Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

Gisela Beutner; George Arthur Porter Jr.

doi:10.3791/55738

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Methodenartikel

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

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DOI:

10.3791/55738

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1. Juni 2017

Gisela Beutner¹ , George Arthur Porter Jr.¹

¹Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Trennung von funktionellen mitochondrialen Elektronentransportkettenkomplexen (Cx) IV und deren Superkomplexe unter Verwendung der nativen Elektrophorese, um Informationen über deren Zusammenbau und Struktur zu zeigen. Das native Gel kann Immunoblotting, In-Gel-Assays und Reinigung durch Elektroelution unterworfen werden, um einzelne Komplexe weiter zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC) transduziert die aus dem Zusammenbruch verschiedener Brennstoffe abgeleiteter Energie in die bioenergetische Währung der Zelle ATP. Das ETC besteht aus 5 massiven Proteinkomplexen, die sich auch in Supercomplexe mit dem Namen respirasomes (CI, C-III und C-IV) und Synthasomen (CV) zusammensetzen, die die Effizienz des Elektronentransports und der ATP-Produktion erhöhen. Seit über 50 Jahren werden verschiedene Methoden zur ETC-Funktion eingesetzt, aber diese Protokolle geben keine Informationen über die Montage von einzelnen Komplexen und Supercomplexen. Dieses Protokoll beschreibt die Technik der nativen Gel-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), ein Verfahren, das vor mehr als 20 Jahren modifiziert wurde, um die ETC-Komplexstruktur zu untersuchen. Die native Elektrophorese erlaubt die Trennung von ETC-Komplexen in ihre aktiven Formen, und diese Komplexe können dann unter Verwendung von Immunoblotting, In-Gel-Assays (IGA) und Reinigung durch Elektroelution untersucht werden. Durch die Kombination der ReSorten der nativen Gel-PAGE mit denen anderer mitochondrialer Assays ist es möglich, ein komplettes Bild der ETC-Aktivität, ihrer dynamischen Assemblierung und Demontage zu erhalten und wie dies die mitochondriale Struktur und Funktion reguliert. Diese Arbeit wird auch Beschränkungen dieser Techniken diskutieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Technik der nativen PAGE, gefolgt von Immunoblotting, IGA und Elektroelution, die nachstehend dargestellt ist, eine leistungsfähige Möglichkeit ist, die Funktionalität und Zusammensetzung von mitochondrialen ETC-Supercomplexen zu untersuchen.

Einleitung

Mitochondriale Energie in Form von ATP ist nicht nur essentiell für das Zellüberleben, sondern auch für die Regulation des Zelltods. Die Erzeugung von ATP durch oxidative Phosphorylierung erfordert eine funktionelle Elektronentransportkette (ETC, Cx-I bis IV) und mitochondriale ATP-Synthase (Cx-V). Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese großen Proteinkomplexe zu Superkomplexen, sogenannten respirasomen und Synthasomen ¹ ^, ² ^, organisiert ^sind . Es ist anspruchsvoll, die Montage-, Dynamik- und Aktivitätsregulierung dieser massiven Komplexe und Superkomplexe zu analysieren. Während Saue....