Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.
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Methodenartikel
Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Zellen können über Exosomen, ~ 100-nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die Proteine, Lipide und Nukleinsäuren enthalten, kommunizieren. Nicht adhärierende / mesenchymale Mamma-Epithelzellen (NAMEC) -gesteuerte extrazelluläre Vesikel können aus NAMEC-Medium durch differentielle Ultrazentrifugation isoliert werden. Basierend auf ihrer Dichte können EVs durch Ultrazentrifugation bei 110.000 x g gereinigt werden. Die EV-Präparation aus der Ultrazentrifugation kann unter Verwendung eines kontinuierlichen Dichtegradienten weiter getrennt werden, um eine Kontamination mit löslichen Proteinen zu verhindern. Die gereinigten EVs können dann mit Hilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse weiter ausgewertet werden, die die Größe und Anzahl der Vesikel in der Präparation misst. Die extrazellulären Vesikel mit einer Größe von 50 bis 150 nm sind Exosomen. Die NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen können von Mamma-Epithelzellen aufgenommen werden, die durch Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie gemessen werden können. Einige Mamma-Stammzellen-Eigenschaften ( z. B. Brustdrüsen-bildende Fähigkeit) könnenVon den Stamm-ähnlichen NAMECs zu den Mamma-Epithelzellen über die NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen übertragen werden. Isolierte primäre EpCAM hi / CD49f lo luminalen Mamma Epithelzellen können keine Mammadrüsen bilden, nachdem sie in Mausfettkissen transplantiert wurden, während EpCAM lo / CD49f hi basale Mammaepithelzellen nach der Transplantation Mamidrüsen bilden. Aufnahme von NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen durch EpCAM hi / CD49f lo luminalen Mamma-Epithelzellen ermöglicht es ihnen, Brustdrüsen zu erzeugen, nachdem sie in Fettpolster verpflanzt wurden. Die aus stammähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnenen EVs / Exosomen übertragen die Brustdrüsen-bildende Fähigkeit zu EpCAM hi / CD49f-luminalen Mamma-Epithelzellen.
Einleitung
Exosomen können die zelluläre Kommunikation durch Übertragung von Membran und zytosolischen Proteinen, Lipiden und RNAs zwischen den Zellen vermitteln. Es wurde gezeigt, dass die Exosomen-vermittelte Kommunikation in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert ist ( dh die Antigenpräsentation, die Entwicklung der Toleranz 2 und die Tumorprogression 3 ). Exosomen haben oft ähnliche Inhalte wie die Quellzellen, die sie freisetzen. So können die Exosomen spezifische Zelleigenschaften aus den Quellzellen tragen und diese Eigenschaften an die Zellen übertragen, die sie einnehmen 4
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Protokoll
Alle Forschungen, die Tiere betreffen, erfüllten Protokolle, die vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege genehmigt wurden.
1. Extrazelluläre Vesikel / Exosom Isolierung und Validierung
- Kultur-Mamma-Epithel-Basalzellen, NAMECs 4 , mit frischem, serumfreiem Medium aus 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 mit Natriumbicarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 & mgr; g / ml); Insulin (5 & mgr; g / ml); Rinder-Hypophysenextrakt (BPE, 35 μg / ml); Und GW627368X (1 μg / ml) in 15 cm Schalen.
- Nach dem Zählen der Zellen mit einem Hämocytometer, Saatgut 1,2 x 10 6 Z....
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Ergebnisse
Da sich gezeigt hat, dass die Blockierung der PGE 2 / EP 4- Signalisierung die EV / Exosomen-Freisetzung von mamma-basalartigen Stammzellen 4 auslöst, stellt diese Arbeit ein Verfahren zur Isolierung der induzierten EVs / Exosomen aus der Mamma-Epithel-Basalzellen (NAMEC) -Kultur dar. Da NAMECs im serumfreien Medium kultiviert werden, gibt es keine bereits vorhandenen EVs / Exosomen aus Serum 13 . Für Zellen, die in serumhaltigem M.......
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Diskussion
Exosomen tragen oft Eigenschaften der Zellen, die sie freisetzen, und die Menge der freigesetzten Exosomen kann durch Stimuli 4 induziert werden. Das Kulturmedium der Zellen kann gesammelt und einer differentiellen Ultrazentrifugation für die EV / Exosom-Sammlung unterzogen werden (Abbildung 1 ). Es gibt derzeit keine allgemeine Vereinbarung über eine ideale Methode, um EVs / Exosomen zu isolieren. Die hier verwendete optimale Methode wurde durch die nachgeschaltete .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute (05A1-CSPP16-014, HJL) und des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL) unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K Ultrazentrifuge | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60%ige (w/v) Lösung von Iodixanol in Wasser (steril). |
| CD81-Antikörper | GeneTex | GTX101766 | 1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 & Grad; C, über Nacht |
| CD9-Antikörper | GeneTex | GTX100912 | 1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 ° C, über Nacht |
| CD63-Antikörper | Abcam | Ab59479 | 1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 ° C, über Nacht |
| TSG101 Antikörper | GeneTex | GTX118736 | 1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 &/de; C, über Nacht |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 & Grad; C, über Nacht |
| CFSE (Carboxyfluorescein-Succinimidyldiacetatester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | Fluoreszenzzellanalysator | |
| Kollagenase Typ IV | Thermo | 17104019 | |
| Trypsin | Thermo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | ein Gemisch aus rekombinantem Humaninsulin, humanem Transferrin und Natriumselenit |
| accutase | ebioscience | 00-4555-56 | ein natürliches Enzymgemisch mit proteolytischer und kollagenolytischer Enzymaktivität |
| dispase | STAMMZELLE | 7913 | 5 mg/ml = 5 μl, |
| Anti-CD49f-Antikörper | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| Anti-EpCAM-Antikörper | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | Zellsortierer | |
| Karmin-Alaun | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| humane Brustepithelzellen (HMLE-Zellen, NAMECs) | Geschenke von Dr. Robert Weinberg | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Natriumbicarbonat | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hydrocoritison | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (Rinder-Hypophysen-Extrakt) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm Kulturschale | Falcon | ||
| Tischzentrifuge | Eppendrof | Zentrifuge 3415R | |
| Ultrazentrifugenröhrchen | Beckman | 344058 | |
| PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA-Protein-Assay | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmissionselektronenmikroskopie | Hitachi | HT7700 | |
| Gelatine | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm Kulturschale | Falcon | ||
| 6-Well-Kulturschale | Corning | 3516 | |
| weiblich C57BL/6 Mäuse | NLAC (National Laboratory Animal Center | ||
| ) | BioWest | S01520 | |
| Gentamycin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| Isofluoran | Halogenkohlenwasserstoff | NPC12164-002-25 | |
| Formaldehyd | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Ethanol) | J.T. Baker | 800605 | |
| Eisessig | Panreac | 131008.1611 | |
| Aluminiumkaliumsulfat | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Xylol | Leica | 3803665 | |
| 0,22 μm m Membranen | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wundclips, 9 mm | BD Biosciences | ||
| BD Biosciences | 427630 | ||
| CellMask™ Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C10046 | Plasmamembran-Färbung |
Referenzen
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
