, biologischen oder genetischen Manipulationen.

Introduction

Das Objekt Anerkennung zu testen (ORT), auch bekannt als die neuartige Objekt Anerkennung Test (NOR), ist ein relativ schnelles und effizientes Mittel für verschiedene Testphasen von lernen und Gedächtnis bei Mäusen. Es wurde ursprünglich von Ennaceur und Delacour 1988 beschrieben und in erster Linie in Ratten¹; jedoch wurde es seitdem erfolgreich angepasst für den Einsatz in Mäusen^2,3,4,5,6,7. Der Test beruht auf so wenig wie drei Sitzungen: eine Gewöhnung Sitzung, eine Trainingseinheit und ein Test-Session. Training beinhaltet einfach visuelle Erforschung der zwei identische Objekte, während die Testsitzung beinhaltet eines der bereits erkundeten Objekte durch ein neues Objekt zu ersetzen. Weil Nagetiere eine angeborene Vorliebe für die Neuheit haben, verbringen ein Nagetier, das das bekannte Objekt erinnert sich mehr Zeit, erforschen die neuartige Objekt^7,8,9.

Der Hauptvorteil von dem ORT gegenüber anderen Nagetier Gedächtnis-Tests ist, dass es stützt sich auf Nagetiere natürliche Neigung zur Erkundung Neuheit⁸. Daher gibt es keine Notwendigkeit für zahlreiche Schulungen oder einer positiven oder negativen Verstärkung, Verhalten zu motivieren. Dies bedeutet, dass der ORT sehr viel weniger stressig, im Vergleich zu anderen Tests^{10,11,12,13,14,15}, und deutlich erfordert weniger Zeit in Anspruch als andere allgemein Speicher verwendete testet, wie Morris Wasser-Irrgarten oder Barnes Labyrinth, die bis zu einer Woche oder länger dauern kann. Daher ähneln die Bedingungen für den ORT genauer im Studium der menschlichen Kognition, Erhöhung der ökologische Validität des Tests über viele andere Nager Gedächtnis-Tests verwendet. In ähnlicher Weise da ORT eine einfache visuelle Erinnerung Aufgabe ist, wurde es erfolgreich für den Einsatz in zahlreichen Arten, einschließlich Menschen und nichtmenschlichen Primaten, um verschiedene Aspekte der Inter-Spezies des deklarativen Gedächtnisses ^{2,16 bewerten angepasst ,17}. Zu guter Letzt kann der ORT leicht geändert werden untersuchen verschiedene Phasen von lernen und Gedächtnis (d.h., Erfassung, Konsolidierung oder Rückruf), verschiedene Arten von Speicher (z.B. räumliche Gedächtnis) zu beurteilen, oder verschiedene Aufbewahrung bewerten Abständen (d.h. kurzfristigen Vs Langzeitgedächtnis).

Die Vielseitigkeit der ORT bietet eine Plattform für unzählige Anwendungen. Studien können pharmakologische Wirkstoffe zu stören oder zu verbessern Speicher verwenden. Variation der Zeit der Medikamentengabe vor oder nach dem Training oder vor dem Test kann Hinweis auf die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen gestört oder erweiterte Speicher^{6,18,19, 20}. in ähnlicher Weise kann optogenetische Technologie werden verwendet bei diesen gleichen verschiedenen Zeitpunkten der neuronalen Aktivierung/Hemmung betrachten, die zu den verschiedenen Phasen von lernen und Gedächtnis beiträgt. Der ORT eignet sich auch für die Beurteilung der Unterschiede bei transgenen Tieren, Läsion Studien oder Neurodegenerative Modelle oder Alterung Studien^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. die Zeit zwischen Training und Tests, bekannt als die Aufbewahrung Intervall kann geändert werden, um diese Änderungen auf kurz- und langfristige Speicher²⁶zu beurteilen. Letztlich den ORT eignet sich als ein Werkzeug, um pharmakologische, genetische und neurologische Veränderungen, lernen und Gedächtnis zu studieren, oder diese Tools können verwendet werden, um die Grundlagen von lernen und Gedächtnis in den ORT.

Protocol

alle Verfahren, die hier durchgeführt wurden vorgelegt und genehmigt von der Animal Care und Ausschuss zu verwenden und nach NIH Richtlinien durchgeführt wurden.

1. Objektauswahl und Versuchsaufbau

1. Objekte auswählen, die verschieden genug, um leicht durch Mäuse, diskriminiert zu werden, haben aber einen ähnlichen Grad an Komplexität (Textur, Form, Farbe, Musterung und Helligkeit, usw.) zur Minimierung möglicher induzierte Objekt-Einstellung, die die Ergebnisse beeinflussen kann (siehe Ennaceur 2010 für eine umfassende Darstellung der Objekt-Auswahl- ⁷).
   1. Test für angeborene Vorliebe und Diskriminierung (siehe Schritte 2 & 3).
   2. Verwenden von Objekten, die Maus-Größe oder nur geringfügig größer Exploration ( Abbildung 1) zu fördern. Um induzierte Präferenz zu reduzieren, sorgen dafür, dass Mäuse Klettern auf Objekte oder weder Objekt, obwohl Fähigkeit, auf ein Objekt zu klettern kann steigern das Interesse in der Exploration (Zeit verbrachte nur sitzen auf einem Objekt ist nicht Exploration Zeit angerechnet.)
   3. Müssen mindestens 2 Kopien der einzelnen Objekte. Um mögliche Geruch Hinweise während der Tests zu minimieren, müssen jedoch mindestens 3 jedes Objekt, Duplikate für Training und eine zum testen.
   4. Verwenden von Objekten aus bruchsicheren Material als Verlust eines Objekts soll während der Experimente beschädigen könnte stören die Kontinuität des Testens und möglicherweise verursachen Schäden oder Verletzungen des Tieres.
   5. Die Objekte gründlich zu reinigen, vor und zwischen den Einsatz (70 % Vol/Vol Ethanol ist angebracht).
2. Den Stress der hellen Beleuchtung zu minimieren, verwenden Sie diffuse, geringe Beleuchtung, mit dem Zentrum des Labyrinths beleuchtet rund 20 Lux. Verwenden Sie eine Temperatur und Feuchtigkeit ähnlich wie normale Wohnverhältnisse. Wenn Mäuse in ein anderes Zimmer für das Experiment von einem Gehäuse Raum verschoben werden, Mäuse zu ihrem neuen Zimmer für mindestens 1 h vor Gebrauch jeden Tag akklimatisieren.
3. Griff Mäuse gut vor dem Training. Da der Test stützt sich auf die natürliche Tendenz der Nagetiere zu erforschen Neuheit, reduzieren Sie Stress oder Angst aus handling, das stören mit ihrem Wunsch, die Arena und anschließend die Objekte zu erkunden. Im Idealfall behandeln Mäuse 1 - 2 mal / Tag für mindestens 1 min, 1 bis 2 Wochen vor der Prüfung ^{15 , 29}.
4. Für die Hauptarena verwenden eine quadratischen Kammer (ca. 40 x 40 cm x 40 cm) hergestellt aus weiß oder schwarz, porenfreien Kunststoff, im Gegensatz zu der Farbe der Maus. Alternativ verwenden Sie eine Runde Arena Hrsg. speziell, wenn Sie ängstlich Mäuse verwenden, die in den Ecken des quadratischen Arena sitzen kann, eine Runde Arena vorzuziehen, exploratives Verhalten ^{18 , 30} fördern.
   1. Am Trainingstag, Platz 2 identische Objekte auf der Diagonalen (d. h. eine in der NW-Ecke und eine in der SE Ecke). Wenn Objekte zu leicht sind und mit der Maus verschoben werden können, befestigen sie auf den Boden. Abnehmbare Kitt Montagearbeiten gut.
   2. Zum Testen Tag, verwenden die 3 ^rd-Kopie von jedem Objekt, ein vertrauter Gegenstand und ein neues Objekt auf dasselbe Diagonale als Trainingstag ( Abbildung 2).
   3. Gegengewicht die Verwendung der einzelnen Objekte, so dass jedes Objekt gleichermaßen als ein vertrauter Gegenstand sowie eine neuartige Objekt verwendet wird. Auch die Lage des neuen Objekts zu jeder der 4 Ecken der Arena ein Gegengewicht. Bitte beachten Sie die Diagonale für welches Tier verwendet wird, so dass die Diagonale verwendet auf den Trainingstag identisch mit dem auf den Testtag für jede Maus verwendet ist.
   4. Apparat und Objekte entfernen Geruch Signale vor und zwischen den Einsatz (70 % Vol/Vol Ethanol ist geeignet) gründlich reinigen.
5. Legen Sie die Kamera direkt über der Vorrichtung für optimale Sicht auf Erkundung. Verwenden Sie nur Software mit Nase-Erkennung für genaue Analyse. Wenn Sie Software verwenden, erfassen Sie ein Hintergrundbild mit den Objekten im Ort vor dem Start. In der Software, stellen Sie den Bereich der Exploration, ca. 2-3 cm um das Objekt herum sein.
6. Experimentator Störungen reduzieren, die Studie aufgenommen und später erzielen. Blind den Torschützen zu den experimentellen Bedingungen. Wenn manuell während des Experiments scoring, sicherstellen, dass der Experimentator mehr als 1 Meter von der Arena, und für die Maus nicht sichtbar ist.
   Hinweis: Die Maus jederzeit verbringt sitzen auf das Objekt ohne aktive Tasthaare fegen oder schnüffeln nicht als Exploration Zeit zählt.
7. Definieren Exploration wie bei der Maus ' s Lärm ist spitz auf das Objekt und innerhalb von 2-3 cm des Objekts, mit aktiven Tasthaare fegen oder schnüffeln. Zählen Sie nicht jederzeit auf das Objekt ohne Angabe der aktiven Erkundung sitzen.

2. Notwendigen Pilot Experimente

1. Testing für induzierte Vorliebe
   1. für Gewöhnung, entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie es in der Mitte der offenen Arena. Ermöglichen die Maus, um frei für 5 min. erkunden
   2. Am Trainingstag (T1), legen Sie 2 verschiedene Objekte in gegenüberliegenden Quadranten der Apparate, (d.h., NW und SE Ecken). Entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie es in der Mitte der offenen Arena. Ermöglichen freie Erkundung für 10 min.
   3. Der Diskriminierung-Index berechnen. Wenn es keine induzierte Präferenz gibt, sollte der Diskriminierung Index an oder nahe Null sein. Alle Objekte, die Präferenz sollte nicht verwendet werden, für die ORT.
2. Testing für Diskriminierung Fähigkeit
   1. für Gewöhnung, Maus aus seinem Hause Käfig entfernen und legen Sie sie in der Mitte der offenen Arena. Ermöglichen die Maus, um frei für 5 min. erkunden
   2. Auf Trainingseinheit (T1), legen Sie 2 identische Objekte in gegenüberliegenden Quadranten. Platzieren Sie den Mauszeiger in die Mitte der Arena und lassen Sie die Maus zu erkunden für 10 min.
   3. Auf Testing Session (T2), Platz eins des Objekts während T1 und ein neues Objekt in gegenüberliegenden Quadranten (NW und SE Ecken) verwendet. 60 min nach T1, platzieren Sie den Mauszeiger in die Mitte der Arena und erlauben freie Erkundung für 10 min.
   4. Der Diskriminierung-Index berechnen. In einem 60 min. Aufbewahrung Intervall sollte der Diskriminierung-Index über 0,25 werden.

3. Experimentelle Verfahren

1. Gewöhnung
   1. Entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie es in der Mitte der offenen, leeren Arena. Können Sie kostenlos Exploration der Arena für 5 Minuten. Sobald der Haus Käfig leer ist, speichern Sie sie für den Einsatz als Holding Käfig am nächsten Tag.
   2. Am Ende der 5 min, entfernen Sie die Maus, und legen Sie in einem Käfig halten. Die Maus nicht an seinem ursprünglichen Käfig zurück, oder dies kann Auswirkungen auf das Verhalten der übrigen Mäuse getestet werden.
   3. Reinigen Sie das Gerät zwischen Mäusen mit Ethanol 70 % Vol/Vol.
      Hinweis: Während der Gewöhnung, Angst-ähnliches Verhalten beurteilt werden kann durch die Berechnung der Zeit, in der Mitte (siehe Prut & Belzung 2003- ³¹). Dies ist eine nützliche Metrik, wenn man die Länge der Zeit für T1. Höhere Angst Mäuse erfordern eine 10 min-Sitzung, die minimale Exploration-Kriterium zu erreichen.
2. Training (T1)
   1. legen Sie zwei identische Objekte in gegenüberliegenden Quadranten der Arena (d.h., NE und SW Ecke).
   2. 24 h nach Gewöhnung, entfernen Sie die Maus aus seinem Hause Käfig und legen Sie sie in die Mitte der Arena, gleich weit entfernt von den 2 identische Objekte.
   3. Erlauben freie Erkundung für ein Minimum von 5 Minuten. Wenn einen Stamm von Mäusen, die bekanntermaßen geringen Bewegungsorgane oder Erkundung Aktivität haben (d.h., die meisten Mäuse nicht erreichen ein Minimum von 20 s Erforschung beider Objekte von 5 min, wie bereits in den Pilotprojekten oder der Literatur), verlängern die Testversion auf 10 min für alle mic e in der Kohorte.
   4. Am Ende des Versuches, entfernen Sie die Maus und legen Sie in den Käfig halten. Sobald der Haus Käfig leer ist, speichern Sie sie für den Einsatz als Holding-Käfig auf Tests Tag.
   5. Gründlich zu reinigen, die Geräte und Objekte zwischen Mäusen mit 70 % Vol/Vol Ethanol.
3. Testing (T2)
   1. platzieren Sie ein Objekt während T1 verwendet (d. h., die vertrauter Gegenstand) und ein neues Objekt in gegenüberliegenden Quadranten der Arena. Verwenden die gleichen Positionen wie verwendet während T1 für jede Maus.
   2. Bei T1, T2 Intervall wählen, Maus aus seinem Hause Käfig entfernen und legen Sie sie in die Arena Center, gleich weit entfernt von der vertraut und neuartige Objekt.
      Hinweis: In einem Intervall von 24 h Aufbewahrung die meisten Mäuse werden nicht in der Lage, zwischen dem bekannten und neuartigen Objekt zu unterscheiden (in der Regel -0,2 < d2 < 0,2, im Vergleich zu einer positiven Kontrolle ³²). Wenn für nootropische Effekte testen, verwenden Sie diesem Zeitpunkt zur Gedächtnisverbesserung zu untersuchen. Sonde für Gedächtnisstörungen, verwenden Sie ein kürzeres Intervall der Aufbewahrung von überall zwischen 20 min bis 4 h, abhängig von der Sorte der Maus.
   3. Erlauben freie Erkundung für 10 Minuten. Am Ende des Versuches, entfernen Sie die Maus und legen Sie in den Käfig halten.
4. Tor für T1 und T2, die erste 5 min. Die Maus erfüllt nicht die minimale Exploration-Zeit von 20 s für beide Objekte weiterhin erzielte vorbei an 5 min bis total Exploration überschreitet 20 s.

4. Analyse der Daten

1. Ausschlusskriterien
   1. während beide Training (T1) und Tests (T2), berechnen Sie die Summe Exploration Zeit für beide Objekte für jede Sitzung (e1 und e2). Die meisten Mäuse erreichen sollte eine minimale Exploration insgesamt für beide Objekte von 20 s durch 5 min.
   2. Verlängern T1 und T2 Zeit auf 10 min für Stämme von Mäusen, die nicht erfüllen dieses minimum Kriterium von 5 min, da während der Pilottests beobachtet und haben geringe Exploration.
   3. Verhalten der Gäste für 5 min oder über 5 min bis zum Erreichen der 20 s minimum Kriterium.
   4. Wenn Mäuse nicht Exploration für beide Objekte für T1 oder T2 10 min 20 s mindestens erreichen, von der Analyse, ausschließen, wie verbrachten sie genügend Zeit mit der Erforschung zu lernen/bestätigt werden kann.
2. Absolute Vs Relative Analyse
   Hinweis: verschiedene Formeln für die Analyse und ihre Beziehung zueinander in Tabelle 1 ersichtlich.
   1. Berechnen e1 als total Exploration Zeitpunkt während des Trainings für 2 identische Objekte, wo a1 und a2 die identische Objekte sind.
      e1 = a1 + a2
   2. Calculate e2 als total Exploration Zeit während der Tests für das bekannte Objekt (a) und der Roman (b Objekt).
      e2 = a + b
   3. Calculate d1 so einfach Zeit verbrachte erkunden den Roman Objekt minus Zeit verbrachte vertrauten Gegenstand zu erkunden. Die absolute Diskriminierung Maßnahme (d1) berücksichtigt nicht Unterschiede in der Exploration Zeit zwischen Mäusen oder Behandlung Gruppen, obwohl es unter bestimmten Umständen ein empfindlicher Maßnahme ² sein kann.
      d1 = b-a
   4. Berechnen d2 als verbrachte Zeit erkunden das neue Objekt minus der Zeit verbringen die vertraute Objekt geteilt durch Zeit total Exploration. Das am häufigsten verwendete Maß ist ein relative Diskriminierung Wert oft als Diskriminierung Index (d2), die nicht durch Unterschiede in der Exploration Zeit beeinflusst wird. Somit fallen alle Werte zwischen-1 und + 1.
      d2 = d1/e2
   5. Berechnen oder die Anerkennung oder Präferenz Index (d3) ³. Dies ist die Zeit, das neue Objekt geteilt durch die gesamte Zeit zu erforschen. Dies bedeutet, dass alle Werte zwischen 0 und 1 liegen werden. Es ist oft mit 100 multipliziert und als Prozentwert.
      d3 = b/e2 * 100
3. Statistische Analyse
   1. über die mittlere Diskriminierung Werte für jede Gruppe Speicherleistung mit One-Way ANOVA bestimmen. Zur weiteren Analyse machen zwei-Wege-post Hoc Vergleiche mit den behandelten Vs Fahrzeugzustand und positiven/negativen Kontrollgruppen.

Results

Ein allgemeiner Versuchsaufbau für den ORT ist in Abbildung 2dargestellt. Auf Gewöhnung Tag (T0) Mäuse liegen in der leeren Arena für 5 min. 24 Stunden später, Mäuse sind zurück in die Kammer mit 2 identische Objekte platziert und erlaubt, frei für bis zu 10 min (T1) zu erkunden. Auf Tests Tag (T2), sind die Mäuse wieder platziert in der Arena, aber mit einem vertraut und eine neuartige Objekt, und erlaubt für bis zu 10 Minuten zu erkunden. Die Aufbewahrung I...

Discussion

Der ORT ist eine effiziente und flexible Methode für lernen und Gedächtnis bei Mäusen zu studieren. Bei der Einrichtung eines Experiments ist es wichtig, eine Reihe von Variablen zu berücksichtigen, die das Ergebnis beeinflussen können. Die Belastung der Maus wirkt wie in die repräsentativen Ergebnisse diskutiert, beide Exploration Zeit und Retention-Intervall. Eine Abnahme der Exploration Zeit möglicherweise verzerren oder Maske führt zu einer absoluten Diskriminierung Analyse^2,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open Field	Box Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	Erhältlich in grau, weiß oder schwarz
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Verhaltensverfolgungssystem
EthoVisionXT 12	Noldus		Verhaltensverfolgungssystem; erfordert 3-Punkt-Verfolgung
Videokamera	Jede		Videokamera sollte direkt über dem Gerät montiert werden
70% Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Vor Beginn der Tests und zwischen den Versuchen sollte jedes Objekt sorgfältig gereinigt werden. Der Boden und die Wände des Gerätes sollten ebenfalls gereinigt werden.