Wir präsentieren ein Protokoll zur Erzeugung einer chondrogenen Linie aus menschlichem peripherem Blut (PB) über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) unter Verwendung einer integrationsfreien Methode, die Embryoidkörperbildung (EB), Fibroblastische Zellenexpansion und chondrogene Induktion umfasst.
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Methodenartikel
Unterscheidung von Chondrozyten aus periphere Blut-abgeleiteten menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen
In diesem Artikel
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
In dieser Studie verwendeten wir periphere Blutzellen (PBCs) als Samenzellen, um Chondrozyten über induzierte pluripotenten Stammzellen (iPSCs) in einer integrationsfreien Methode zu erzeugen. Nach der Embryoidkörperbildung (EB) und der fibroblastischen Zellexpansion werden die iPSCs für die chondrogene Differenzierung für 21 Tage unter serumfreien und xenofreien Bedingungen induziert. Nach der Chondrozyteninduktion werden die Phänotypen der Zellen durch morphologische, immunhistochemische und biochemische Analysen sowie durch die quantitative Echtzeit-PCR-Untersuchung von chondrogenen Differenzierungsmarkern ausgewertet. Die chondrogenen Pellets zeigen eine positive alcianblaue und toluidinblaue Färbung. Auch die Immunhistochemie der Kollagen II und X Färbung ist positiv. Der sulfatierte Glycosaminoglycan (sGAG) -Gehalt und die chondrogenen Differenzierungsmarker COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 und AGGRECAN sind in chond signifikant hochreguliertRogene Pellets im Vergleich zu hiPSCs und fibroblastischen Zellen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PBCs als Samenzellen verwendet werden können, um iPSCs für die Knorpelreparatur zu erzeugen, die patientenspezifisch und kostengünstig ist.
Einleitung
Knorpelgewebe hat eine sehr schlechte Fähigkeit zur Selbstreparatur und Regeneration. Verschiedene chirurgische Eingriffe und biologische Behandlungen werden verwendet, um Knorpel und Gelenkfunktion wiederherzustellen, mit unbefriedigenden Ergebnissen. Die jüngste Entwicklung der Stammzellentechnologie kann das gesamte Knorpelreparaturfeld verändern 1 . Verschiedene Stammzellen wurden als Samenzellen untersucht, aber menschlich induzierte pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) scheinen die vielversprechendste Wahl zu sein, da sie viele Arten von patientenspezifischen Zellen liefern können, ohne Ablehnungsreaktionen zu verursachen
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Protokoll
Das Protokoll zur Erzeugung von hiPSCs aus PBCs findet sich in unserer vorherigen Studie 5 . Die Studie wurde von der Institutional Review Board unserer Institution genehmigt.
1. Embryoidkörper (EB) Bildung
- Machen Sie 50 ml hiPSC-Medium: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 15% Knockout Serumersatz (KSR), 5% fötalem Rinderserum (FBS), 1 × nicht essentielle Aminosäuren, 55 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L Glutamin und 8 ng / ml basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF).
- Machen Sie 50 ml EB-Formationsmedium: DMEM, ergänzt mit 15% KSR, 5% FBS, 1x nicht essentielle Amino....
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Ergebnisse
Chondrogene Differenzierung von hiPSCs:
EB-Formationsmedium und Basalkulturmedium wurden verwendet, um die hiPSCs in die mesenchymale Linie zu differenzieren. Es wurde eine mehrstufige Kulturmethode verwendet ( Abbildung 1 ). Zuerst wurden die hiPSCs spontan über EB-Bildung für 10 Tage differenziert (D10, Abbildung 2A ). Zweitens stiegen die Zellen von den EBs für weiter.......
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Diskussion
Hier stellen wir ein Protokoll zur Generierung von Chondrozyten aus PBCs über iPSCs zur Verfügung. Weil PBCs häufiger und weit verbreitet im klinischen Bereich sind, werden sie als eine mögliche Alternative zur Umprogrammierung dargestellt. In dieser Studie wurden episomale Vektoren (EV) verwendet, um PBCs in iPSCs zu programmieren, nachdem die Methode von Zhang et al. 11 Dieser integrationsfreie Ansatz beinhaltet nicht die Integration der virusassoziierten Genotoxizität, von der angenom.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Xiaobin Zhang für sein Plasmid. Wir danken auch Shaorong Gao und Qianfei Wang für ihre freundliche Hilfe während des Experiments. Diese Studie wird von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (Nr.81101346, 81271963, 81100331), dem Peking 215 High-Level-Talent-Projekt (Nr. 2014-3-025) und dem Peking Chao-Yang Hospital Fund (Nr CYXX-2017-01) und die Jugend-Innovationsförderungsvereinigung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (YL).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basalmedium für die hiPSC-Kultur und EB-Bildungsmedium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | Ein definierteres, FBS-freies Medium, das für die hiPSC-Kultur und das EB-Bildungsmedium verwendet |
| wird Fötales Rinderserum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Wird für hiPS-Kultur und EB-Bildungsmedium verwendet und bietet ein hervorragendes Preis-Leistungs-Verhältnis für die Zelle. Kultur |
| Nicht-essentielle Aminosäuren | Chemicon | TMS-001-C | Wird als Wachstumszusatz in allen Zellkulturmedien verwendet, um das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zu erhöhen |
| L-Glutamin | Invitrogen | TMS-002-C | Eine Aminosäure, die für die Zellkultur benötigt |
| wird Grundischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | Ein Zytokin, das zur Aufrechterhaltung der Pluripotenz und Selbsterneuerung von hiPS-Zellen verwendet wird |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Wird für die hiPSC-Dissoziation für die Subkultur |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basalmedium für MSC-Kulturmedium |
| verwendet 0,1 % | Gelatine Millipore | ES-006-B | Wird für die Zelladhäsion auf den Schalen verwendet |
| 0,25 % Trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Wird für die Zelldissoziation |
| verwendet DPBS | Gibco | 14190250 | Eine ausgewogene Salzlösung, die zur Zellwäsche oder zur Herstellung von |
| 2-Mercaptoethanol-Invitrogen-21985023 | verwendet wird als Wachstumszusatz in allen Zellkulturmedien verwendet wird. | ||
| ITS | Invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenlösung. Wird zur chondrogenen Differenzierung verwendet. |
| Ascorbinsäure | Sigma | 4403 | Bekannt als Vitamin C. Es hilft bei aktivem Wachstum und hat antioxidative Eigenschaften. |
| Natriumpyruvat | Gibco | 11360070 | Zellkulturmedium als Energiequelle zusätzlich zu Glukose zugesetzt. |
| Transformierender Wachstumsfaktor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | Ein Zytokin, das die Zellproliferation, das Wachstum und die chondrogene Differenzierung reguliert. |
| Polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen Kollagen II | Abcam | ab34712 | Dieser Antikörper reagiert mit Typ-II-Kollagenen, die spezifisch für Knorpelgewebe sind. |
| Monoklonale Antikörper der Maus gegen Kollagen X | Abcam | ab49945 | Dieser Antikörper reagiert mit Kollagen vom Typ X, das ein Produkt von hyperthrophischen Chondrotozyten ist. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | Zum Einbetten und zur Langzeitlagerung von Objektträgern |
| Toluidinblau | Sigma | 89640 | Wird für den Nachweis von Proteoglykanen verwendet. |
| Alcianblau | Amresco | #0298 | Wird zum Nachweis von Glucosaminoglykanen verwendet. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Wird zur Verdauung von chondrogenen Pellets verwendet. |
| Dimethylmethylenblau | Sigma | 341088-1G | Wird zur Quantifizierung von Glykosaminoglyanen |
| aus Haifischknorpel | verwendet Sigma | C4384-250MG | Wird verwendet, um die Standardkurve für die Messung des sGAG-Gehalts zu zeichnen. |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Zur Bestimmung des DNA-Gehalts |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Zur RNA-Isolierung aus Zellen |
| Reverse Transkriptase-System | Promega | A3500 | Zur Umwandlung von RNA in cDNA |
| SYBR FAST qPCR Kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Zur Bestimmung der Echtzeit-PCR |
Referenzen
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
An erratum was issued for: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.
The corresponding author was updated from:
Yueying Li
yueyinglee2010@hotmail.com
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu
waterkins@163.com
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University
