Übertragung der Mamma-Drüsen-bildenden Fähigkeit zwischen Mamma-Basal-Epithelzellen und Mamma-Luminalzellen über extrazelluläre Vesikel / Exosomen

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Reinigung, Quantifizierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) / Exosomen aus nicht adhärenten / mesenchymalen Mamma-Epithelzellen und zur Verwendung derselben zur Übertragung der Brustdrüsen-bildenden Fähigkeit zu luminalen Mamma-Epithelzellen. EVs / Exosomen, die aus Stamm-ähnlichen Mamma-Epithelzellen gewonnen werden, können diese Zell-Eigenschaft in Zellen übertragen, die die EVs / Exosomen einnehmen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Stammzellen zu isolieren und extrazelluläre Vesikel und Exosomen aus Stammzellen zu übertragen. Und um die Stammübertragungsfähigkeit dieser Nanopartikel zu bewerten. Das Meso kann Schlüsselfragen im Stammzellbereich beantworten, wie es dazu kommt, ob Stammzellen aus Transzellen oder Vesikeln stammen.

Oder das Exosom kann die Eigenschaft von Stammzellen auf Nicht-Stammzellen übertragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die induzierten Stammzellen aus dem Transzellvesikel stammen. Und das Exosom kann verwendet werden, um Nicht-Stammzellen direkt in Stammzellen umzuprogrammieren.

Das Verfahren wird von dem Postforscher LeMonsier mit chirurgischer Assistentin, Pei-Ling, Wen-Tin und Shih-Yin, alle aus meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Aussaat von einem Punkt zwei mal zehn auf die sechste nicht adhärente/mesenchymale Brustepithelzelle oder NAMECs in 12 Milliliter Medium pro 15-Zentimeter-Schale für eine viertägige Kultur in einem Zellkultur-Inkubator. Am vierten Tag ernten Sie das Nährmedium für die Tischzentrierung.

Übertragen Sie dann das Übergewicht in ein konisches Röhrchen für eine zweite Tischzentrifugation. Übertragen Sie anschließend das Supernatent in eine neue Ultrazentrifuge und führen Sie eine Ultrazentrifugation für 30 Minuten durch. Am Ende des Schleuderns wird das Supernatent in ein neues Ultra-Zentrifugenröhrchen überführt und das Supernatent erneut ultrazentrifugiert.

Entfernen Sie das Supernatent und resuspendieren Sie den extrazellulären Vesikel-Exosom-Gaumen in PBS für eine dritte Ultrazentrifugation. Suspendieren Sie dann den Gaumen wieder in frischem PBS und zentrifugieren Sie die Zellpartikel ein letztes Mal. Entfernen Sie das Supernatent und resuspendieren Sie den extrazellulären Vesikel-Exosom-Gaumen in 100 Mikrolitern PBS.

Messen Sie dann die Proteinkonzentration der extrazellulären Vesikelsuspension durch einen Bicinchoninsäure-Assay. Die Konzentration sollte etwa 20 bis 40 Mikrogramm pro 100 Mikroliter betragen. Um die Konzentration und die Größe der extrazellulären Vesikel und Exosomen zu messen, verdünnen Sie die Zellpartikel auf zwei Mikrogramm Protein pro 100 Milliliter PBS.

Und analysieren Sie die Partikel durch Nanopartikel-Tracking-Analyse. Um die Exosomen durch Dichtegradient zu reinigen, resuspendieren Sie den Gaumen nach der dritten Ultrazentrifugation in zwei Millilitern mit 40 Prozent Iodxanol in PBS. Und überlagern Sie die Zellsuspension mit sequenziellen zwei Millilitern Volumina von 30 Prozent, 20 Prozent, 10 Prozent und fünf Prozent Iodixanol.

Trennen Sie die Zellfraktion durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation mit einer Pipette, um jede der zehn Gradientenschichten am Ende der Zentrifugation zu ernten. Analysieren Sie dann das Vorhandensein von Exosomenmarkern in jeder Fraktion mittels SDS-Seite und Western Blot gemäß Standardprotokollen. Verwendung von Antikörpern gegen die entsprechenden Exosomenmarker von Interesse.

Um Brustepithelzellen zuerst mit den extrazellulären Vesikeln und Exosomen zu behandeln, säen Sie zwei Mal in den fünften Fluss sortierte epcam hi-CD 49F niedrigluminale Brustepithelzellen pro Platte auf gelatinebeschichtete Sechs-Well-Platten. Behandeln Sie dann jede Zellkultur mit zwei Mikrogramm pro Milliliter der von NAMEC abgeleiteten extrazellulären Vesikel und Exsomen. Ersetzen des kultivierten Mediums durch frische extrazelluläre Vesikel und Exosomen alle zwei Tage für zehn Tage.

Am Ende des Behandlungszeitraums legen Sie eine drei Wochen alte, weibliche anästhesierte 57 BL6-Maus in Rückenlage und entfernen Sie das Fell am Mittelbauch. Desinfizieren Sie die Operationsstelle mit drei abwechselnden Zyklen von 70 Prozent Alkohol und Povodon-Jod. Und machen Sie einen vertikalen Schnitt von fünf Zentimetern durch die Haut, entlang der ventralen thorassischen Leistenregion.

Legen Sie abwechselnd die rechten und linken vierten Brustfettpolster frei. Lokalisieren Sie den Lymphknoten in jedem Fettpolster und entfernen Sie die gesamte Drüsenperancama unterhalb des Lymphknotens. Verwenden Sie als Nächstes ein natürliches Enzym mit prodialitischer und kologenalitischer Aktivität, um die extrazellulären vesikalen und exsombehandelten luminalen Brustepithelzellen abzulösen.

Neutralisierung der Enzymaktivität, mit fünf Prozent FBS in PBS nach zehn Minuten. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf eine mal zehn auf die zweite auf eine mal zehn auf die vierte Zellen pro 15 Mikroliter PBS-Konzentration.

Verwenden Sie eine 100-Liter-Mikroliter-Glasspritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, um 15 Mikroliter der Brustepithelzellsuspension in jedes Fettpolster zu injizieren. Verschließen Sie dann die Haut mit Wundklammern. Acht Wochen nach der Injektion machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die Haut vom Brustbereich bis zum Eingeweide und legen sowohl die rechten als auch die linken vierten Brustfettpolster frei.

Entfernen Sie die vierte Eichel und verteilen Sie die Fettpolster auf einzelne Glasmikroskop-Objektträger. Übertragen Sie dann die Objektträger in eine chemische Haube und fixieren Sie die Pads über Nacht bei Raumtemperatur mit Collies-Fixiermitteln. Waschen Sie die Proben am nächsten Morgen 15 Minuten lang in 250 Millilitern 70-prozentigem Ethanol

Gefolgt von 250 Millilitern destilliertem Wasser für fünf Minuten. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser die Fettpolster über Nacht bei Raumtemperatur mit Karmin-Alaun färben. Gefolgt von einer Dehydrierung in aufsteigenden 15-minütigen Ethanol-Inkubationen.

Nach der letzten Dehydrierung werden die Proben in einer chemischen Haube in Zylene überführt, bis die Fettpolster transparent werden. Montieren Sie dann die Dias mit Eindeckmedium und verwenden Sie einen digitalen Diascanner, um die Fettpolster mit 2.400 Punkten pro Zoll abzubilden. Die Größe der isolierten Vesikel und des Ultrazentrifugen-Gaumens beträgt typischerweise etwa 100 Nanometer, gemessen durch Nanopartikel-Tracking-Analyse.

Darüber hinaus zeigt die transmissionselektronenmikroskopische Analyse von Ultrazentrifugenfraktionen von NAMEC-konditioniertem Medium das Vorhandensein von reichlich vorhandenen Membranvesikeln. Nach der soeben gezeigten Trennung des Dichtegradienten können Exosomenmarker in der 20-prozentigen iodixonalen Fraktion nachgewiesen werden. Die flussseitige emetrische Analyse von humanen luminalen Brustepithelzellen, die mit CFSE-markierten, namischen abgeleiteten, extrazellulären Vesikeln und Exsomen gehandelt wurden, zeigt ein zehnfach höheres CFSE-Signal in den mit Exosomen behandelten Kulturen.

Dies deutet auf die spezifische Aufnahme von CFSE-markierten extrazellulären Vesikeln und Exosomen durch die Brustepithelzellen hin. Während die Negativkontrolle, PBS-behandelte Brustepithelzellen, kein CFSE-Singnal aufweisen, kann der Nachweis einer von der Nasie abgeleiteten extrazellulären vesikalen und Exosomenaufnahme durch die mit Exosomen behandelten Zellen auch durch konfokale Mikroskopie beobachtet werden. Bemerkenswert ist, dass die Fettpolster von Mäusen, die zehn Tage lang mit flusssortierten epCAMhi/CD49Flo luminalen Brustepithelzellen injiziert wurden, die mit NAMEC-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln und Exosomen behandelt wurden, die Fähigkeit erhielten, Brustdrüsen zu bilden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technologie den Weg für unseren Forscher auf dem Gebiet der Stammzellbiologie. Erforschung der Verwendung von aus Stammzellen gewonnenen Transzellen und Vesikeln sowie Exosomen in der Regenerationsmedizin und der direkten Zellreprogrammierung.