Vorbereitung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark Mesenchymale Stammzellen für potentielle Zytoplasma-Ersatztherapie

Zusammenfassung

Altersbedingte Krankheiten sind mit mehreren Defekten in Komponenten des Zytoplasmas verbunden. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung von Plasmamembran-Vesikeln aus Knochenmark-Mesenchym-Stammzellen. Diese Technik könnte potentiell als Mittel zur Zytoplasma-Ersatztherapie verwendet werden, um altersbedingte Phänotypen zu lindern oder sogar umzukehren.

Zusammenfassung

Wir haben bisher über die Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs) durch die mechanische Extrusion von Säugetierzellen berichtet. Die Fusion von PMVs mit mitochondrialen defizienten Rho0-Zellen stellte die Mitoseaktivität unter normalen Kulturbedingungen wieder her. Atherosklerose, Typ-2-Diabetes, Alzheimer-Krankheit und Krebs sind altersbedingte Erkrankungen, von denen berichtet wurde, dass sie mit mehreren mechanischen und funktionellen Defekten im Cytosol und Organellen einer Vielzahl von Zelltypen assoziiert sind. Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) stellen eine einzigartige Zellpopulation aus dem Knochenmark dar, die Selbsterneuerungsfähigkeiten besitzen und gleichzeitig ihre Multipotenz beibehalten. Die Ergänzung von Seneszenzzellen mit dem jungen Zytoplasma aus autologen BMSCs über die Fusion von PMVs bietet einen vielversprechenden Ansatz, um altersbedingte Phänotypen zu verbessern oder sogar umzukehren. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von PMVs aus BMSCs durch Extrusion durch eine Polycarbonatmembran mit 31, m Poren, bestimmen die Existenz von Mitochondrien und untersuchen die Aufrechterhaltung des Membranpotentials innerhalb von PMVs unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops, konzentrieren PMVs durch Zentrifugation und führen die In-vivo- Injektion von PMVs in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen durch.

Einleitung

Eine enorme Menge an Aufwand wurde der Etablierung von Ansätzen für Gen-, Enzym- und Zellersatztherapien gewidmet. Dies führte zu großen Durchbrüchen und sogar klinischen Anwendungen ^{1 , 2 , 3} . In jüngster Zeit wurde eine umstrittene Mitochondrien-Ersatztherapie auf Basis der Nukleustransfertechnologie auf die In-vitro- Fertilisation für Frauen im Alter angewendet oder mit einer tödlichen mitochondrialen DNA-Mutation ⁴ assoziiert. Defekte, die bei altersbedingten Krankheiten, einschließlich Atherosklerose, Typ-2-Diabetes, Alzheimer-Krankheit und Krebs, gefunden werden, sind in der Regel facettenreich. Es wurde dokumentiert, dass die Ansammlung von Lipidtröpfchen; Die Ablagerung von Amyloidprotein; Die Beibehaltung von entfalteten Proteinen im endoplasmatischen Retikulum; Und defektes Proteasom, Autophagosom und Mitochondrien tragen zur Entwicklung oder Verschlimmerung dieser Krankheiten bei"Xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Gegenwärtig gibt es keinen verfügbaren Mechanismus zur direkten Sanierung von Fehlfunktionen im Cytosol und Organellen, die Seneszenz und Alterung Phänotypen verursacht.

Wir haben bisher über die Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs) durch die mechanische Extrusion von Säugetierzellen ¹² berichtet. Mit Ausnahme des Kerns wurden in PMVs Komponenten in der Membran oder Cytosol einschließlich Proteine ​​und RNA sowie die Organellen wie Mitochondrien gefunden. Im Wesentlichen kann ein PMV als eine Miniatur-Enkernzelle betrachtet werden. Noch wichtiger ist, dass die Fusion von PMVs mit mitochondrien-defizienten Rho0-Zellen die Mitoseaktivität unter normalen Kulturbedingungen wiederherstellte. Dies ist der erste bericht auf establiEinen potenziell effizienten Ansatz für die Zytoplasma-Ersatztherapie.

Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind multipotenten Vorläuferzellen, die routinemäßig aus dem Knochenmark erzeugt werden und in Kultur leicht expandiert werden. Embryonale Stammzellmarker Oct4, Nanog und SOX2 wurden bei niedrigen Werten in MSCs ¹³ nachgewiesen. Telomerase-Aktivität ist auch messbar. Darüber hinaus machen die Abwesenheit von co-stimulierenden Molekülen und menschlichen Leukozyten-Antigen (HLA) Klasse-II-Molekülen sowie einer niedrigen HLA-Klasse-I-Expression auf MSCs ideale ideelle Zellen für die allogene oder "off-the-shelf" Sowohl regenerative Medizin als auch immunmodulatorische Anwendungen ¹⁴ .

Hier beschreiben wir, wie man PMVs aus Maus-BMSCs durch Extrusion durch eine Polycarbonat-Membran mit 3-Poren-Poren herstellt, die Existenz von Mitochondrien bestimmt und die Aufrechterhaltung des Membranpotentials in PMVs mit confoc untersuchtAl-Mikroskopie, konzentrierte, aber nicht aggregierte PMVs durch Zentrifugation vorbereiten und die In-vivo- Injektion von PMVs in den Gastrocnemius-Muskel von Mäusen durchführen.

Protokoll

8 bis 12 Wochen alte BALB / c-Mäuse wurden von Shanghai Experimental Animal Center (Shanghai, China) gekauft und in einer spezifischen pathogenfreien und klimatisierten Tieranlage aufgewachsen. Tierpflege und experimentelle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Labortieren von Shantou University.

1. Montage des Gerätes

1. Um die Sterilität zu gewährleisten, schalte das UV-Licht einer Gewebekulturhaube für 30 Minuten vor dem Gebrauch ein.
2. Schrauben Sie eine Einweg-25-mm-Filtereinheit ab und tauchen Sie die Kappe und den Boden des Gerätes in eine 200 ml Glasschale, die mit 75% Ethanol für 30 min gefüllt ist. Das Gerät besteht aus medizinischem Polypropylen.
3. Heben Sie die Kappe und die Unterseite des Gerätes mit Pinzette auf, schütteln Sie das restliche Ethanol von Hand ab und lassen Sie die Teile 10 Minuten lang in der Haube an der Luft trocknen.
4. Netzen Sie eine 19-mm-Polycarbonat-Membran in PBS und legen Sie sie sorgfältig auf die Trägermatrix des bottoM der Einheit. Der Polymerfilm hat eine glatte, flache Oberfläche und streifengeätzte 3 μm Poren.
5. Das Gerät wieder zusammenbauen, indem man die Kappe fest gegen den Boden schraubt. Vergewissern Sie sich, dass die Membran nicht aus der Mitte verschoben ist.
6. Entfernen Sie die Nadel einer 1 mL Insulinspritze und ziehen Sie 1 ml PBS. Bringen Sie die Spritze an die Filtereinheit an und drücken Sie dann PBS durch das Gerät, um die Baugruppe zu benetzen und zu prüfen, ob Leckage vorliegt.

2. Erzeugung von Plasmamembran-Vesikeln (PMVs)

1. Stellen Sie eine BMSC-Kultur her, wie von Nemeth et al. ¹⁵ , in DMEM-Kulturmedium, enthaltend 15% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte in einem befeuchteten Inkubator, der 5% CO ₂ bei 37 ° C enthält.
2. Um die Zellen zu vermehren, entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie den Brunnen mit 0,5 ml Calcium-freiem PBS aus.
3. Füge 0,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und inkubiere die Zellen bei 37 ° CFür 3 min. Tip die Platte gegen die Handfläche ein paar Mal, um die Zellabteilung zu erleichtern. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium.
4. Sammeln Sie die Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen und drehen Sie bei 200 xg für 2 min in einer Tischzentrifuge. Resuspendieren der Zellen in 4 ml Kulturmedium und aliquotieren die Zellen in zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte.
   ANMERKUNG: Zellen erreichen in der Regel etwa 24 Stunden bei Konfluenz.
5. Um PMVs zu erzeugen, ernten Sie die Zellen aus einer Vertiefung (etwa 5 x 10 & ^sup5; Zellen) einer 6-Well-Platte durch Trypsinverdauung und monodispers die Zellen in 0,5 ml Kulturmedium.
6. Legen Sie die Zellen in die Insulinspritze, befestigen Sie sie an der Filtereinheit und schieben Sie den Kolben schnell, um die Zellen durch den Filter zu quetschen. Verwerfe das extrudierte Medium, da es nur wenige PMVs darin geben sollte.
7. Laden Sie weitere 0,5 ml Medium in die Spritze und schieben Sie ihn schnell durch den Filter. Gesammelt das Medium der zweiten Extrusion, die enthaltenS PMVs von unterschiedlicher Größe.
8. Legen Sie 150 μl des gesammelten Mediums in eine 35-mm-Glasbodenschale und lassen Sie die PMVs ca. 10 min auf den Boden absetzen. Untersuche die PMVs unter einem invertierten Phasenkontrastmikroskop, das mit einer CCD-Kamera mit dem 20X Objektiv ausgestattet ist.

3. Prüfung der Inhalte innerhalb der PMVs mit konfokaler Mikroskopie

1. Um die Transfektion in den BMSCs durchzuführen, verdünnen Sie 2 μg supercoiled Plasmid DNA und 6 μl kationisches Transfektionsreagenz ( zB PolyJet) in 50 μl serumfreiem DMEM. Vortex, um gut zu mischen und kurz zu drehen, um alle Flüssigkeit von den Seiten des Rohres zu sammeln.
2. Die verdünnte Lösung (aus Schritt 3.1) tropfenweise in verdünnte DNA-Lösung geben, 1 Minute stark abtexen, kurz drehen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Ersetzen Sie das alte Medium auf die BMSCs, die bei etwa 30% Konfluenz über Nacht mit 2 ml frischem Kulturmedium ausgesät wurden und DN hinzufügenEine Transfektionsmischung tropfenweise
4. Ersetzen Sie mit 2 ml frischem Medium nach 12 h Transfektion.
5. Um zytoplasmatisch lokalisierte Proteine ​​zu verfolgen, transfizieren die Zellen mit dem Plasmid, das eine EGFP-Expressionskassette (pEGFP-N1) enthält, wie oben beschrieben. Ernte die Zellen durch Trypsin-Verdauung 48 h nach der Transfektion zur PMV-Erzeugung, wie oben beschrieben.
6. Um die Mitochondrien zu verfolgen, färben Sie die Zellen mit dem mitochondrialen Farbstoff (1 μM, MitoTracker) in frischem Kulturmedium für 30 min bei 37 ° C.
7. Um das Membranpotential der Mitochondrien zu detektieren, färben Sie die Zellen mit dem Cyaninfarbstoff JC-1 (5,5 ', 6,6'-Tetrachlor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyaninjodid) (10 μg / Ml) in frischem Kulturmedium für 30 min bei 37 ° C.
   1. Die Zellen mit 0,5 ml PBS dreimal waschen und dann die Zellen durch Trypsin-Verdauung für die PMV-Erzeugung, wie oben beschrieben, ernten.
   2. 150 μl des gesammelten medIn eine 35-mm-Glasbodenschale geben und die PMVs ca. 10 min auf den Boden absetzen lassen. Untersuche die PMVs unter einem konfokalen Mikroskop mit dem 100X Öl Objektiv.
8. Um EGFP oder den mitochondrialen Farbstoff zu detektieren, schalte den 488-nm-Laser ein und sammle das Signal bei 505-530 nm. Um JC-1 zu detektieren, schalten Sie die Laser von 488 nm und 543 nm ein und sammeln Signale bei 505-530 nm und 560-615 nm. Setzen Sie den Pinhole-Wert auf ca. 1,4.

4. Herstellung von konzentrierten PMVs durch Zentrifugation

1. Ernten Sie die Zellen durch Trypsinverdauung und erzeugen Sie PMVs, wie oben beschrieben, in 0,5 ml Kulturmedium.
2. Die PMVs bei 1.200 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min bei Raumtemperatur drehen. Den Überstand vorsichtig absaugen und das Pellet in 100 μl Kulturmedium mit sanfter Verwirbelung resuspendieren.
3. 50 μl PMVs in eine 35 mm Glasbodenschale geben und bei Raumtemperatur ca. 10 min absetzen lassen. Untersuche die PMVsUnter einem konfokalen Mikroskop mit dem 40X Öl Objektiv.
4. Füge die Reihe der verdünnten Polyethylenimin (PEI) -Lösung der BMSC-Kultur für 1 h hinzu und kontrolliere auf Anzeichen einer Zytotoxizität.
   HINWEIS: Hier wurde der PEI mit 2 μg / ml gewählt, da in BMSCs kein Toxizitätszeichen nachgewiesen wurde.
5. Ernte die Zellen durch Trypsin-Verdauung und füge PEI bei 2 μg / ml für 1 h hinzu, um die Zellmembran als Mittel zur Verhinderung der Aggregation aufzuladen. Generieren Sie PMVs, wie oben beschrieben, in 0,5 ml Kulturmedium. Konzentriere die PMVs und untersuche sie unter einem konfokalen Mikroskop, wie oben beschrieben.

5. Injektion von PMVs in den Gastrocnemius Muskel

1. Um die Membran zu färben, fügen Sie CM-DiI (Chlormethyl-Dialkyl-indocarbocyanin) (10 & mgr; M) -Farbstoff in 1 ml frischem Kulturmedium zu den BMSCs für 30 min hinzu.
2. Ernten Sie die Zellen (ca. 5 x 10 & ^sup5; ) durch Trypsinverdauung und resuspendieren sie in 0,5 ml Kulturmedium. Füge PEI (2 μg / ml) für 1 hinzuH. Generieren und konzentrieren die PMVs in 100 & mgr; l Kulturmedium, wie oben beschrieben.
3. Anästhesieren Sie eine BALB / c-Maus, indem Sie Natriumborge (10 mg / kg) nach 12 h Fasten injizieren.
4. Reinigen Sie die Außenseite des Gastrocnemius-Muskels mit 75% Ethanol. Langsam injizieren die PMVs (100 μl) in den Gastrocnemius Muskel mit einer 30 G Insulin Spritze.
5. Nach der Verabreichung der Anästhesie, legen Sie eine nasse Gaze über die Augen für die Dauer des Experiments und wärmen die Maus mit einem Glühlampe, bis es aufwacht. Haus die Maus allein in einem individuellen Lüftungskäfig.
6. Um den gastrocnemius muskel 12 h nach der Operation zu ernten, töte die Maus durch zervikale Versetzung.
7. 75% Ethanol über den Gastrocnemius-Muskel streuen, die Haut mit einer Schere öffnen und den ganzen Gastrocnemius-Muskel an beiden Enden ausschneiden.
8. Spülen Sie den Muskel mit PBS und untersuchen Sie ihn unter einem Fluoreszenzmikroskop mit dem 20X Objektiv.
9. Schneide den Muskel mit einemScharfe Rasierklinge zur Entfernung der Teile ohne Fluoreszenz. Schneiden Sie die Teile mit starker roter Fluoreszenz in ca. 9 mm ³ Würfel.
10. Setzen Sie jeden Würfel in optimales Schneidtemperaturmedium (OCT) ein, tauchen Sie es in flüssigem Stickstoff für 5 min ein und bewahren Sie es in einem Gefrierschrank von -20 ° C bis zum Gebrauch auf.
11. Schneiden Sie die gefrorenen Abschnitte in Stücke 20 μm dick mit einem Kryostat und haften Sie jeden Abschnitt zu einer Glasrutsche. Spülen Sie den Abschnitt einmal mit PBS.
12. Zeichne einen Kreis um den Schnitt mit einem Fleckkreisstift und füge 100 μl DAPI (1 μg / ml) hinzu. Die DAPI-Lösung nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln nachgießen und dreimal mit PBS waschen.
13. Drop-Montage Öl über die Probe, decken Sie es mit einem Glas-Slip, und dichten Sie die Folie mit Nagellack. Untersuche den Abschnitt unter einem konfokalen Mikroskop mit dem 100X Öl Objektiv.
14. Um CM-DiI zu detektieren, schalte den 543 nm Laser ein und sammle das Signal bei 560-615 nm. Um DAPI zu erkennen, schalte das 405 einNm-Laser und sammeln Signal bei 420-480 nm. Setzen Sie den Pinhole-Wert auf ca. 1,4.

Ergebnisse

Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Vorbereitung von PMVs hängt stark von der korrekten Montage der Filtereinheit ab (Abbildung 1 ), die durch Drücken von 1 mL PBS durch die Membran getestet werden kann. Falls Leckage auftritt, die Filtereinheit wieder zusammenbauen und erneut prüfen. Allerdings kann die Leckage nur zuverlässig getestet werden, wenn die Zellen durch die Membran geschoben werden. Wenn nur wenige PMVs unter einem regulären Mikroskop unter Verwendung des 1...

Diskussion

Die Zytoplasma-Ersatztherapie, wie sie in diesem Manuskript vorgeschlagen wird, hat einzigartige Vorteile gegenüber anderen berichteten Ansätzen wie der Gen-, Molekular- und Zelltherapie. PMVs, die aus BMSCs erzeugt werden, verkapseln nicht nur die Produkte von Stammgenen, sondern auch intakte Zellorganellen, die für die Behebung der mit der Seneszenz verbundenen Alterungsphänotypen unerlässlich sind. Wenn junges Zytoplasma an seneszente Zellen abgegeben wird, können die fehlerhaften Mechanismen eine kurze Linderung erfa...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
IsoporeTM Membranen	Millipore	TSTP04700	3 mm Poren
Einweg-Filtereinheit	Xinya, Shanghai, China	25 mm	Medizinische
	BD	328446	1 mL
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Molekulare Sonden	M7514	Grün FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 mg/mL
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
	PEI Sigma	P3143	Mn = 75.000
Fluoreszenzmikroskop	Nikon	Eclipse TE 2000	Mit CCD-Kamera
Confocol Mikroskop	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	Für die Zelltransfektion