Methodenartikel

Analysieren von Supercomplexen der mitochondrialen Elektronentransportkette mit Native Elektrophorese, In-Gel-Assays und Elektrolyse

DOI:

10.3791/55738

⸱

1. Juni 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Trennung von funktionellen mitochondrialen Elektronentransportkettenkomplexen (Cx) IV und deren Superkomplexe unter Verwendung der nativen Elektrophorese, um Informationen über deren Zusammenbau und Struktur zu zeigen. Das native Gel kann Immunoblotting, In-Gel-Assays und Reinigung durch Elektroelution unterworfen werden, um einzelne Komplexe weiter zu charakterisieren.

Zusammenfassung

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Die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC) transduziert die aus dem Zusammenbruch verschiedener Brennstoffe abgeleiteter Energie in die bioenergetische Währung der Zelle ATP. Das ETC besteht aus 5 massiven Proteinkomplexen, die sich auch in Supercomplexe mit dem Namen respirasomes (CI, C-III und C-IV) und Synthasomen (CV) zusammensetzen, die die Effizienz des Elektronentransports und der ATP-Produktion erhöhen. Seit über 50 Jahren werden verschiedene Methoden zur ETC-Funktion eingesetzt, aber diese Protokolle geben keine Informationen über die Montage von einzelnen Komplexen und Supercomplexen. Dieses Protokoll beschreibt die Technik der nativen Gel-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), ein Verfahren, das vor mehr als 20 Jahren modifiziert wurde, um die ETC-Komplexstruktur zu untersuchen. Die native Elektrophorese erlaubt die Trennung von ETC-Komplexen in ihre aktiven Formen, und diese Komplexe können dann unter Verwendung von Immunoblotting, In-Gel-Assays (IGA) und Reinigung durch Elektroelution untersucht werden. Durch die Kombination der ReSorten der nativen Gel-PAGE mit denen anderer mitochondrialer Assays ist es möglich, ein komplettes Bild der ETC-Aktivität, ihrer dynamischen Assemblierung und Demontage zu erhalten und wie dies die mitochondriale Struktur und Funktion reguliert. Diese Arbeit wird auch Beschränkungen dieser Techniken diskutieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Technik der nativen PAGE, gefolgt von Immunoblotting, IGA und Elektroelution, die nachstehend dargestellt ist, eine leistungsfähige Möglichkeit ist, die Funktionalität und Zusammensetzung von mitochondrialen ETC-Supercomplexen zu untersuchen.

Einleitung

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Mitochondriale Energie in Form von ATP ist nicht nur essentiell für das Zellüberleben, sondern auch für die Regulation des Zelltods. Die Erzeugung von ATP durch oxidative Phosphorylierung erfordert eine funktionelle Elektronentransportkette (ETC, Cx-I bis IV) und mitochondriale ATP-Synthase (Cx-V). Jüngste Studien haben gezeigt, dass diese großen Proteinkomplexe zu Superkomplexen, sogenannten respirasomen und Synthasomen 1 , 2 , organisiert sind . Es ist anspruchsvoll, die Montage-, Dynamik- und Aktivitätsregulierung dieser massiven Komplexe und Superkomplexe zu analysieren. Während Sauerstoffverbrauchsmessungen, die mit einer Sauerstoffelektrode durchgeführt wurden, und Enzymtests, die unter Verwendung eines Spektrophotometers durchgeführt wurden, wertvolle Informationen über die ETC-Komplexaktivität liefern können, können diese Assays keine Information über die Anwesenheit, die Größe und die Untereinheitszusammensetzung des Proteinkomplexes oder der betroffenen Superkomplexe liefern. Allerdings ist die Entwicklung von blau und klar native (BN und CN) SEITE 3 hat ein leistungsfähiges Werkzeug geschaffen, um wichtige Informationen über komplexe Komposition und Montage / Demontage und über die dynamische Regulierung der supramolekularen Organisation dieser lebenswichtigen Atmungskomplexe unter physiologischen und pathologischen Zuständen aufzudecken.

Die Zusammenstellung dieser Komplexe in übergeordnete Superkomplexe scheint die mitochondriale Struktur und Funktion 5 zu regulieren. Beispielsweise erhöht die respirasome Anordnung den Wirkungsgrad des Elektronentransfers und die Erzeugung der Protonenmotivkraft über die mitochondriale innere Membran 5 . Darüber hinaus erhöht die Zusammenstellung von Synthasomen nicht nur die Effizienz der ATP-Produktion und die Übertragung von Energieäquivalenten in das Zytoplasma 2 , sondern auch die mitochondriale innere Membran in die tubuläre Cristae 6 , </ Sup> 7 Untersuchungen der superkomplexen Assemblierung bei der Herzentwicklung bei Mausembryonen zeigen, dass die Erzeugung von Cx-I-haltigen Supercomplexen im Herzen bei etwa embryonalen Tag 13,5 8 beginnt. Andere haben gezeigt, dass die Menge an Cx-I-haltigen Superkomplexen im Herzen aufgrund von Alterung oder Ischämie / Reperfusionsverletzungen 9 , 10 abnimmt oder eine Rolle bei der Progression neurodegenerativer Erkrankungen spielen kann 11 .

Dieses Protokoll beschreibt Methoden für native Gel-PAGE, die verwendet werden können, um die Zusammenstellung und Aktivität der ETC-Komplexe und Superkomplexe zu untersuchen. Das ungefähre Molekulargewicht von mitochondrialen Superkomplexen kann durch Trennen der Proteinkomplexe in CN- oder BN-Polyacrylamidgelen bestimmt werden. CN-PAGE ermöglicht auch die Visualisierung der enzymatischen Aktivität aller mitochondrialen Komplexe direkt im Gel (In-Gel-Assays;IGA) 12 . Diese Arbeit zeigt die Aktivität von respirasomen, indem sie die Fähigkeit von Cx-I, NADH durch IGA zu oxidieren, und die Anwesenheit von Synthasomen aufgrund der ATP-hydrolysierenden Aktivität von Cx-V durch IGA hervorhebt. Die Mehrfachkomplexe und die Cx-I und Cx-V enthaltenden Komplexe können auch durch Übertragung der Proteine ​​auf Nitrozellulosemembranen und Durchführen von Immunoblotting nachgewiesen werden. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass BN oder CN PAGE im Allgemeinen Proteinkomplexe auf der Grundlage ihrer physiologischen Größe und Zusammensetzung trennt; Der Transfer zu einer Membran bewahrt dieses Muster von Bändern. Die Analyse von Proteinkomplexen in einer BN- oder CN-PAGE kann auch mit 2D-PAGE durchgeführt werden (siehe Fiala et al., 13 für eine Demonstration) oder durch Saccharose-Dichte-Zentrifugation 14 , 15 . Um ein bestimmtes Band weiter zu analysieren, kann es aus der BN PAGE herausgeschnitten werden, und die Proteine ​​aus diesem Proteinkomplex können gereinigt werdenD durch elektrolytieren sie unter nativen Bedingungen. Eine native Elektroelution kann innerhalb von wenigen Stunden durchgeführt werden, was einen signifikanten Unterschied zur passiven Diffusion (wie in Referenz 16 verwendet) von Proteinen aus einem Gel in den umgebenden Puffer machen könnte.

Zusammenfassend beschreiben diese Methoden mehrere Ansätze, die die weitere Charakterisierung von hochmolekularen Superkomplexen aus mitochondrialen Membranen ermöglichen.

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Protokoll

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Alle Experimente wurden unter Verwendung von Herzen aus C57BL / 6N-Mäusen (Wildtyp) durchgeführt. Die Mäuse wurden vor der zervikalen Luxation mit CO 2 betäubt, und alle Verfahren wurden in strikter Übereinstimmung mit der Abteilung für Labortiermedizin an der Universität von Rochester und in Übereinstimmung mit dem Staatsrecht, dem Bundesgesetz und der NIH-Politik durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Rochester (Universitätsausschuss für Tierressourcen) genehmigt.

1. CN und BN PAGE

HINWEIS: Alle Geräte, die für BN und CN PAGE verwendet werden, müssen frei von Spülmittel sein. Um dies zu gewährleisten, waschen Sie alle Geräte mit 0,1 M Salzsäure, gefolgt von weitgehendem Spülen mit deionisiertem H 2 O.

  1. Vorbereitung
    1. Vorbereiten des Anodenpuffers, bestehend aus 25 mM Imidazol, pH 7,0, bei 4 ° C; Bei 4 ° C aufbewahren.
    2. Kathodenpuffer für CN oder BN PAGE vorbereiten.
      1. Für CN PAGE verwenden Sie 7,5 mM Imidazol und 50 mM Tricin; 0,5 g Natriumdeoxycholat und 0,2 g Laurylmaltosid pro Liter Puffer zugeben. Den pH-Wert auf 7,0 bei 4 ° C einstellen und bei 4 ° C lagern.
      2. Für BN PAGE verwenden Sie 7,5 mM Imidazol und 50 mM Tricin und stellen den pH-Wert auf 7,0 bei 4 ° C ein. Bei 4 ° C aufbewahren.
      3. Für hellblauen BN-Kathodenpuffer verwenden Sie 7,5 mM Imidazol und 50 mM Tricin. Den pH-Wert auf 7,0 bei 4 ° C einstellen und 20 mg Coomassie pro Liter Puffer zugeben. Bei 4 ° C aufbewahren.
    3. Extrahieren von Extraktionspuffer (EB) mit 50 mM NaCl, 50 mM Imidazol, 2 mM Aminocapronsäure und 1 mM EDTA. Den pH-Wert auf 7,0 bei 4 ° C einstellen und bei 4 ° C lagern.
    4. 3x Gelpuffer (verwendet für BN- und CN-Gele) mit 75 mM Imidazol und 1,5 M Aminocapronsäure vorbereiten. Den pH-Wert auf 7,0 bei 4 ° C einstellen und bei 4 ° C lagern.
    5. Bereiten Sie einen Beladungspuffer (LB) von 0,01 g Ponceau S, 5 g Glycerin und 5 ml H 2 O vor. Im Raum aufbewahrenTemperatur.
    6. Bereiten Sie Coomassie-Blau vor, indem Sie 50 mg Coomassie zu 1 ml 500 mM 6-Aminohexansäure hinzufügen. Den pH-Wert auf 7,0 bei 4 ° C einstellen und bei 4 ° C lagern.
    7. Bereiten Sie 20 mM und 200 mM Laurylmaltosid in H 2 O vor. Machen Sie Aliquots von 200 & mgr; l und lagern Sie sie gefroren. Das Waschmittel vor dem Gebrauch auftauen
3% bis 8% (mini) 4% bis 10% (maxi)
0,5 Gele (Licht) 0,5 Gele (schwer) 0,5 Gele (Licht) 0,5 Gele (schwer)
AAB (mL) 0,42 1.3 2.5 7.7
CN / BN-Puffer (ml) 1.6 1.6 8.5 8.5
H & sub2 ; O (ml) 2.7 1.4 14 6.3
Glycerin (g) 0 0,47 0 2.5
Volumen (ml) 4.72 4.77 25 25
APS (& mgr; l) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tabelle 1: Mengen der Zutaten, die 1 Mini- oder Maxi-PAGE gießen müssen. Die in dieser Tabelle verwendeten Volumina werden für 1 Mini- oder 1 Maxi-Gel, 1,5 mm dick berechnet. Das Volumen der AAB basiert auf einer 40% Stammlösung. Licht und schwer beziehen sich auf das KonzentratIon von AAB. APS und TEMED werden nach jeder Säule des Gradientenmischers mit AAB-Lösung gefüllt.

  1. Gießen und laufende Gele
    HINWEIS: Verwenden Sie 3-8% oder 4-10% Acrylamid / Bisacrylamid (AAB) Gradienten für CN oder BN Gele. Tabelle 1 fasst die Mengen an Puffer, AAB, H 2 O, Glycerin, Ammoniumpersulfat (APS) und Tetramethylethylendiamin (TEMED) für ein Mini-Gel (85 mm breit x 73 mm hoch x 1,5 mm dick) oder maxi-Gel (160 Mm breit x 200 mm hoch x 1,5 mm dick). Baugruppen aus Glasplatten mit CN- oder BN-Gelen können in einem Beutel mit ein paar ml 1x Gelpuffer gekühlt oder in Papiertuch eingewickelt werden, das mit 1x Gelpuffer für die Lagerung benetzt ist. Die Gele sind für bis zu einer Woche stabil.
    1. Um das Gel zu gießen, legen Sie den Gradientenmischer auf eine erhöhte Rührplatte, um sicherzustellen, dass das Gel durch die Schwerkraft in die vorbereitete Gelkammer fließt.
    2. Füllen Sie die Ausströmkammer des Gradientenmischers mit 4,77 / 25 mL (Mini / maxi) der schweren Lösung (mit einer höheren Konzentration von AAB).
    3. Schieben Sie den Stop-Cock-Anschluss vorsichtig zwischen der schweren und hellen Kammer und lassen Sie einen Tropfen Lösung, um auf die andere Seite zu gelangen.
      HINWEIS: Dies drückt Luftblasen aus dem Verbindungsrohr und dem Absperrhahn, wodurch ein Durchfluss zwischen den beiden Kammern verhindert wird. Dies kann nicht geschehen, wenn beide Seiten bereits gefüllt sind, weil der gleiche Druck die Blase daran hindern wird, sich zu bewegen.
    4. Füllen Sie die andere Kammer des Gradientenmischers mit 4,72 / 25 mL (Mini / Maxi) der Lichtlösung.
    5. Mit der schweren Lösung einen Rührstab in die Ausströmkammer geben und unter Rühren beginnen. Verwenden Sie eine Rührstab-Geschwindigkeit, die keine Blasenbildung verursacht.
    6. Schnelles Hinzufügen von APS und TEMED zu jeder Kammer, um die Polymerisation einzuleiten.
    7. Öffnen Sie die Verbindung zwischen den beiden Kammern des Gradientenmischers und lassen Sie ein paar Sekunden mischen, bevor Sie die Ausströmkammer öffnen, um das Gel zu gießen.
      HINWEIS: Gravity wiLl beide Kammern gleichmäßig ablassen und das Mischen des Lichts in die schwere Lösung wird langsam die Acrylamiddichte von der Unterseite zur Oberseite des Gels verringern. Verwenden Sie den gesamten Inhalt, der im Gradientenmischer ist, um das Gel zu gießen.
      1. Am Ende, sorgfältig montieren Sie den Kamm, mit den Brunnen in das Gel, um Blasen zu vermeiden und Schichtmischen.
    8. Sofort den Gradientenmischer mit Ethanol waschen, um jedes Gel auszuspülen. Mit Wasser abspülen und das zweite Gel gießen Lassen Sie die Gele polymerisieren (in der Regel weniger als 20 min wird für Mini-Gele benötigt).
    9. Um die Gele zu führen, montieren Sie sie in die Elektrodenmontageklemme und füllen Sie die mittlere / obere Kammer mit CN oder hellblauem BN-Kathodenpuffer. Warten Sie einige Minuten, um auf Lecks zu prüfen, bevor Sie Anodenpuffer der äußeren / unteren Kammer hinzufügen.
      1. Ziehen Sie die Brunnenkämme vorsichtig heraus und waschen Sie die Wells mit Kathodenpuffer mit einer Spritze oder einer Pipette.
      2. Führen Sie die Gele in einem kalten Raum (4 ° C) oder vollständig in Eis verpackt.
        1. Für CN Mini-PAGE, 100 V für die erste Stunde und 200 V bis fertig, in der Regel eine zusätzliche 1-1,5 h. Alternativ die CN Mini-PAGE bei 30-40 V über Nacht laufen lassen.
          HINWEIS: Der Fokus liegt hier auf hochmolekularen Proteinkomplexen, so dass Proteinkomplexe mit einem Molekulargewicht von weniger als 140 kDa aus dem Gel austreten. Kürzere Laufzeiten für die Elektrophorese können verwendet werden, um niedermolekulare Komplexe zurückzuhalten.
        2. Für BN maxi-PAGE verwenden Sie 100 V und führen die Gele über Nacht (ca. 18 h).
          HINWEIS: Der Strom wird sehr niedrig (<15 mA), so dass eine Stromversorgung, die diese Bedingungen verarbeiten kann, benötigt wird. Zu diesem Zeitpunkt können die Gele für IGA oder Immunoblotting verwendet werden. In einigen Fällen können Bänder oder Bahnen aus den Gelen mit einer Rasierklinge auf einer Glasplatte für die Elektroelution ausgeschnitten werden.
  2. Probenvorbereitung
    HINWEIS: Membran-gebundene mitochondriale Superkomplexe müssen aus th extrahiert werdenE innere mitochondriale Membran. Um mitochondriale Supercomplexe zu konservieren, verwenden Sie entweder frisch isolierte Mitochondrien oder Proben, die nur einmal eingefroren und aufgetaut wurden. Die unten aufgeführten Berechnungen / Volumina sind für Mini-Gele gegeben (der Brunnen eines 10-Well-Kamms in einem 1,5 mm dicken Gel hält bis zu 35-40 μl) und Maxi-Gelen (der Brunnen eines 15-Well-Kamms hält sich an 200 & mgr; l). Darüber hinaus speichern Sie ein Aliquot jeder Probe (meist 10 μl), um auf einem denaturierenden SDS-Gel für die Detektion des spannungsabhängigen Anionkanals (VDAC) als Ladesteuerung zu laufen.
    1. Legen Sie eine geeignete Menge ( z. B. 10-50 μg Protein für Miniringe und 50 - 200 μg für Maxi-Gel) von isolierten Mitochondrien oder Gewebehomogenat in Mikroröhrchen ein und zentrifugieren bei 17.000 xg für 10-15 min bei 4 ° C.
      HINWEIS: Dieser Schritt entfernt einige der löslichen mitochondrialen Matrix- und / oder zytosolischen Proteine.
    2. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie Extraktionspuffer zu der gewünschten Menge hinzuAuf das Gel aufladen Das Sediment sanft auf Eis auffrischen Falls gewünscht, füge hier eine allgemeine Protease-Inhibitor-Mischung hinzu.
      HINWEIS: Basierend auf der hier verwendeten Ausrüstung wurden 30 μl für ein Mini-Gel und 100 μl für ein Maxi-Gel verwendet, wobei das Protein / Puffer-Verhältnis auf nicht mehr als 2 μg Protein auf 1 μl Puffer beschränkt wurde.
    3. Add Detergens ( z. B. 2 μg Laurylmaltosid / 1 μg Protein, siehe die repräsentativen Ergebnisse und Diskussion für weitere Informationen).
      HINWEIS: Im Allgemeinen wird Laurylmaltosid verwendet, aber auch Digitonin kann verwendet werden.
    4. Inkubieren auf Eis für 20 min. Vorsicht mischen am Anfang und gelegentlich während der Inkubation durch Triturieren und / oder Rühren der Röhre.
    5. Zentrifugieren bei 17.000 xg für 10 min bei 4 ° C, um jegliche Membran- und Gewebefragmente zu entfernen.
    6. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre. Für CN-Proben wird 1 μl LB für je 10 μl Probenvolumen zugegeben; Das Gesamtvolumen der Probe sollte appEtwa 40 μl für ein Mini-Gel und 130 μl für ein Maxi-Gel. Bei BN-Proben füge Coomassie den Proben hinzu, so dass das Verhältnis von Farbstoff zu Waschmittel 1: 4 (w / w) beträgt.
    7. Laden Sie 30 und 120 μl der Proben in die Vertiefungen des Mini- oder Maxi-Gels. Verwenden Sie die restlichen 10 μl aus jeder Probe für das denaturierende SDS-Gel, um VDAC als Ladesteuerung zu detektieren.
    8. Zur Herstellung der Molekulargewichtsmarker löst man 1 Durchstechflasche einer hochmolekularen Kalibriermischung (siehe Tabelle der Materialien für weitere Informationen) in 60 μl BN / CN-Gelpuffer und fügt 120 μl H 2 0 und 20 μl hinzu PFUND. 15 μl pro Spur laden.
    9. Führen Sie die Gele wie in Schritt 1.2.9.2 umrissen aus.

2. In-Gel-Assays für Cx-I und Cx-V

HINWEIS: Die Assays werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nehmen Sie Fotos, Scans oder Bilder von den Entwicklungsbändern für die Dokumentation. (Wichtig) Proteine ​​können nicht aufgetragen werdenO Nitrozellulosemembranen nach Abschluss einer IGA.

  1. Cx-I-Assay
    1. Vorbereitung.
      1. Einen Testpuffer von 5 mM Tris in H 2 O mit einem pH-Wert von 7,4 vorbereiten; bei Raumtemperatur lagern.
      2. 10 mg NADH in 1 ml Assaypuffer auflösen. In Aliquots von 100 μl bei -20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren; Vermeiden Einfrieren und Auftauen.
      3. 25 mg Nitroblau-Tetrazolium in ein Mikroröhrchen wiegen.
      4. Das Fixiermittel durch Verdünnen von 5 ml Essigsäure in 95 ml H & sub2; O zubereiten; bei Raumtemperatur lagern.
    2. Durchführung des Assays
      1. Kombinieren Sie 10 ml Assaypuffer mit 25 mg Nitroblau-Tetrazolium (Endkonzentration: 2,5 mg / ml) und 100 μl 10 mg / ml NADH (0,1 mg / ml). Fügen Sie dies dem gesamten Gel, einer Spur oder einem interessierenden Bereich hinzu, der aus einem CN-Gel herausgeschnitten ist.
        HINWEIS: Dies kann in einem klaren Kunststoff- oder Glasbehälter erfolgen. Bitte beachten Sie, dass dieser Test nach BN PAGE nicht durchgeführt werden kann.
      2. Folgen Sie der Entwicklung der blauen Bänder nach sanfter Bewegung (Rocker) für> 3 min.
      3. Fixieren Sie das Gel in 10 - 20 ml Essigsäurelösung oder waschen Sie sich in 5 mM Tris, pH 7,4, um die Reaktion zu stoppen. Nehmen Sie Fotos für die Dokumentation (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Cx-V-Assay
    HINWEIS: Der Cx-V-Assay sollte mit doppelten CN- oder BN-Gelen durchgeführt werden, wobei man mit 5 μg / ml Oligomycin (einem Cx-V-Inhibitor) inkubiert wird, um eine Cx-V-unabhängige Aktivität zu zeigen.
    1. Vorbereitung.
      1. Einen Testpuffer mit 35 mM Tris und 270 mM Glycin vorbereiten; Den pH-Wert bei Raumtemperatur auf 8,3 einstellen. Lagern Sie den Puffer in 50-ml-Aliquoten eingefroren, aber überprüfen Sie den pH-Wert nach dem Einfrieren und Auftauen.
      2. 1 M MgSO 4 in H 2 O vorbereiten; Bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
      3. 27,28 mg Pb (NO 3 ) 2 in ein Mikroröhrchen wiegen.
      4. 60 mg ATP in ein Mikroröhrchen wiegen
      5. 1 mg o. AuflösenLigomycin in 1 ml Ethanol. Bei -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.
      6. Vorbereiten eines Fixiermittels durch Mischen von 50 ml Methanol mit 50 ml H & sub2; O; bei Raumtemperatur lagern.
    2. Durchführung des Assays
      1. Inkubieren eines Gels, einer Spur oder eines interessierenden Bereichs aus einem BN- oder CN-Gel für 2 h unter leichtem Rühren (Rocker) in 10-20 ml Assaypuffer ± 5 μg / ml Oligomycin (50-100 μl 1 mg / Ml in Ethanol) bei Raumtemperatur.
      2. Nach der Inkubation wird der Puffer mit 14 ml frischem Testpuffer ersetzt und in der Reihenfolge 190 μl 1 M MgSO 4 (14 mM), 27,28 mg Pb (NO 3 ) 2 (5 mM), 60 mg ATP ( 8 mM) und 75 & mgr; l Oligomycin (falls erforderlich).
      3. Inkubieren mit sanfter Bewegung (Rocker) und beobachten Sie auf einen weißen Niederschlag, da Banden auf Oligomycin-behandelten Gelen nicht-Cx-V-abhängige Banden geben.
        HINWEIS: Das Aussehen des Niederschlags kann mehrere Stunden dauern.
      4. Das Gel in Methanol-Basiertes Fixiermittel ( z. B. 50% Methanol), da saure Lösungen den Blei-Niederschlag auflösen. Fotografieren Sie die Ergebnisse.
        HINWEIS: Der Blei-Niederschlag stört nicht die Coomassie-Färbung der Gele.

3. Proteinübertragung auf Nitrocellulose oder Polyvinyliden-Difluorid (PVDF) Membranen

  1. Bereiten Sie einen Transferpuffer von 25 mM Tris und 200 mM Glycin vor. Den pH-Wert auf 8,3 einstellen und 0,0005 g / l SDS und 200 mL / l Methanol zugeben. Bei Raumtemperatur lagern.
    1. Schneiden Sie eine Nitrozellulose- oder PVDF-Membran (Porengröße: 0,45 μm) mit einer Rasierklinge oder einer Schere bis zu einer Größe, die etwas größer ist als die des Gels.
      ANMERKUNG: Nitrocellulosemembranen erlauben die Ponceau S-Färbung, um die Proteinbeladung zu beurteilen, während PVDF-Membranen schärfer definierte Banden ergeben.
  2. Protokoll.
    1. Tauchen Sie die Nitrozellulosemembran, das Filterpapier und die Schwämme für einMindestens 10 min im Transferpuffer. Legen Sie die PVDF-Membran in 100% Methanol für 15 s oder entsprechend der Empfehlung des Herstellers, bevor Sie ihn in den Transferpuffer legen. Legen Sie die offene Kassette des Transferkits in eine flache Schale mit Transferpuffer.
    2. Legen Sie den Schwamm und 1-2 Schichten Filterpapier auf die Rückseite der Kassette. Entfernen Sie die Blasen.
    3. Legen Sie das Gel auf das Filterpapier. Geben Sie die Orientierung des Gels an, indem Sie eine Ecke des Gels und / oder der Membran schneiden.
    4. Legen Sie die Membran auf das Gel. Alle Blasen entfernen
    5. Legen Sie Filterpapier und einen Schwamm auf die Membran. Entfernen Sie alle Blasen in diesem Sandwich.
    6. Schließen Sie die Kassette und legen Sie sie in den Kassettenhalter des Transferkits.
    7. Übertragen Sie die Proteine ​​bei 25 V für ca. 12-18 h.

4. Immunoblotting

  1. Vorbereitung.
    1. Bereiten Sie einen Ponceau-Stain (500 ml) durch Zugabe von 25 ml vorVon Essigsäure und 0,5 g Ponceau S zu 475 ml H 2 O; Bei Raumtemperatur lagern (kann wiederverwendet werden).
    2. Bereiten Sie Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Base und 2,7 mM KCl vor. Den pH-Wert auf 8,0 einstellen und bei Raumtemperatur lagern.
    3. TBS-Tween (TBST) durch Zugabe von 0,5 ml / l Tween 20 zu TBS zubereiten; bei Raumtemperatur lagern.
    4. Bereiten Sie Milchfeststoffe / TBST vor, indem Sie 5 g Milchfeststoffe in 100 ml TBST auflösen. Bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb von 3 Tagen verwenden.
    5. Bereiten Sie BSA / TBST vor, indem Sie 3 g Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V) in 100 ml TBST auflösen. Bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb von 3 Tagen verwenden.
  2. Protokoll.
    1. Wenn die Übertragung beendet ist, legen Sie die Membran in die Ponceau S-Lösung, um alle übertragenen Proteine ​​zu visualisieren. Beschriften Sie die Position der Marker auf der Membran mit einem Bleistift und dokumentieren Sie die Ponceau-S-gefärbte Membran durch Foto oder Scan.
    2. Waschen Sie die Membran 3 mal für 10 min jedes wiTh TBS unter sanfter Aufregung.
    3. Blockieren Sie die Membran mit Milchfeststoffen / TBST für 1-2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht in einem kalten Raum mit sanfter Bewegung.
    4. Die Membran für 10 min mit TBST unter leichtem Rühren waschen.
    5. Inkubieren mit primärem Antikörper über Nacht im kalten Raum unter leichtem Rühren. Verdünnen Sie den Antikörper ( zB 1: 1.000 für anti-ATP5A und -NDUFB6) in BSA / TBST.
      HINWEIS: Die meisten Antikörper geben ein besseres Signal auf Membranen aus nativen Gelen, wenn sie über Nacht inkubiert werden.
    6. Die Membran für 10 min mit TBST unter leichtem Rühren waschen.
    7. Inkubieren mit sekundärem Antikörper für mindestens 60 min bei Raumtemperatur und schon bei geringem Rühren. Verdünnen Sie den Antikörper (1: 5.000 bis 1: 50.000) in Milchfeststoffen / TBST.
    8. Die Membran 3 mal für 10 min bei Raumtemperatur mit TBST abschrecken.
    9. Während der letzten Wäsche, das verbesserte Chemolumineszenz (ECL) Substrat gemäß den Anweisungen des Manufa vorbereitenCturer
    10. Inkubieren Sie die Membran mit ECL-Substrat mit Anweisungen des Herstellers.
    11. Erfassen Sie das Signal auf dem Film unter Verwendung von Anweisungen, die vom Hersteller des ECL-Substrats bereitgestellt werden.

5. Elektrolyse

  1. Vorbereitung.
    1. Bereiten Sie einen Elutionspuffer von 25 mM Tricin, 3,75 mM Imidazol (pH 7,0 bei 4 ° C) und 5 mM 6-Aminohexansäure vor.
      HINWEIS: Bei der Handhabung der Elektroderuter- und Membrankappen die Handschuhe tragen, um eine Kontamination mit externen Proteinen zu vermeiden.
  2. Am Tag vor der Verwendung des Elektrogenerators für die native Elektroelution:
    1. Die Membrankappen (Cut-off: 3,5 kDa) im Elutionspuffer 1 h bei 60 ° C einweichen. Übertragen Sie die Kappen auf frischen Elutionspuffer und tränken Sie sie für 12 Stunden oder länger im Kühlschrank.
      HINWEIS: Ein Cut-off-Molekulargewicht von 3,5 kDa verhindert den Verlust von kleinen pRoteine, die sich leicht von dem interessierenden Proteinkomplex distanzieren können.
    2. Das Elektrodenmodul, Glasröhrchen, Tank und Deckel gründlich mit Ethanol waschen. Mit Wasser abspülen und die Ausrüstung trocknen lassen.
  3. Am Tag der nativen Elektroelution, folgendes tun.
    1. Legen Sie eine Fritte in den Boden (frosted) von jedem Glasrohr verwendet werden. Wenn nötig, legen Sie das Glasrohr in den Elutionspuffer und schieben Sie die Fritte von innen nach unten auf die Röhre.
    2. Schieben Sie die Glasröhre mit der Fritte in das Modul des Elektrogenerators. Die Durchführungshülse mit Elutionspuffer benetzen und die Glasröhre schieben. Stellen Sie sicher, dass die Oberseiten der Glasrohre sogar mit der Tülle sind.
    3. Schließen Sie die leeren Durchführungen mit Stopper.
    4. Legen Sie eine nasse Membrankappe an der Unterseite des Silikonadapters und füllen Sie den Adapter mit Elutionspuffer. Langsam den Puffer im Adapter nach oben und unten pipettieren, um Luftblasen um die Dialysemembran zu entfernen/ Li>
    5. Schieben Sie den Puffer-gefüllten Adapter auf die Unterseite des Glasrohres. Entfernen Sie alle Blasen, die auf der Fritte im Glasrohr erscheinen.
    6. Füllen Sie jedes Glasrohr mit Elutionspuffer.
    7. Legen Sie die ausgeschnittenen Bänder der BN PAGE in die Glasröhren (siehe Schritt 1.2.9.3). Schneide große Stücke in kleinere Stücke. Stellen Sie sicher, dass die Füllhöhe innerhalb des Glasrohres ca. 1 cm beträgt.
    8. Legen Sie das gesamte Modul in den Tank.
    9. Füge etwa 600 mL kalten Elutionspuffer zum Tank hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Silikonadapterkappen im Puffer sind, um Blasen an der Dialysemembran zu verhindern.
    10. Setzen Sie einen Rührstab an der Unterseite des Tanks.
      HINWEIS: Das Rühren verhindert, dass Blasen an der Unterseite der Dialysemembran haften.
    11. Eluiere die Proteine ​​für 4 h bei 350 V in einem kalten Raum.
    12. Nachdem die Elution beendet ist, entfernen Sie das Elektrodenmodul aus dem Pufferspeicher und legen Sie es in ein Waschbecken oder eine Schüssel.
    13. Wenn ein Stopper benutzt wurde, entfernen Sie ihn zu draIn der oberen Pufferkammer. Andernfalls verwenden Sie eine große Pipette, um den Puffer zu entfernen.
    14. Den Puffer von jedem Glasrohr entfernen und entsorgen. Achten Sie darauf, dass der Silikonadapter an Ort und Stelle bleibt und dass die Flüssigkeit unterhalb der Fritte nicht gestört oder geschüttelt wird.
    15. Entfernen Sie vorsichtig den Silikonadapter zusammen mit der Membrankappe von der Unterseite des Glasrohres. Den Inhalt (ca. 400 μl) der Silikonkappe in ein Mikroröhrchen pipettieren. Mit weiteren 200 μl Elutionspuffer spülen Sie die Silikonkappe und fügen Sie dem Mikroröhrchen hinzu. Wiederholen Sie für alle Glasröhren.
    16. Wenn die Membrankappen wiederverwendet werden können, bewahren Sie die Membrankappen auf, indem Sie sie in den Elutionspuffer geben, der 0,5 mg / ml Natriumazid enthält. Kühlen sie auf
      HINWEIS: Das Eluat hat eine geringe Proteinkonzentration und kann mit Hilfe von Zentrifugalfiltergeräten konzentriert werden.

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Ergebnisse

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Um mitochondriale Supercomplexe zu visualisieren, wurden frisch isolierte Mitochondrien von Mäusen 17 , 18 verwendet. Mitochondriale Supercomplexe sind empfindlich gegenüber wiederholten Zyklen des Einfrierens und Auftauens, was zu ihrer Desintegration führt, obwohl dies für einige Forscher tolerierbar sein kann. Wenn das Einfrieren für die Lagerung notwendig ist, um beste Ergebnisse zu erzielen, sollten die Proben nicht mehr als...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Für die mitochondriale ATP-Erzeugung ist ein funktionelles ETC erforderlich. Die Komplexe des ETC sind in der Lage, zwei Arten von Supercomplexen zu bilden: die respirasomen (Cx-I, -III und -IV) 1 und die Synthasomen (Cx-V) 2 . Die Montage jedes Komplexes ist für eine intakte ETC erforderlich, während die Organisation des ETC in Supercomplexe die Gesamt-ETC-Effizienz 5 , 22 erhöhen soll. Wie diese Supercomplexe zus...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] und der Starken Kinder-Forschungszentrum an der University of Rochester.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Protean II Mini-Gel-KammerBiorad1658004Komplettset zum Gießen und Ausführen von Mini-Gel-Elektrophorese
Protean XL Maxi-GelBiorad1653189Komplettes Set zum Gießen und Ausführen von Maxi-Gel-Elektrophorese
Gradientenhersteller, Hoefer SG15 VWR95044-704von Mini-Gel-Gradienten Gradientenhersteller
, Maxi-GelVWRGM-100Gießen von Maxi-Gel
Gradienten TransferkitBiorad1703930Komplettset für den Nasstransfer von Proteinen auf Membranen
Elektroeluter Modell 422Biorad1652976Elektroelution von Proteinen aus nativen oder SDS PAGES
GlasplattenBiorad1653308Kurzplatten
GlasplattenBiorad1653312Spacerplatten
GlasplattenBiorad1651823Innenplatten
GlasplattenBiorad1651824Außenplatten
NetzteilBiorad1645070Netzteil geeignet für native Elektrophorese
ECL-Western Thermo Scientific32209Chemolumniscense-Substrat
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Erweitertes Chemolumniscense-Substrat
Film/Autoradiographie-FilmGE Health Care28906845Dokumentation von Western Blots
Filmprozessor CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640CanonNAFotografieren zum Dokumentieren von Gelen, Membranen und Blots.
Canon Power Shot 640 Kamera-HaubeCanonAbschirmkamera für Fotos, die auf einem Leuchttisch aufgenommen werden
Acrylamid/BisacrylamidBiorad161014840%ige vorgemischte Lösung
GlycinSigmaG7403
SDS (Natriumdodecylsulfat)Invitrogen15525-017
Tris-BaseSigmaT1503Puffer
TricinSigmaT0377
NatriumdesoxychelatSigmaD66750Reinigungsmittel
EDTASigmaE5134
SaccharoseSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Puffer
ImidazolSigmaI15513Puffer
LaurylmaltosidSigmaD4641Reinigungsmittel
Coomassie G250Biorad161-0406
AminohexansäureSigmaO7260
Native  MolekulargewichtskitGE Gesundheitswesen 17-0445-01Kalibrierkit mit hohem Molekulargewicht für die native Elektrophorese.
NameUnternehmenKatalognummer<strong>Kommentare
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigma N6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
NameCompanyKatalognummer>Kommentare
Lead(II)-nitrat (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomycinSigmaO4876
NameFirma>KatalognummerKommentare
Ponceau S SigmaP3504
anti-ATP5A Abcamab14748Antikörper gegen ATP-Synthase-Untereinheit ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244Antikörper gegen Cx-1 Untereinheit NDUFB6
anti-VDACCalbiochem529534Antikörper gegen VDAC
ECL HRP linked antibodyGE Health CareNA931VSekundärantikörper gegen ATP5A, NDUFB6 und VDAC
BlockierungsreagenzBiorad170-6404
BSA
NatriumchloridSigmaS9888
KaliumchloridSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Silber-FärbesetInvitrogenLC6070
Gießen strong

Referenzen

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