Name: Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung extrazellulärer Vesikel und Exosomen aus mesenchymalen Mamma-Epithelzellen zur Übertragung von Stammzelleigenschaften auf luminalen Zellen. Diese Methode ermöglicht die direkte Reprogrammierung von Nicht-Stammzellen.

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Diese Arbeit wurde durch Stipendien der Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute (05A1-CSPP16-014, HJL) und des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL) unterstützt.

Alle Forschungen, die Tiere betreffen, erfüllten Protokolle, die vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege genehmigt wurden. 1. Extrazelluläre Vesikel / Exosom Isolierung und Validierung <ol><li> Kultur-Mamma-Epithel-Basalzellen, NAMECs 4 , mit frischem, serumfreiem Medium aus 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 mit Natriumbicarbonat (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 &amp; mgr; g / ml); Insulin (5 &amp; mgr; g / ml); Rinder-Hypophysenextrakt (BPE, 35 μg / ml); Und GW627368X (1 μg / ml) in 15 cm Schalen. </li><li> Nach dem Zählen der Zellen mit einem Hämocytometer, Saatgut 1,2 x 10 6 Zellen in 12 ml Medium pro 15-cm-Schale am Tag 0 für 4 Tage 4 . </li><li> Nach 4 Tagen in Kultur wird das Kulturmedium bei 300 xg für 5 min unter Verwendung einer Tischzentrifuge zentrifugiert. Übertragen Sie den Überstand auf ein konisches Rohr (Abbildung 1 ). </li><li> Zentrifugieren Sie den ÜberstandBei 2.000 xg für 20 min in einer Tischzentrifuge. Übertragen Sie den Überstand in ein Ultrazentrifugenröhrchen und lassen Sie die toten Zellen und Zelltrümmer (Abbildung 1 ). </li><li> Zentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Ultrazentrifugenröhrchen (Abbildung 1 ). </li><li> Zentrifugieren Sie den Überstand bei 110.000 xg für 60 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und das EV / Exosom-Pellet in PBS resuspendieren (Abbildung 1 ). </li><li> Zentrifugieren Sie den Überstand bei 110.000 xg für 60 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen. Das EV / Exosom-Pellet in PBS resuspendieren (Abbildung 1 ). Das Pellet, das aus 240-480 ml NAMEC-konditioniertem Medium in 100 &amp; mgr; l isoliert wurde, resuspendieren. </li><li> Messen Sie die Proteinkonzentration der EV-Suspension mit dem BCA-Protein-Assay. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration etwa 20-40 μg / 100 μL beträgt. Bei -20 ° C aufbewahrenweitere Analyse. </li><li> Messen Sie die Konzentration und Größe der EVs / Exosomen durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), wie zuvor von Gardiner et al. 11 Verdünnen Sie die EVs / Exosomen (20 μg / 100 μL) mit PBS auf 10.000-fach für die NTA-Analyse. HINWEIS: Das Ergebnis der NTA-Analyse spiegelt die Anzahl und Größe der untersuchten Vesikel wider. </li><li> Bild der EVs / Exosomen mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), wie zuvor von Lin et al. 4 beschrieben. </li></ol> 2. Exosome Reinigung mit einem Dichtegradienten <ol><li> Das 110.000 g Pellet aus Schritt 1.7 in 40% (w / v) Iodixanol in PBS (2 ml) resuspendieren. Übertragen Sie die Mischung in Sequenz mit Aliquots von 30%, 20%, 10% und 5% (w / v) Iodixanol in PBS (jeweils 2 ml), um einen Dichtegradienten in einem Ultrazentrifugenröhrchen zu bilden. </li><li> Die Mischung bei 200.000 xg für 8 h bei 4 ° C zentrifugieren. </li><li> Sammle jede Gradientenfraktion (10 FraktaleOns; 1 ml / Fraktion) mit einer Pipette von der Oberseite des Röhrchens. </li><li> Analysieren Sie das Vorhandensein von Exosommarkern ( z. B. CD81, CD9, CD63 und Tsg101) in jeder Fraktion durch SDS-PAGE 12 und Western Blot. 50 μl Suspensionen jeder Fraktion auf ein 10% Gel mit 0,1% (w / v) SDS geben und die Proteine ​​in Fraktionen mit Gelelektrophorese trennen. </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​von einem Gel auf eine PVDF-Membran und inkubieren Sie die Membran mit Antikörpern gegen die Exosommarker ( z. B. CD81, CD9, CD63 und Tsg101) und Housekeeping Protein GAPDH über Nacht ( Table of Materials ) bei 4 ° C. HINWEIS: Das Ergebnis identifiziert die Fraktion, die Exosomen enthält. </li></ol> 3. Extrazelluläre Vesikel / Exosom-Kennzeichnung <ol><li> Suspendieren Sie die in Schritt 1.7 erhaltenen EVs / Exosomen in 10 μM Carboxyfluorescein-Succinimidyldiacetatester (CFSE) bei 20 μg exosomalen Protein / 100 μl. Vorbereitung einer parallelen Probe coNur CFSE und PBS, die in gleicher Weise verarbeitet wurden, als Negativkontrolle für die späteren EV / Exosom-Aufnahme-Assays. Lassen Sie die Mischungen bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Suspendieren Sie die EVs / Exosomen in 50x Volumen PBS und zentrifugieren Sie die Suspension bei 110.000 xg für 60 min bei 4 ° C. Den Überstand entfernen und das EV / Exosom-Pellet in PBS resuspendieren. Wiederholen Sie Schritt 3.2 einmal. </li><li> Die EVs / Exosomen in PBS in einer Konzentration von 20 μg exosomalen Protein / 100 μl suspendieren und dann die EVs / Exosomen durch 0,22 μm Membranen filtrieren, bevor die EVs / Exosomen den Zellen zugesetzt werden. </li></ol> 4. Extrazellulärer Vesikel / Exosom-Aufnahme-Assay <ol><li> Zur Herstellung von Kulturmedium werden 500 ml MCDB 170, pH 7,4 + 500 ml DMEM / F12 mit Natriumbicarbonat (0,2438%) vermischt; EGF (5 ng / ml); Hydrocoritison (0,5 &amp; mgr; g / ml); Insulin (5 &amp; mgr; g / ml); Und BPE (35 &amp; mgr; g / ml) 4 Tafeln Sie die menschlichen Mamma-Epithel-HMLE-Zellen in 6-Well-Schalen (1 x 10 6 &lt;)/ Sup&gt; Zellen / gut) einen Tag vor EV / Exosom Behandlung. Addieren Sie 2 μg / ml CFSE fluoreszenzmarkiertes EVs / Exosom, erhalten in Schritt 3.3, zum Kulturmedium der HMLE-Zellen für 2-6 h. Behandeln Sie die HMLE-Zellen der negativen Kontrollgruppe mit der in Schritt 3.1 beschriebenen Parallelpräparation. </li><li> Nach der 2- bis 6-h-Inkubation die Zellen zweimal mit 4 ml PBS bei Raumtemperatur waschen. </li><li> Die Zellen mit 0,25% Trypsin für 10 min abtrennen und die Zellen in PBS, die 0,2% FBS enthalten, erneut suspendieren. Messen Sie die EV / Exosom-Aufnahme von der Fluoreszenzintensität in den Zellen mit einem Fluoreszenzzellenanalysator 4 . Bild die mit EVs / Exosomen behandelten Zellen oder die Negativkontrolle mit konfokaler Mikroskopie. HINWEIS: Die grüne Fluoreszenz in den Zellen wird durch die EV / Exosom-Aufnahme verursacht. Siehe die Legende von Abbildung 6 für die Mikroskopeinstellungen. </li></ol> 5. Isolierung der primären Maus Mamma Epithelzellen <ol><lI&gt; Gelatine-beschichtete Schalen vorbereiten, indem man 12 ml 0,1% ige Gelatinelösung auf 10 cm Schalen zugibt. Legen Sie die Platten in einen 37 ° C Inkubator für 30 min. Entfernen Sie die Gelatinelösung und lassen Sie den Deckel 4 Stunden lang in einer laminaren Fließhaube aus dem Geschirr, bis die Gelatinebeschichtung getrocknet ist. </li><li> Die Zahl 2, 3, 4 und 5 Milchdrüsen ( Abbildung 2 ) von 12 Wochen alten weiblichen C57BL / 6 Mäusen unter Verwendung von Scheren zerlegen und die Drüsen in kleine Stücke (2 mm 2 ) mit einem Rasiermesser schneiden. </li><li> Weiterhin dissoziieren Sie die Aufschlämmung von Milchdrüsen (von 10 Mäusen) für 60 min bei 37 ° C, 120 U / min Rühren mit 50 ml DMEM / F12, enthaltend 0,2% Kollagenase Typ IV, 0,2% Trypsin, 5% FBS, 5 μg / ml Gentamycin , Und 1x Pen-Strep. </li><li> Die Epithelorganoide aus der Mischung durch Zentrifugation bei 350 xg für 10 min abtupfen. </li><li> Die Epithelorganoide in 4 ml DMEM / F12 mit 0,1 mg / ml DNase I für 5 min bei Raumtemperatur suspendieren. Füge 6 mL DMEM / F12 zu einem Finale hinzuVolumen von 10 ml. </li><li> Die Suspension bei 400 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet in 10 ml DMEM / F12 resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Aufhängung, aber schlagen Sie die Bremse, wenn die Geschwindigkeit 400 x g erreicht. Den Überstand verwerfen. HINWEIS: Beim Schlagen der Bremse werden die Epithelorganoide schnell heruntergekrampft, während Fibroblasten als Einzelzellen noch im Überstand bleiben. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 5.6 und 5.7 5-7 mal. Fügen Sie einen Tropfen der Suspension zu einem Hämocytometer hinzu und überprüfen Sie dann den Abstand der Fibroblasten aus der Organoidmischung unter Mikroskopie nach jeder Zentrifugationsrunde (Abbildung 3 ). </li><li> Die in Schritt 5,1 erhaltenen Organoide in der mit Gelatine beschichteten Schale mit DMEM / F12, enthaltend 1x ITS, 5% FBS, 50 μg / mL Gentamycin, 10 ng / mL EGF und 1x Pen-Strep. </li><li> Nach 48 h entfernen Sie die schwimmenden Zellen in der Kultur, indem Sie das Medium durch frisches Kulturmedium ohne FBS (DMEM / F12, enthaltend 1x ITS, 50 μg / ml Gentamycin, 10 ng / ml EGF und 1x Pen-Strep). </li><li> Vergewissern Sie sich, dass eine Monoschicht von Mamma-Epithelzellen in 3 Tagen aus den angehängten Epithelorganoiden wandert und wächst. </li></ol> 6. Trennung der primären Maus Basal / Luminal Mamma Epithelzellen <ol><li> Nach der 3-tägigen Kultur lösen Sie die Maus-Primär-Mamma-Zellen mit einer natürlichen Enzymmischung mit proteolytischer und kollagenolytischer Enzymaktivität für 20 min. Neutralisieren der Enzymaktivität mit 5% FBS in PBS. </li><li> Die Suspension bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Das Zellpellet wird in 5 mg / ml Dispos für 20 min resuspendiert. Neutralisieren der Enzymaktivität mit 5% FBS in PBS. </li><li> Die Suspension bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in 100 μl PBS mit 0,2% FBS in einer Konzentration von 10 7 Zellen / ml mit dem verdünnten erneut suspendiertAnti-CD49f und anti-EpCAM-Antikörper auf Eis für 1 h im Dunkeln. </li><li> Die Zellen mit PBS waschen und dann die Zellen mit Fluorophor-konjugiertem Sekundärantikörper auf Eis für 30 min im Dunkeln inkubieren. </li><li> Die Zellen in PBS mit 0,2% FBS waschen und erneut suspendieren. </li><li> Sortieren Sie die EpCAM hi / CD49f lo luminal Mamma Epithelzellen auf einem Zellsortierer 4 . </li></ol> 7. Extrazelluläre Vesikel / Exosomenbehandlung <ol><li> Die sortierten EpCAM- hi / CD49f-luminalen Mamma-Epithelzellen aus Schritt 6.7 auf mit Gelatine beschichteten 6-Well-Schalen (2 x 10 &amp; sup5; Zelle / Vertiefung) und behandeln sie dann mit PBS oder den 2 &amp; mgr; g / ml NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen Erhalten in Schritt 1.7. </li><li> Um die biologische Wirksamkeit der EVs / Exosomen in der Langzeitkulturbehandlung zu gewährleisten, ersetzen Sie das Zellkulturmedium mit frischem Medium, das PBS oder 2 μg / mL NAMEC-abgeleitete EVs / Exosomen enthält, alle zwei Tage. Spalte nicht die Maus primaRum-luminalen Zellen während der 10-tägigen Behandlung. </li></ol> 8. Fat Pad Injektion von Mamma Epithelzellen <ol><li> Betäubung eines 3 Wochen alten weiblichen C57BL / 6 Mäusen mit Isofluoran 2-3% Inhalationsmittel. </li><li> Lege die betäubte Maus auf den Rücken. Entfernen Sie das Fell auf dem Mittelabdomen mit einem Rasiermesser / Haarcreme und reinigen Sie die Chirurgie mit drei wechselnden Zyklen von 70% Alkohol und Povidon-Jod. </li><li> Machen Sie einen 1,5 cm vertikalen Schnitt durch die Haut entlang der ventralen thoracic-inguinal Region mit Schere und dann abwechselnd aussetzen die rechten und linken 4th Mamma Fett Pads. </li><li> Löschen Sie jeden Fett-Pad durch Entfernen von Drüsen-Parenchym mit Schere. Lokalisieren Sie den Lymphknoten in der Fett-Pad und entfernen Sie dann die ganze Drüsen-Parenchym unter dem Lymphknoten. HINWEIS: Zwei Drittel des Fettkissens sollten an Ort und Stelle bleiben. </li><li> Die aus Schritt 7.2 erhaltenen Zellen mit einer natürlichen Enzymmischung (siehe Tabelle der Materialien ) mit proteolytischem a abziehenKollagenolytische Enzymaktivität für 10 min. Neutralisieren der Enzymaktivität mit 5% FBS in PBS. </li><li> Die Suspension bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand verwerfen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer und suspendieren Sie die Zellen in PBS in einer Konzentration, so dass 15 μl die gewünschte Zelldosis (10 4 -10 2 Zelle / Pad) enthält. </li><li> Injektion von 15 &amp; mgr; l Mamma-Epithelzellsuspension in ein Fettkissen unter Verwendung einer 100 &amp; mgr; l Glasspritze, die an einer 27G-Nadel befestigt ist. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 8.4-8.7 für das Fett-Pad auf der anderen Seite. </li><li> Schließen Sie die Haut mit Wundclips. </li></ol> 9. Mammary Gland Whole Mount <ol><li> Euthanasiere die Maus mit CO 2 plus Zervixversetzung nach 8 Wochen nach der Zellinjektion (Schritt 8.7). </li><li> Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Hautschicht vom Thoraxbereich zum Leistenbereich mit Schere und setzen Sie dann sowohl die rechte als auch die linke 4. m ausAmmary Fett Pads. Entfernen Sie die 4. Brustdrüsen ( Abbildung 2 ). </li><li> Verbreiten Sie die Fettpolster auf Glasmikroskop-Objektträger und fixieren Sie die Fettpolster mit Kahle-Fixiermittel (4% Formaldehyd, 30% EtOH und 2% Eisessig) bei Raumtemperatur über Nacht. Achtung: Kahles Fixativ ist ein Reizmittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Chemikalienhaube durch. </li><li> Waschen Sie die Fettpolster in 250 ml 70% EtOH für 15 min und dann in 250 ml dH 2 O für 5 min. Färben Sie die Fettpolster mit Carmin Alaun (1 g Karmin und 2,5 g Aluminium Kaliumsulfat in 500 ml dH 2 O) bei Raumtemperatur über Nacht. </li><li> Waschen Sie die Fettpolster mit 250 ml 70% EtOH für 15 min, 250 ml 95% EtOH für 15 min und 250 ml 100% EtOH für 15 min. </li><li> Reinigen Sie die Fett-Pads in Xylol für Tage und stoppen Sie die Xylol-Inkubation, wenn die Fett-Pads transparent werden. Achtung: Xylol ist ein Reizmittel. Führen Sie diesen Schritt in einer Chemikalienhaube durch. </li><li> Montiere die Slides wiTen Aufnahmemedium und fotografieren (2.400 dpi) der Fettkissen mit einem digitalen Dia-Scanner. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Exosomen tragen oft Eigenschaften der Zellen, die sie freisetzen, und die Menge der freigesetzten Exosomen kann durch Stimuli 4 induziert werden. Das Kulturmedium der Zellen kann gesammelt und einer differentiellen Ultrazentrifugation für die EV / Exosom-Sammlung unterzogen werden (Abbildung 1 ). Es gibt derzeit keine allgemeine Vereinbarung über eine ideale Methode, um EVs / Exosomen zu isolieren. Die hier verwendete optimale Methode wurde durch die nachgeschaltete ...

Exosomen können die zelluläre Kommunikation durch Übertragung von Membran und zytosolischen Proteinen, Lipiden und RNAs zwischen den Zellen vermitteln. Es wurde gezeigt, dass die Exosomen-vermittelte Kommunikation in viele physiologische und pathologische Prozesse involviert ist ( dh die Antigenpräsentation, die Entwicklung der Toleranz 2 und die Tumorprogression 3 ). Exosomen haben oft ähnliche Inhalte wie die Quellzellen, die sie freisetzen. So können die Exosomen spezifische Zelleigenschaften aus den Quellzellen tragen und diese Eigenschaften an die Zellen übertragen, die sie einnehmen 4 . Exosomen sind 50- bis 150-nm-Doppelschicht-Membran-Vesikel und präsentieren spezifische Marker ( zB CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix und TSG101). So müssen Exosomen durch verschiedene Methoden für verschiedene Aspekte charakterisiert werden. Die Transmissionselektronenmikroskopie kann zur Visualisierung von Membranblasen verwendet werdenWie Exosomen 4 , 5 . Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und dynamische Lichtstreuungsanalyse (DLS) dienen zur Messung der Größe und Anzahl der gereinigten Exosomen 4 . Der Lipidmembrangehalt von Exosomen kann durch Dichtegradient verifiziert werden. Exosomale Marker wie CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix und TSG101 6 , 7 können durch Western Blotting gemessen werden. Mamma-Basalzellen haben die Fähigkeit, Milchdrüsen zu erzeugen, wenn sie in fette Pads implantiert werden, während Luminalzellen nicht 8 , 9 , 10 sein können . So werden Mamma-Basalzellen auch als Mamma-Repopulationseinheiten bezeichnet. Durch die Verwendung des Modells der Mamma-Basal- und Luminalzellen kann die Fähigkeit von EVs / Exosomen, Zellcharakteristiken zwischen verschiedenen Zellpopulationen zu übertragen, untersucht werden. Diese ArbeitZeigt die Methode der Übertragung von Drüsenbildungsfähigkeit von Mamma-Basal-Epithelzellen zu Mamma-Lumen-Epithelzellen unter Verwendung von EVs / Exosomen, die aus Mamma-Basal-Epithelzellen stammen. Luminale Mammaepithelzellen erhielten Basalzelleneigenschaften nach der Einnahme von aus Basalzellen abgesonderten EVs / Exosomen und können dann Milchdrüsen bilden 4 .

<table><tbody><tr><td>MCDB 170&nbsp;</td><td>USBiological</td><td>M2162</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>1250062</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100K Ultrazentrifuge</td><td>Beckman</td><td>393253</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Rotor</td><td>Beckman</td><td>331306</td><td></td></tr><tr><td>NANOSIGHT LM10</td><td>Malvern</td><td>NANOSIGHT LM10</td><td>für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)</td></tr><tr><td>Optiprep&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td>60%ige (w/v) Lösung von Iodixanol in Wasser (steril).</td></tr><tr><td>CD81-Antikörper</td><td>GeneTex</td><td>GTX101766</td><td>1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 & Grad; C, über Nacht&nbsp;</td></tr><tr><td>CD9-Antikörper</td><td>GeneTex</td><td>GTX100912</td><td>1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 &deg; C, über Nacht&nbsp;</td></tr><tr><td>CD63-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>Ab59479</td><td>1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 &deg; C, über Nacht&nbsp;</td></tr><tr><td>TSG101 Antikörper</td><td>GeneTex</td><td>GTX118736</td><td>1:1.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 &/de; C, über Nacht&nbsp;</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>GeneTex</td><td>GTX100118</td><td>1:6.000 in 5 % w/v fettfreier Trockenmilch, 1x TBS, 0,1 % Tween 20 bei 4 & Grad; C, über Nacht&nbsp;</td></tr><tr><td>CFSE (Carboxyfluorescein-Succinimidyldiacetatester)</td><td>Thermo</td><td>V12883</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Fluoreszenzzellanalysator</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ IV&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo</td><td>27250018</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td>ein Gemisch aus rekombinantem Humaninsulin, humanem Transferrin und Natriumselenit</td></tr><tr><td>accutase</td><td>ebioscience</td><td>00-4555-56</td><td>ein natürliches Enzymgemisch mit proteolytischer und kollagenolytischer Enzymaktivität</td></tr><tr><td>dispase&nbsp;</td><td>STAMMZELLE</td><td>7913</td><td>5 mg/ml = 5 μl,</td></tr><tr><td>Anti-CD49f-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>313611</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Anti-EpCAM-Antikörper</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td>1:200</td></tr><tr><td>FACSAria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Zellsortierer</td></tr><tr><td>Karmin-Alaun</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1022</td><td></td></tr><tr><td>humane Brustepithelzellen (HMLE-Zellen, NAMECs)</td><td></td><td></td><td>Geschenke von Dr. Robert Weinberg</td></tr><tr><td>permount</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Zymeset&nbsp;</td><td>BSB101</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-015</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocoritison</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-H0888</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SI-I9278</td><td></td></tr><tr><td>BPE (Rinder-Hypophysen-Extrakt)</td><td>Hammod Cell Tech&nbsp;</td><td>1078-NZ</td><td></td></tr><tr><td>GW627368X&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>10009162</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Kulturschale</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353025</tr><tr><td>Tischzentrifuge</td><td>Eppendrof&nbsp;</td><td>Zentrifuge 3415R</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifugenröhrchen</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskopie</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>STEMCELL</td><td>7903</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Kulturschale</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>6-Well-Kulturschale</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>weiblich C57BL/6 Mäuse</td><td>NLAC (National Laboratory Animal Center</td> FBS (Fetal Bovine Serum<td></td><td></td></tr><tr><td>)</td><td>BioWest&nbsp;</td><td>S01520</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15710072</tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>5PRIMER</td><td>2500120</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran&nbsp;</td><td>Halogenkohlenwasserstoff</td><td>NPC12164-002-25</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>MACRON</td><td>H121-08</td><td></td></tr><tr><td>EtOH (Ethanol)</td><td>J.T. Baker</td><td>800605</td><td></td></tr><tr><td>Eisessig</td><td>Panreac</td><td>131008.1611</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumkaliumsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12625</td><td></td></tr><tr><td>Xylol&nbsp;</td><td>Leica</td><td>3803665</td><td></td></tr><tr><td>0,22 μm m Membranen</td><td>Merck Millipore</td><td>Millex-GP</td><td></td></tr><tr><td>AUTOCLIP Wundclips, 9 mm</td><td>BD Biosciences</td> 427631 AUTOCLIP Wundclip-Applier <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>CellMask&trade; Deep Red</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C10046</td><td>Plasmamembran-Färbung</td></tr></tbody></table>

Übertragung der mamma-drüsen-bildenden fähigkeit zwischen mamma-basal-epithelzellen und mamma-luminalzellen über extrazelluläre vesikel / exosomen

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Zellen können über Exosomen, ~ 100-nm extrazelluläre Vesikel (EVs), die Proteine, Lipide und Nukleinsäuren enthalten, kommunizieren. Nicht adhärierende / mesenchymale Mamma-Epithelzellen (NAMEC) -gesteuerte extrazelluläre Vesikel können aus NAMEC-Medium durch differentielle Ultrazentrifugation isoliert werden. Basierend auf ihrer Dichte können EVs durch Ultrazentrifugation bei 110.000 x g gereinigt werden. Die EV-Präparation aus der Ultrazentrifugation kann unter Verwendung eines kontinuierlichen Dichtegradienten weiter getrennt werden, um eine Kontamination mit löslichen Proteinen zu verhindern. Die gereinigten EVs können dann mit Hilfe der Nanopartikel-Tracking-Analyse weiter ausgewertet werden, die die Größe und Anzahl der Vesikel in der Präparation misst. Die extrazellulären Vesikel mit einer Größe von 50 bis 150 nm sind Exosomen. Die NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen können von Mamma-Epithelzellen aufgenommen werden, die durch Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie gemessen werden können. Einige Mamma-Stammzellen-Eigenschaften ( z. B. Brustdrüsen-bildende Fähigkeit) könnenVon den Stamm-ähnlichen NAMECs zu den Mamma-Epithelzellen über die NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen übertragen werden. Isolierte primäre EpCAM hi / CD49f lo luminalen Mamma Epithelzellen können keine Mammadrüsen bilden, nachdem sie in Mausfettkissen transplantiert wurden, während EpCAM lo / CD49f hi basale Mammaepithelzellen nach der Transplantation Mamidrüsen bilden. Aufnahme von NAMEC-abgeleiteten EVs / Exosomen durch EpCAM hi / CD49f lo luminalen Mamma-Epithelzellen ermöglicht es ihnen, Brustdrüsen zu erzeugen, nachdem sie in Fettpolster verpflanzt wurden. Die aus stammähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnenen EVs / Exosomen übertragen die Brustdrüsen-bildende Fähigkeit zu EpCAM hi / CD49f-luminalen Mamma-Epithelzellen.

Da sich gezeigt hat, dass die Blockierung der PGE 2 / EP 4- Signalisierung die EV / Exosomen-Freisetzung von mamma-basalartigen Stammzellen 4 auslöst, stellt diese Arbeit ein Verfahren zur Isolierung der induzierten EVs / Exosomen aus der Mamma-Epithel-Basalzellen (NAMEC) -Kultur dar. Da NAMECs im serumfreien Medium kultiviert werden, gibt es keine bereits vorhandenen EVs / Exosomen aus Serum 13 . Für Zellen, die in serumhaltigem M...

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Die allgemeinen Ziele dieses Verfahrens bestehen darin, stammeigenschaftsübertragende extrazelluläre Vesikel und Exosomen aus Stammzellen zu isolieren und die Fähigkeit dieser Nanopartikel zur Übertragung von Stammzelleigenschaften zu bewerten. Die Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Stammzellen beantworten, beispielsweise, ob Stammzelleigenschaften durch transzelluläre Signale oder Vesikel vermittelt werden.Oder Exosome können Stammzelleigenschaften auf keine Stammzellen übertragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die induzierten Stammzellen aus transzellulären Vesikeln hervorgehen. Außerdem können Exosome direkt zur Umprogrammierung von Nicht-Stammzellen in Stammzellen verwendet werden.Den Ablauf wird die Postdoktorandin LeMonsier demonstrieren, unterstützt von den chirurgischen Assistenten Pei-Ling, Wen-Tin und Shih-Yin, alle aus meinem Labor. Beginnen Sie, indem Sie 1,2 × 10⁶ nicht-ankerafhängige/mesenchymale Brustepithelzellen, oder NAMECs, in 12 Milliliter Medium pro 15-Zentimeter-Platte für eine vier Tage dauernde Kultur in einem Zellkultur-Inkubator ansäen. Am vierten Tag gewinnen Sie das Kulturmedium für die Zentrifugation am Tischzentrifugen. Anschließend das Überstand in ein kegelförmiges Reagenzglas überführen, um eine zweite Zentrifugation auf Tischplatte durchzuführen. Danach das Überstand in ein neues Ultrazentrifugenglas überführen und eine Ultrazentrifugation für 30 Minuten durchführen. Am Ende des Zentrifugierens das Überstand in ein neues Ultrazentrifugenrohr überführen und das Überstand erneut ultrazentrifugieren.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das extrazelluläre Vesikel-Exosom-Präparat in PBS für eine dritte Ultrazentrifugation. Anschließend resuspendieren Sie das Präparat in frischem PBS und zentrifugieren die Zellpartikel ein letztes Mal im Ultrazentrifugator. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das extrazelluläre Vesikel-Exosom-Präparat in 100 µL PBS.Danach die Proteinkonzentration der extrazellulären Vesikel-Suspension mittels Bicinchoninsäure-Assay bestimmen. Die Konzentration sollte etwa 20 bis 40 Mikrogramm pro 100 Mikroliter betragen. Um die Konzentration und die Größe der extrazellulären Vesikel und Exosomen zu messen, die Zellpartikel auf zwei Mikrogramm Protein pro 100 Milliliter PBS verdünnen.Und analysieren Sie die Partikel mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse. Um die Exosomen durch Dichtegradient zu reinigen, resuspendieren Sie das Präparat nach der dritten Ultrazentrifugation in zwei Milliliter 40-prozentigem Iodixanol in PBS. Überlagern Sie die Zellsuspension anschließend nacheinander mit je zwei Milliliter 30-prozentigem, 20-prozentigem, 10-prozentigem und 5-prozentigem Iodixanol.Trennen Sie die Zellfraktion durch Dichtegradient-Ultrazentrifugation, wobei am Ende der Zentrifugation mit einer Pipette jeweils die zehn Gradientenschichten gesammelt werden. Anschließend wird das Vorhandensein von Exosomenmarkern in jeder Fraktion mittels SDS-Page und Western Blot gemäß Standardprotokollen analysiert, unter Verwendung von Antikörpern gegen die jeweils interessierenden Exosomenmarker.Um mammary epitheliale Zellen mit extrazellulären Vesikeln und Exosomen zu behandeln, säen Sie zunächst zwei mal zehn hoch fünf flow-sortierte EpCAM-hoch-CD49f-niedrig-luminale mammary epitheliale Zellen pro Platte auf mit Gelatine beschichteten 6-Well-Platten aus. Behandeln Sie dann jede Zellkultur mit zwei Mikrogramm pro Milliliter extrazellulärer Vesikel und Exosomen, die von NAMEC stammen. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle zwei Tage durch frische extrazelluläre Vesikel und Exosomen über einen Zeitraum von zehn Tagen. Am Ende der Behandlungszeit bringen Sie eine dreiw&ouml;chige weibliche anesthetisierte 57 BL6 Maus in R&uuml;ckenlage und entfernen das Fell am mittleren Bauchbereich. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit drei abwechselnden Zyklen aus 70 Prozent Alkohol und Povidon-Iod. F&uuml;hren Sie dann einen 1,5 cm langen vertikalen Schnitt durch die Haut entlang der ventralen thorakalen Leistenregion durch.Exponieren Sie abwechselnd das rechte und das linke vierte Brustfettgewebe. Lokalisieren Sie die Lymphknoten in jedem Fettgewebe und entfernen Sie die gesamte darunterliegende Drüse periankal. Danach verwenden Sie ein natürliches Enzym mit proteolytischer und kollagenolytischer Aktivität, um die extrazellulären Vesikel und die behandelten luminalen Brustepithelzellen zu lösen.Neutralisieren Sie die Enzymaktivität durch Zugabe von fünf Prozent FBS in PBS nach zehn Minuten. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Verdünnen Sie die Zellen nach der Zellzählung auf eine Konzentration von ein mal zehn hoch zwei bis ein mal zehn hoch vier Zellen pro 15 Mikroliter PBS.Verwenden Sie eine 100-Mikroliter-Glasspritze mit einer 27-Gauge-Nadel, um jeweils 15 Mikroliter der Brustepithelzell-Suspension in jedes Fettgewebe zu injizieren. Danach verschließen Sie die Haut mit Wundclips. Acht Wochen nach der Injektion führen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Haut von der thorakalen bis zur inguinalen Region und legen sowohl das vierte rechte als auch das vierte linke Brustfettgewebe frei.Entfernen Sie die vierte Brustwarzenanlage und verteilen Sie die Fettgewebe auf einzelnen Glasobjektträgern. Danach bringen Sie die Objektträger in eine Abzugshaube und fixieren Sie die Gewebe mit Collies-Fixansatz über Nacht bei Raumtemperatur. Am nächsten Morgen waschen Sie die Proben in 250 Milliliter 70-prozentigem Ethanol 15 Minuten lang. Anschließend 250 Milliliter destilliertes Wasser für fünf Minuten. Nach der Spülung mit destilliertem Wasser die Fettgewebe über Nacht bei Raumtemperatur mit Karmin-Alaun färben. Anschließend Dehydrierung durch steigende Ethanol-Behandlungen mit jeweils 15-minütiger Inkubation.Nach der letzten Dehydrierung die Proben in Xylol in einer chemischen Abzugshaube überführen, bis die Fettgewebe transparent werden. Anschließend die Objektträger mit Eindeckmedium versehen und einen digitalen Objektträgerscanner verwenden, um die Fettgewebe mit 2.400 Punkten pro Zoll abzubilden. Die Größe der isolierten Vesikel und der Ultrazentrifugen-Platte beträgt typischerweise etwa 100 Nanometer, gemessen mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse.Außerdem zeigt die Analyse von Ultrazentrifugat-Fraktionen des konditionierten Mediums von NAMEC mittels Transmissionselektronenmikroskopie das Vorhandensein zahlreicher Membranvesikel. Nach der soeben demonstrierten Dichtegradiententrennung können Exosomen-Marker in der 20-prozentigen Iodixanol-Fraktion nachgewiesen werden. Die fluiddynamische Analyse menschlicher luminaler Brustepithelzellen, die mit CFSE-markierten, von NAMIC abgeleiteten extrazellulären Vesikeln und Exosomen behandelt wurden, zeigt ein zehnfach höheres CFSE-Signal in den mit Exosomen behandelten Kulturen.Anzeige der spezifischen Aufnahme von CFSE-markierten extrazellulären Vesikeln und Exosomen durch die Brustdrüsenepithelzellen. Während die negativen Kontrollen, mit PBS behandelte Brustdrüsenepithelzellen, kein CFSE-Signal aufweisen, kann mittels konfokaler Mikroskopie ebenfalls der Nachweis für die Aufnahme von namic-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln und Exosomen durch die mit Exosomen behandelten Zellen erbracht werden. Bemerkenswerterweise erhielten die Fettgewebslager von Mäusen, die zehn Tage lang mit flow-sortierten epCAMhi/CD49Flo luminalen Brustdrüsenepithelzellen injiziert worden waren, die mit von NAMEC-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln und Exosomen behandelt worden waren, die Fähigkeit, Brustdrüsen zu bilden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik unseren Forschern auf dem Gebiet der Stammzellbiologie den Weg. Um die Anwendung von aus Stammzellen gewonnenen Transzellen sowie Vesikeln und Exosomen in der Regenerativen Medizin und der direkten Zellreprogrammierung zu erforschen.

transfer-mammary-gland-forming-ability-between-mammary-basal

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen (Video) | JoVE Journal

Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

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