DiI Perfusion als Methode zur vaskulären Visualisierung in Ambystoma mexicanum

Zusammenfassung

Unter Verwendung einer lipophilen 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI) -Färbetechnik kann Ambystoma mexicanum eine vaskuläre Perfusion durchlaufen, um eine leichte Visualisierung des Gefäßsystems zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Perfusionstechniken wurden seit Jahrhunderten verwendet, um die Zirkulation von Geweben zu visualisieren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) ist eine Spezies von Salamander, die als ein wesentliches Modell für Regenerationsstudien entstanden ist. Es ist wenig bekannt, wie die Revaskularisierung im Zusammenhang mit der Regeneration bei diesen Tieren auftritt. Hier berichten wir über eine einfache Methode zur Visualisierung des Gefäßsystems in Axolotl über Perfusion von 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin perchlorat (DiI). DiI ist ein lipophiler Carbocyaninfarbstoff, der sofort in die Plasmamembran von Endothelzellen eindringt. Die Perfusion erfolgt mit einer peristaltischen Pumpe, so dass DiI durch die Aorta in die Zirkulation gelangt. Während der Perfusion fließt der Farbstoff durch die Blutgefäße des Axolotls und schließt sich bei Kontakt in die Lipiddoppelschicht von vaskulären Endothelzellen ein. Das Perfusionsverfahren dauert etwa eine Stunde für ein Acht-Zoll-Axolotl. Unmittelbar nach Perfusion wiDas Diolotl kann mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop visualisiert werden. Der DiI emittiert Licht im rot-orange Bereich, wenn er mit einem grünen Fluoreszenzfilter angeregt wird. Dieses DiI-Perfusionsverfahren kann verwendet werden, um die vaskuläre Struktur von Axolotten zu visualisieren oder Muster der Revaskularisierung in regenerierenden Geweben zu demonstrieren.

Einleitung

Die Visualisierung der Vaskulatur spielt eine wesentliche Rolle beim Verständnis der Struktur und Funktion von Organismen über viele Arten hinweg. Ab dem 16. Jahrhundert mit Leonardo da Vinci wurden Modelle und grafische Darstellungen der Zirkulation untersucht ¹ . Mit Hilfe von Wachs und Gummi-Formen wurden Gewebe perfundiert, um dreidimensionale Modelle des Gefäßsystems zu schaffen, die das Studium der Organogenese und Pathogenese ^{1 , 2} erlaubten. Harze und Wachse wurden mit Farbstoffen wie Indien Tinte oder Karminrot gefärbt, um ihre einfache Visualisierung zu ermöglichen ^{1 , 2} . Allerdings verursachten diese Techniken viele Probleme, weil ihre hohen Viskositäten eine vollständige Perfusion des interessierenden Gewebes verhinderten. Als das Feld anspruchsvoller wurde, kam die Verwendung von konfokalen und Elektronenmikroskopen ins Spiel, indem er die Perfusionstechnologie bewegte Ues weg von Gussformen und zu flüssigen Perfusionen des Gefäßsystems, von denen einige die Perfusion und Bildgebung von Blutgefäßen erlaubt haben, ohne das anfängliche Gewebe ³ zu zerstören. DiI, ein fluoreszierender Carbocyaninfarbstoff, ist ein solcher Fleck, der die Perfusion von Tieren ohne Beschädigung des Gefäßgewebes ermöglicht.

Carbocyaninfarbstoffe sind lipophile Farbstoffe, die bei Kontakt in Zellmembranen einfließen. Diese Farbstoffe ermöglichen eine einfache und sofortige Färbung von vaskulären Endothelzellen, die dann unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop betrachtet werden können. DiI bewegt sich über laterale Diffusion in der Lipidmembran von Zellen, wie in der Markierung und Verfolgung von Neuronen gezeigt ⁴ . Chemikalisch geben die beiden Alkylketten von DiI dem Farbstoff seine hohe Affinität für Zellmembranen, während zwei konjugierte Ringe aus einem Fluorochrom, das für die Emission einer roten Wellenlänge verantwortlich ist, wenn es durch grüne Fluoreszenzlichtfilter angeregt wird> 4 DiI wurde in vielen Kapazitäten eingesetzt, darunter die erfolgreiche Markierung der Plasmamembran und sowohl die anterograde als auch die retrograde Markierung in den Neuronen ^{5 , 6} . DiI wurde zuvor in Perfusionsprotokollen verwendet, während das Vaskulatur von Mäusen sichtbar gemacht wurde ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) sind Salamander, die exklusiv in Brackseen in der Nähe von Mexiko-Stadt, Mexiko leben. Diese Tiere sind zu einem wichtigen Modell für das Verständnis von regenerativen Prozessen geworden, da sie ganze Gliedmaßen, Schwanz (einschließlich Nervenkabel), Teile des Herzens und anderer innerer Organe und Teile des Auges als Erwachsene ^{8 , 9} regenerieren ^können . Darüber hinaus ist mit der jüngsten Anwendung von genetischen Werkzeugen in Axolotten ein beispielloser Einblick in die Moleküle und Zellen, die diese Prozesse durchführen, nun möglich ⁸ . Das erfolgreiche regeneDie Ration eines ganzen Gliedes erfordert einen umfangreichen Revaskularisierungsprozess, der bei der Regeneration eine wesentliche Rolle spielen kann, die über die traditionellen Funktionen der Blutgefäße bei der Bereitstellung von Sauerstoff und Nährstoffen hinausgeht. Das Verständnis der Revaskularisierung im Kontext der Geweberegeneration ist zwingend erforderlich. Axolotl-Blutgefäße wurden zuvor mit India Ink visualisiert, und während die Ergebnisse faszinierend waren, wurde dieser Prozess in den folgenden Jahrzehnten nicht erneut besucht ¹⁰ . Wir suchten ein DiI-Perfusionsprotokoll anzupassen, das für den Einsatz in Säugetieren entwickelt wurde, um eine vollständige Perfusion und Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die erfolgreich durchgeführt wurden, um die Axolotl-Zirkulation erfolgreich mit einer DiI-Färbetechnik zu visualisieren und anschließend zu visualisieren. Diese Vorgehensweise ermöglicht eine genaue Visualisierung von Patentblutgefäßen in homöostatischen Geweben sowie in regenerierenden Geweben und stellt eine neuartige Methode zur Visualisierung zur VerfügungN und Analyse des Revaskularisierungsprozesses im Axolotl.

Protokoll

Alle Axolotl-Experimente wurden in Übereinstimmung mit Brigham und Women's Hospital (BWH) Institutional Animal Care und Use Committee durchgeführt.

1. Perfusionsexperiment einrichten

1. Legen Sie ein erwachsenes Axolot in einen mit 0,1% Triacinlösung (MS222) gefüllten Plastikbehälter für 15-20 min oder bis vollständig anästhesiert. Stellen Sie sicher, dass der Behälter mit genügend Triacin-Lösung gefüllt ist, so dass das Axolotl vollständig untergetaucht ist.
   Hinweis: Alle Verfahren müssen gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierpflege durchgeführt werden. Bei BWH wird ein Axolotl als vollständig betäubt betrachtet, wenn es einen Fuß-Prise-Test versagt, dh es gibt keine reflexive Bewegung, wenn der Fuß sanft gequetscht wird.
   Achtung: Obwohl Tricaine ein Anästhetikum ist, das speziell für Wasserorganismen verwendet wird, sollte ein direkter Hautkontakt mit der Tricainlösung vermieden werden.
2. Richten Sie die Axolotl-Perfusionsstation ein.
   1. Setze dasAbsorbierende Auflage auf einer ebenen, ebenen Oberfläche mit der nach oben weisenden Seite.
   2. Schneiden Sie ein Loch in den Polystyrol-Schaumrahmen, der die passende Größe und Form für das anästhesierte Axolotl ist, um in der Rückenlage zu liegen. Legen Sie den Rahmen auf das saugfähige Pad.
      Hinweis: Einige zusätzliche Papiertücher können sofort unter dem Rahmen für zusätzliche Saugfähigkeit platziert werden.
   3. Die peristaltische Pumpe mit dem Perfusionsschlauch beladen. Stellen Sie die Pumpe auf eine Durchflussrate von 0,7 ml / min ein, die im Uhrzeigersinn fließt.
   4. Mischen Sie die Verdünnungslösung mit 0,7x PBS und 5% Glukose in einer 1: 4 Mischung.
   5. Mischen Sie 10 ml Verdünnungslösung mit 200 μl der DiI-Stammlösung in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cap und Mix durch Inversion. Decken Sie diesen Schlauch mit Aluminiumfolienpapier ab, um die Arbeitslösung vor Lichteinwirkung zu schützen.
      Hinweis: Die Volumina sollten entsprechend der Größe des Axolotls proportional geändert werden. Diese Werte sind für eine ca. 15 cm axolotl (Schnauze-zu-Schwanz-Länge). EINNaturen dieser Größe haben möglicherweise nicht die volle Geschlechtsreife erreicht, so dass Tier Sex nicht zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden kann.
   6. Füllen Sie ein 50 mL konisches Rohr mit 0,7x PBS.
      Hinweis: PBS wird für die Priming der Schleife und Axolotl Exsanguination verwendet werden.
   7. Befestigen Sie die 27-Gauge-Schmetterlingsnadel am Austrittsende des Perfusionsschlauches. Falten Sie die Schmetterlingsflügel aufeinander und legen Sie sie in den Klemmenständer.
   8. Legen Sie das freie Ende des Perfusionsschlauches in das 50 mL konische Rohr, das mit 0,7x PBS gefüllt ist, und führen Sie die Perfusionspumpe, bis der gesamte Schlauch mit einer Lösung gefüllt ist. Pausieren Sie die Pumpe, sobald der gesamte Schlauch mit PBS gefüllt ist.
      Hinweis: Achten Sie darauf, dass der Schlauch jederzeit frei von Luftblasen ist, da diese Luft in den Axolotl bringen und eine vollständige Perfusion verhindern.
   9. Legen Sie ein Papiertuch in die axolotlförmige Form im Polystyrol-Schaumstoffrahmen. Mit einer Transferpipette das Tuch mit Triacinlösung einweichen.
      Anmerkung: Schneiden Sie ein kleines Quadrat in der Mitte des PapiertuchesEl, um die Drainage von Flüssigkeiten während des Perfusionsverfahrens zu ermöglichen.
   10. Legen Sie die anästhesierte Axolotl Rücken auf das Papiertuch im Polystyrol-Schaumstoffrahmen.

2. Eröffnung der Axolotl Brust

1. Benutze chirurgische Pinzette, um die Haut entlang der Mittelachse der Axolotl-Brust zu knacken, knapp unterhalb der Schulterlinie. Nach oben ziehen
2. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt zu machen, wo die Haut gezogen wurde.
3. Entfernen Sie einen quadratischen Fleck der Haut über die Brust, um zwei Knorpelplatten zu enthüllen.
   1. Entfernen Sie die Haut, um ein Fenster über die Thoraxhöhle zu öffnen, das groß genug ist, um das Herz deutlich zu sehen und ungefähr 5 mm der Aorta, die vom Herzen abzweigt.
4. Das Bindegewebe sorgfältig mit einer Pinzette oder der geschlossenen Schere zerreißen, um das Entfernen von größeren Blutgefäßen zu vermeiden.
5. Heben Sie jede Knorpelplatte einzeln mit der Pinzette an und verbrauchen sie wMit der chirurgischen Schere.
6. Sorgfältig das Perikard mit der Pinzette einklemmen, hochziehen und mit der chirurgischen Schere punktieren; Dieser Einschnitt sollte gerade tief genug sein, um das sehr dünne Perikard zu durchstechen und sollte groß genug sein, um die Entfernung des Perikards zu ermöglichen. Achten Sie darauf, das Herz nicht zu schneiden.
7. Zartes das Perikard entfernen, um das Herz und die Aorta auszusetzen.
   Hinweis: Verwenden Sie eine Transferpipette, periodisch spülen Sie die Brusthöhle und die Kiemen mit Tricain-Lösung, um den Bereich klar zu halten und halten Sie die Axolotl anästhesiert.

3. Perfusion des Axolotl

1. Legen Sie den Klemmenständer mit der beladenen Schmetterlingsnadel neben dem Polystyrol-Schaumstoffrahmen, so dass der Arm der Klemme leicht manipuliert werden kann, um die Nadel in die Axolotl-Aorta einzuführen. Richten Sie die Nadelspitze auf den rostralen Aspekt des Tieres während der Insertion und halten Sie die Nadel parallel zur Aorta, um zu vermeiden, dass sie durch die opPosite Seite.
2. Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein. 0,7x PBS sollte weiterhin durch Schlauch fließen.
3. Setzen Sie die Nadel in die Aorta ein.
   1. Schieben Sie die Pinzette unter den Aortenbogen und ziehen Sie leicht nach unten, um einen leichten Zugang zu ermöglichen.
   2. Manövrieren Sie die Nadel-Klemm-Kombination, so dass die Nadel entlang der Länge der Aorta läuft und nach oben zum Kopf zeigt. Setzen Sie die Nadel ein, während Sie die Pinzette für die Unterstützung hinter der Aorta verwenden.
      Hinweis: Die Nadel sollte tief genug in die Aorta eingesetzt werden, um sicherzustellen, dass sie während der Perfusion nicht ausrutscht. Dies kann etwa 5 mm für ein 15 cm Axolotl sein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel perfekt mit der Aorta in Einklang steht, um eine vollständige Punktion des Schiffes zu vermeiden. Durch-und-Durchgangsdurchgänge können massive Blutung verursachen und die Erfolgsquoten der Perfusion verringern. Eine erfolgreiche Einfügung kann durch eine sichtbare Vergrößerung der Herzmuster des Herzens bestätigt werden.
4. Schnell zerreißt ein Atrium mit dem sciSsors und lassen Blut abtropfen lassen.
   1. Spülen Sie mit Tricain-Lösung, um Blutansammlung und Gerinnselbildung in der Brusthöhle zu verhindern.
5. Perfekt das Axolot mit etwa 20-30 ml PBS. Das Tier sollte von hellrosa in Farbe zu Weiß in einer erfolgreichen Perfusion wechseln.
6. Pausieren Sie die peristaltische Pumpe und bewegen Sie das freie Ende des Schlauches in das 15 ml Rohr der DiI-Lösung. Starten Sie die Pumpe neu, achten Sie darauf, keine Luftblasen im Schlauch zu erzeugen.
7. Setzen Sie den Axolotl mit dem gesamten Arbeitsmaterial von DiI ein.
   Anmerkung: In einer erfolgreichen Perfusion, die Axolotl mit Veränderung Farbe auf die helle rosa der DiI. Das wird am deutlichsten in den Kiemen.
8. Pausieren Sie die Pumpe, nachdem die Perfusion mit DiI abgeschlossen ist und legen Sie das freie Ende des Schlauches in 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung, um das Gewebe zu fixieren. Starten Sie die Pumpe neu und benachrichtigen Sie mindestens 10 ml PFA.
   Achtung: PFA ist giftig und sollte gehandhabt und dispo seinSed von angemessenem. Handschuhe und Schutzbrillen sollten getragen werden, und Lösungen sollten in einer Dunstabzugshaube hergestellt werden. Die Perfusion des Axolotls mit PFA zur Fixierung des Gewebes führt zum Tod des Tieres.

4. Beenden der Perfusion und Visualisierung Vorbereitung

1. Stoppen Sie die peristaltische Pumpe und entfernen Sie die Nadel aus der Axolotl-Aorta.
2. Legen Sie das Axolotl auf eine Plastikplatte.
   Anmerkung: Die Verwendung einer Hälfte einer großen Petrischale funktioniert gut und ermöglicht das Gießen einer kleinen Menge Tricaine oder PBS auf das Axolotl, um seine Haut nass zu halten und die Visualisierungsqualität zu verbessern.
3. Entsorgen Sie alle verwendeten Materialien in den entsprechenden Abfallbehältern. Saubere chirurgische Werkzeuge mit 70% Ethanol, desinfizieren mit einem Glasperlen-Sterilisator zwischen den Tieren und sterilisieren durch Autoklavieren nach dem Verfahren. Schlauch mit der PBS-Lösung spülen und abtropfen lassen, vollständig abtrocknen und zur weiteren Verwendung aufbewahren.

5. Visualisierung der perfundierten Axolotl

1. Lege das Axolotl unter ein fluoreszierendes konfokales Mikroskop.
2. Schalten Sie die Lichter aus, da die Visualisierung der DiI-gefärbten Gefäße durch Licht beeinträchtigt wird.
3. Verwenden Sie einen grünen Fluoreszenz-Emissionsfilter-Würfel ( zB ET-CY3) mit dem konfokalen Mikroskop, um die Vaskulatur des Axolotls zu visualisieren. Verwenden Sie Anregungslicht der Wellenlänge 545 nm.
   Hinweis: Um ein Bild von hoher Qualität zu erhalten, können folgende Parameter verwendet werden: Belichtung für 1,1 s, Verstärkung von 1x, Sättigung von 1,0, Vergrößerung von 2X.

Ergebnisse

Mit der DiI-Färbung kann die Vaskulatur des Axolotls leicht sichtbar gemacht werden. Blutgefäße von Tieren, die mit dem lipophilen Farbstoff perfundiert wurden, sind sofort unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop sichtbar. Abbildung 1: 1-1.5 ist eine schematische Darstellung des Perfusionsprotokolls. Nach der Perfusion mit dem hellen rosa Farbstoff wird ein erfolgreich perfundiertes Axolotl rosa erscheinen. Mit ein...

Diskussion

Die Visualisierung der Vaskulatur des Axolotls kann erfolgreich durch Perfusion mit dem lipophilen Carbocyaninfarbstoff DiI erreicht werden. In dieser Studie beschreiben wir ein neuartiges Protokoll für die Perfusion des Axolotls mit DiI mit einer peristaltischen Pumpe. Wir zeigen auch die anschließende Visualisierung des Axolotl-Gefäßsystems mit einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop. Dieses Protokoll war eine Anpassung des Nagetier-DiI-Perfusionsprotokolls, das in Li et al. ⁷ , ab...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Peristaltische Pumpe	Marshall Wissenschaftlich	RD-RP1
Perfusionsschlauch	Excelon Lab & Vakuumschlauch	436901705	Größe S1A
27g Schmetterlingsnadel	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Destilliertes Wasser
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glukose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- Tetramethylindocarbocyanin-Perchlorat	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Chirurgische Foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrolschaum Rahmen			jedes Polystyrolschaum Quadrat mit einem Axolotl-förmigen  ausgeschnittenen
Chirurgischen Schere	Medline	DYND04025
Skalpell	Medline	MDS15210
Saugfähige Unterlage	Avacare Medical	PKUFSx
Papierhandtücher
Standard Einweg-Transferpipette	Fisherbrand	50216954
Klemmständer	Adafruit	291
Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat	Sigma Aldrich	E10521	Tricain Pulver
Erwachsene Axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Kunststofftanks			Unterschiedliche Größe passend für den Axolotl
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Mikroskop	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluoreszenzfilter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222