Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.

Zusammenfassung

In dieser Studie verwendeten wir periphere Blutzellen (PBCs) als Samenzellen, um Chondrozyten über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in einer integrationsfreien Methode zu erzeugen. Nach der Embryoidkörperbildung (EB) und der fibroblastischen Zellexpansion werden die iPSCs für die chondrogene Differenzierung für 21 Tage unter serumfreien und xenofreien Bedingungen induziert. Nach der Chondrozyteninduktion werden die Phänotypen der Zellen durch morphologische, immunhistochemische und biochemische Analysen sowie durch die quantitative Echtzeit-PCR-Untersuchung von chondrogenen Differenzierungsmarkern ausgewertet. Die chondrogenen Pellets zeigen eine positive alcianblaue und toluidinblaue Färbung. Auch die Immunhistochemie der Kollagen II und X Färbung ist positiv. Der sulfatierte Glycosaminoglycan (sGAG) -Gehalt und die chondrogenen Differenzierungsmarker COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 und AGGRECAN sind in chond signifikant hochreguliertRogene Pellets im Vergleich zu hiPSCs und fibroblastischen Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PBCs als Samenzellen verwendet werden können, um iPSCs für die Knorpelreparatur zu erzeugen, die patientenspezifisch und kostengünstig ist.

Einleitung

Knorpelgewebe hat eine sehr schlechte Fähigkeit zur Selbstreparatur und Regeneration. Verschiedene chirurgische Eingriffe und biologische Behandlungen werden verwendet, um Knorpel und Gelenkfunktion wiederherzustellen, mit unbefriedigenden Ergebnissen. Die jüngste Entwicklung der Stammzellentechnologie kann das gesamte Knorpelreparaturfeld verändern ¹ . Verschiedene Stammzellen wurden als Samenzellen untersucht, aber menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) scheinen die vielversprechendste Wahl zu sein, da sie viele Arten von patientenspezifischen Zellen liefern können, ohne Ablehnungsreaktionen zu verursachen ² . Darüber hinaus können sie die begrenzte proliferative Natur der erwachsenen Zellen überwinden und ihre Selbsterneuerung und pluripotenten Fähigkeiten beibehalten. Darüber hinaus kann Gen-Targeting verwendet werden, um den Genotyp zu ändern, um spezifische Arten von Chondrozyten zu erhalten.

Fibroblasten wurden weithin verwendet, um iPSCs zu erzeugen, weil ihre Umprogrammierungspotentiale auch gut untersucht wurden.Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die überwunden werden müssen, wie die schmerzhafte Biopsie von Patienten und die Notwendigkeit für die in vitro Expansion der Fibroblasten, die zu Genmutationen führen können ³ . Kürzlich wurden PBCs als vorteilhaft für die Umprogrammierung von ^{4 gefunden} ; Darüber hinaus wurden sie häufig genutzt und reichlich gelagert. Es ist möglich, dass sie den Studienfokus von der Haut umleiten können. Allerdings gibt es nach unserem besten Wissen nur wenige Berichte über die PBC-Neuprogrammierung, gefolgt von der Differenzierung in Chondrozyten.

In der aktuellen Studie nutzen wir PBCs als alternative Quelle, indem wir sie in iPSCs umprogrammieren und dann die iPSCs in die chondrogene Linie durch ein Pelletkultursystem differenzieren, um die Chondrozytenbildung zu imitieren.

Protokoll

Das Protokoll zur Erzeugung von hiPSCs aus PBCs findet sich in unserer vorherigen Studie ⁵ . Die Studie wurde von der Institutional Review Board unserer Institution genehmigt.

1. Embryoidkörper (EB) Bildung

1. Machen Sie 50 ml hiPSC-Medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 15% Knockout Serumersatz (KSR), 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L Glutamin und 8 ng / ml basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF).
2. Machen Sie 50 ml EB-Formationsmedium: DMEM, ergänzt mit 15% KSR, 5% FBS, 1x nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin.
3. Machen Sie 50 ml Basalkulturmedium: DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin.
4. 10 ml Disposelösung, 1 mg / ml im Knockout DMEM vorbereiten.
5. KultusRe hiPSCs auf 60-mm-Gewebekulturschalen mit Feeder-Zellen ( dh eine Monoschicht von bestrahlten embryonalen Fibroblasten-Zellen). Wenn die Zellen 80-90% konfluent sind, disassoziieren die Zellen mit Disposition und Passage der hiPSCs 1: 3 alle 4-5 Tage. Legen Sie die Zellen in einen 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator.
6. Die undifferenzierten hiPSC-Kolonien in kleinere Stücke (ca. 50-100 μm Durchmesser) mit einer feuergezogenen Glasnadel zerlegen, wenn die iPSCs 80-90% konfluent sind. Im Allgemeinen verwenden Sie hiPSC-Kolonien in einer 60-mm-Schale, um EBs in einer 100 mm Petrischale zu erzeugen.
   1. Kultur weniger als 100 kleine Stücke von Kolonien in einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale mit 10 ml EB-Formationsmedium. Legen Sie das Geschirr in einen 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator.
7. Ersetzen Sie etwa 25% des Ausgangsmediums mit einer gleichen Menge des Basalkulturmediums alle 2 Tage. Kippen Sie die Schale, damit sich die EBs absetzen können. Entfernen Sie vorsichtig 3 mlDes oberen Mediums und füge 4 ml frisches Basalkulturmedium hinzu. Störe die EBs nicht
   HINWEIS: Die EBs sind morphologisch durch die Kolonien charakterisiert und nehmen ein rundes Aussehen mit glatten Rändern unter dem Mikroskop auf.
8. Nach 10 Tagen Kultur in der nicht adhärenten Petrischale eine neue 100-mm-Gewebekulturschale mit 4 ml 0,1% iger Gelatine für 30 min bei 37 ° C vor Gebrauch einwickeln.
9. Übertragen Sie das Medium plus EBs von einer 100 mm, nicht adhärenten Petrischale zu einem 15-ml-Kegelrohr. Lassen Sie die EBs für 4-5 min sedimentieren. Aspirieren Sie den Überstand sorgfältig und lassen Sie weniger als 0,5 ml Medium plus EBs
10. Seed weniger als 100 EBs auf eine 100 mm, gelatinebeschichtete Gewebekulturschale mit 10 ml Basalkulturmedium. Legen Sie das Geschirr in einen 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator.

2. Zellpelletbildung und Chondrozytendifferenzierung

1. 10 ml 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugeben. Machen Sie 80 ml BasAl Kulturmedium: DMEM, ergänzt mit 20% FBS, 1x nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol und 2 mM L-Glutamin.
2. 10 mL Chondrogen-Differenzierungsmedium: DMEM (hohe Glukose), ergänzt mit 10% Insulin-Transferrin-Selen-Lösung (ITS), 0,1 μM Dexamethason, 1 mM Ascorbinsäure, 1% Natriumpyruvat und 10 ng / ml transformierenden Wachstumsfaktor- Beta 1 (TGF-β1).
3. Erfrischen Sie das Medium mit 10 ml Basalkulturmedium nach 48 h. Danach das Medium alle drei Tage mit 10 ml Basalkulturmedium auffrischen.
   ANMERKUNG: Nach 10 Tagen in der Kultur sollten sich die Fibroblastischen Zellwälder von den EBs erweitern.
   1. Die 100 mm-Schale mit 4 ml 0,1% iger Gelatine für 30 min bei 37 ° C vor Gebrauch beschichten. Den Zellüberstand verwerfen und die Zellen mit Dulbecco's Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (DPBS) einmal waschen.
   2. Die Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin / EDTA bei 37 ° C für 5 min verdauen und mit 4 m neutralisierenL des Basalkulturmediums.
4. Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren auf und ab 5-10 mal und durchlaufen sie durch ein 70 μm Nylon Mesh. Die Zellsuspension bei 200 xg für 5 min zentrifugieren. Die Zellen auf einer neuen 100 mm, mit Gelatine beschichteten Gewebekulturschale mit 10 ml Basalkulturmedium re-seed.
5. Erfrischen Sie das Medium mit 10 ml Basalkulturmedium nach 48 h. Danach das Medium alle drei Tage mit 10 ml Basalkulturmedium auffrischen.
   HINWEIS: Die Zellen erlangen eine homogene, fibroblastenartige Morphologie.
6. Wenn ~ 90-100% Konfluenz erreicht ist ( dh etwa 5-7 Tage), ernten Sie die Zellen mit 3 ml 0,25% Trypsin / EDTA bei 37 ° C für 5 min. Neutralisieren mit 4 ml Basalkulturmedium. Dissoziieren Sie die Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren auf und ab 5 mal. Verwenden Sie ein Hämocytometer, um die Zellzahl zu zählen.
   1. Legen Sie 3 x 10 ⁵ Zellen in ein 15 ml Polypropylenrohr. Zentrifuge bei 200 xgFür 5 min bei Raumtemperatur (RT). Die Zellen in 1 ml chondrogenem Differenzierungsmedium erneut suspendieren.
7. Die Zellen bei 300 xg für 3 min erneut zentrifugieren und die Zellen in einer kleinen Pelletform aufrechterhalten. Setzen Sie den Schlauch in den 37 ° C und 5% CO ₂ Inkubator für 21 Tage. Schrauben Sie den Deckel nicht fest und lassen Sie den Gasaustausch.
8. Ersetzen Sie 3/4 des Kulturmediums alle drei Tage durch frisches chondrogenes Differenzierungsmedium.
   ANMERKUNG: Nach 21 Tagen in Kultur sollten sich hiPSC-chondrogene Pellets (hiPSC-Chon) gebildet haben. Menschliche mesenchymale Stammzellen (MSCs) als Positivkontrolle werden auch im chondrogenen Differenzierungsmedium für 21 Tage gesammelt und kultiviert, um chondrogene Pellets (hMSC-Chon) zu bilden.

3. Analyse der chondrogenen Differenzierung

1. 10 ml 10% neutral-gepuffertes Formalin zubereiten.
2. Vorbereiten von 50 ml 0,1% alcianblauem Reagenz und 50 ml 1% Toluidinblau-Reagenz.
3. PrEpare 1 ml der primären Antikörper: Kaninchen polyklonale Antikörper gegen Kollagen II (1:50) oder Maus monoklonale Antikörper gegen Kollagen X (1:50). Auch Anti-Kaninchen oder Maus sekundäre Antikörper vorbereiten.
4. Machen Sie 1 ml Papain-Lösung: 10 U / ml in PBS mit 0,1 M Natriumacetat, 2,4 mM EDTA und 5 mM L-Cystein.
5. 100 ml Dimethylmethylenblau (DMMB) Farbstofflösung: 100 μl 16 mg / l 1,9-Dimethylmethylenblau, 40 mM Glycin, 40 mM NaCl und 9,5 mM HCl; PH 3,0
6. Beurteilen Sie die chondrogene Differenzierung durch alcianblaue und toluidinblaue Flecken der Pelletabschnitte.
   1. Fixieren Sie ein hiPSC-Chon-Pellet oder hMSC-Chon-Pellet in 1 ml 10% neutral-gepuffertem Formalin für 24 h.
   2. Übertragen Sie das Pellet auf 1 ml 70% iges Ethanol in H ₂ O. Dehydrieren Sie das Pellet mit 1 ml einer abgestuften Ethanolreihe ( dh 25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min).
   3. Klären Sie das Pellet in 1 ml 100% Xylol dreimal. InfiltratE das Pellet mit Paraffin für 1 h in einem 65 ° C Ofen. Einfügen des Pellets in Paraffinblöcke mit einer 7 x 7 x 5 mm ³ Grundform nach routinemäßigen histologischen Verfahren ⁶ .
   4. Mischen Sie angrenzende Abschnitte durch Mikrotom mit einer Dicke von ca. 4 μm ⁷ . Befestigen Sie die Abschnitte auf Glasrutschen.
   5. Trocknen Sie die Objektträger für 2 h bei 60 ° C in einem Ofen. Deparaffinieren Sie die Abschnitte in drei Zyklen (jeweils 3 min) mit 100% Xylol.
   6. Verwenden Sie eine abnehmende Alkoholreihe für die Rehydratisierung ( dh 100, 100, 95, 95, 70, 50 und 25% in H ₂ O, jeweils 3 min) und führen Sie dann mit abisoliertem Wasser 5 min ab.
   7. Färben Sie die Sektionen mit 0,1% alcianblauem Reagenz oder 1% Toluidin-Blau-Färbung für 4-5 h und spülen Sie sie dann mit destilliertem Wasser ab.
   8. Dehydrieren mit einer abgestuften Ethanolreihe ( dh 25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min), gefolgt von drei aufeinanderfolgenden stEps der Klärung in 100% Xylol. Montiere die Dias und visualisiere sie unter einem Mikroskop.
7. Führen Sie Immunhistochemie durch.
   HINWEIS: Zusätzliche Pelletabschnitte werden durch Immunhistochemie weiter beurteilt.
   1. Nach der Entparaffinierung und Rehydratisierung bringen Sie die Objektträger in 1 mM EDTA, pH 8,0 (wasserdicht in Wasser, das von Autoklaven gekocht wird) zum Kochen bringen. Lassen Sie sie für 8 min bei einer Unterkochtemperatur sitzen und lassen Sie dann die Objektträger bei RT abkühlen.
   2. Spülen Sie die Dias mit deionisiertem Wasser 3 mal. Inkubieren Sie die Abschnitte in 3% H ₂ O ₂ -Lösung in Methanol bei RT für 15 min, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren.
   3. Spülen Sie die Folien mit deionisiertem Wasser und tauchen Sie sie in DPBS für 5 min ein. 50-100 & mgr; l eines entsprechend verdünnten (1:50) primären Antikörpers auf die Abschnitte auf den Objektträgern auftragen und dann 1 h in einer befeuchteten Kammer bei RT inkubieren.
   4. Die Dias 3 mal (jeweils 5 min) mit DPBS waschen. Inkubiere die saMit den entsprechenden sekundären Antikörpern ( dh Anti-Kaninchen oder Maus) für 15 min bei RT.
   5. Die Dias 3 mal (für jeweils 5 min) mit DPBS waschen. DAB-Erkennung unter einem Mikroskop durchführen.
   6. Waschen Sie die Dias mit DPBS 3 mal (jeweils 2 min). Gegen die Zellkerne durch Eintauchen der Folien in Hämatoxylin für 1-2 min. Dehydrieren mit einer abgestuften Ethanolreihe (25, 50, 75, 90, 95, 100 und 100%, jeweils 3 min), gefolgt von drei aufeinanderfolgenden Schritten der Klärung mit Xylol. Schließlich montiere die Dias und visualisiere sie unter dem Mikroskop.
8. SGAG-Inhalt erkennen.
   1. Chondrogene Pellets in Papain-Lösung bei 60 ° C für 2 h ausbauen.
   2. Bestimmen Sie den DNA-Gehalt mit dem dsDNA-Assay-Kit und dem Fluorometersystem. Messen Sie den sGAG-Gehalt durch Mischen mit DMMB-Farbstofflösung unter Messabsorption bei 525 nm ⁸ .
   3. Berechnen Sie die Konzentration von sGAG gegen eine Standardkurve vonHai-Chondroitinsulfat.
9. Führen Sie die Echtzeit-PCR-Analyse der chondrogenen Differenzierungsmarker in hiPSC-Chon-Pellets durch.
   1. Ernte 3-4 der gleichen chondrogenen Pellets durch Zugabe von 500 μl eiskaltes Extraktionsreagenz zu einem Röhrchen. Vortex gründlich. Inkubieren Sie die Probe für 5 min bei RT.
   2. 0,1 ml Chloroform zugeben. Vortex die Probe für 15 s und inkubiere sie bei RT für 3 min. Die Probe für 15 min bei 12.000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Übertragen Sie die obere wässrige Phase (ca. 250 μl) in ein neues 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
   3. Füge 25 μl Natriumacetat und 1 μl Glykogen zur Probe hinzu. Fälligkeit der RNA durch Mischen mit 250 μl Isopropylalkohol. Gründlich mischen. Inkubieren Sie die Probe bei RT für 10 min.
   4. 10 min bei 12.000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand vollständig entfernen. Das RNA-Pellet zweimal mit 500 μl 75% igem Ethanol waschen.
   5. 5 min zentrifugierenBei 7.500 xg und 4 ° C. Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Ethanol und lüften Sie das RNA-Pellet für 5-10 min. Die RNA in 10 μl nukleasefreies Wasser auflösen.
   6. Umwandlung der RNA in cDNA unter Verwendung eines reversen Transkriptase-Systems. Betrachten Sie die cDNA-Proben in Echtzeit-PCR mit qPCR Kit Master Mix (2x) und einem Echtzeit-PCR-System ⁹ .
      HINWEIS: Die Primerfolgen sind:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Ergebnisse

Chondrogene Differenzierung von hiPSCs:

EB-Formationsmedium und Basalkulturmedium wurden verwendet, um die hiPSCs in die mesenchymale Linie zu differenzieren. Es wurde eine mehrstufige Kulturmethode verwendet ( Abbildung 1 ). Zuerst wurden die hiPSCs spontan über EB-Bildung für 10 Tage differenziert (D10, Abbildung 2A ). Zweitens stiegen die Zellen von den EBs für weiter...

Diskussion

Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung von Chondrozyten aus PBCs über iPSCs zur Verfügung. Weil PBCs häufiger und weit verbreitet im klinischen Bereich sind, werden sie als eine mögliche Alternative zur Umprogrammierung dargestellt. In dieser Studie wurden episomale Vektoren (EV) verwendet, um PBCs in iPSCs zu programmieren, nachdem die Methode von Zhang et al. ¹¹ Dieser integrationsfreie Ansatz beinhaltet nicht die Integration der virusassoziierten Genotoxizität, von der angenom...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Knockout DMEM	Invitrogen	10829018	Basalmedium für die hiPSC-Kultur und EB-Bildungsmedium
Knockout Serum Replacement (KSR)	Invitrogen	10828028	Ein definierteres, FBS-freies Medium, das für die hiPSC-Kultur und das EB-Bildungsmedium verwendet
wird Fötales Rinderserum (FBS)	Hyclone	sh30070.03	Wird für hiPS-Kultur und EB-Bildungsmedium verwendet und bietet ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis für die Zelle. Kultur
Nicht-essentielle Aminosäuren	Chemicon	TMS-001-C	Wird als Wachstumszusatz in allen Zellkulturmedien verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen
L-Glutamin	Invitrogen	TMS-002-C	Eine Aminosäure, die für die Zellkultur benötigt
wird Grundischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)	Peprotech	100-18B	Ein Zytokin, das zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz und Selbsterneuerung von hiPS-Zellen verwendet wird
Dispase	Invitrogen	17105041	Wird für die hiPSC-Dissoziation für die Subkultur
DMEM	Gibco	C11960	Basalmedium für MSC-Kulturmedium
verwendet 0,1 %	Gelatine Millipore	ES-006-B	Wird für die Zelladhäsion auf den Schalen verwendet
0,25 % Trypsin/EDTA	Gibco	25200072	Wird für die Zelldissoziation
verwendet DPBS	Gibco	14190250	Eine ausgewogene Salzlösung, die zur Zellwäsche oder zur Herstellung von
2-Mercaptoethanol-Invitrogen-21985023			verwendet wird als Wachstumszusatz in allen Zellkulturmedien verwendet wird.
ITS	Invitrogen	41400045	Insulin, Transferrin, Selenlösung. Wird zur chondrogenen Differenzierung verwendet.
Ascorbinsäure	Sigma	4403	Bekannt als Vitamin C. Es hilft bei aktivem Wachstum und hat antioxidative Eigenschaften.
Natriumpyruvat	Gibco	11360070	Zellkulturmedium als Energiequelle zusätzlich zu Glukose zugesetzt.
Transformierender Wachstumsfaktor-beta 1	Peprotech	AF-100-21C	Ein Zytokin, das die Zellproliferation, das Wachstum und die chondrogene Differenzierung reguliert.
Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen Kollagen II	Abcam	ab34712	Dieser Antikörper reagiert mit Typ-II-Kollagenen, die spezifisch für Knorpelgewebe sind.
Monoklonale Antikörper der Maus gegen Kollagen X	Abcam	ab49945	Dieser Antikörper reagiert mit Kollagen vom Typ X, das ein Produkt von hyperthrophischen Chondrotozyten ist.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Zum Einbetten und zur Langzeitlagerung von Objektträgern
Toluidinblau	Sigma	89640	Wird für den Nachweis von Proteoglykanen verwendet.
Alcianblau	Amresco	#0298	Wird zum Nachweis von Glucosaminoglykanen verwendet.
Papain	Sigma	P4762-25MG	Wird zur Verdauung von chondrogenen Pellets verwendet.
Dimethylmethylenblau	Sigma	341088-1G	Wird zur Quantifizierung von Glykosaminoglyanen
aus Haifischknorpel	verwendet Sigma	C4384-250MG	Wird verwendet, um die Standardkurve für die Messung des sGAG-Gehalts zu zeichnen.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851 (100)	Zur Bestimmung des DNA-Gehalts
TRIzol	Invitrogen	15596018	Zur RNA-Isolierung aus Zellen
Reverse Transkriptase-System	Promega	A3500	Zur Umwandlung von RNA in cDNA
SYBR FAST qPCR Kit Master Mix	Kapa	KK4601	Zur Bestimmung der Echtzeit-PCR