Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

Aintzane Apraiz; Jone Mitxelena; Ana Zubiaga

doi:10.3791/55745

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Methodenartikel

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

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DOI:

10.3791/55745

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6. Juni 2017

Aintzane Apraiz^*¹ , Jone Mitxelena^*²^,³ , Ana Zubiaga²

¹Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, ²Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, ³Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Zusammenfassung

Das Genexpressionsprogramm des Zellzyklus stellt einen kritischen Schritt zum Verständnis von zellzyklusabhängigen Prozessen und deren Rolle bei Krankheiten wie Krebs dar. Die zellzyklusregulierte Genexpressionsanalyse hängt von der Zellsynchronisation in spezifische Phasen ab. Hier beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle verwendet, die üblicherweise zum Studieren einer periodischen Variation der Genexpression während des Zellzyklus verwendet werden. Beide Verfahren basieren auf einer vorübergehenden Blockierung des Zellzyklus in einem definierten Punkt. Das Synchronisationsprotokoll durch Hydroxyharnstoffbehandlung (HU) führt zu einem zellulären Arrest in der späten G1 / frühen S-Phase, und die Freisetzung aus dem HU-vermittelten Arrest liefert eine zelluläre Population, die gleichmäßig durch S und G2 / M fortschreitet. Das Synchronisationsprotokoll durch Thymidin- und Nocodazol (Thy-Noc) -Behandlung blockiert Zellen in der frühen Mitose und die Freisetzung von Thy-Noc-vermittelten Arrest liefert eine synchronisierte zelluläre Population, die für die G1-Phase und die S-Phase-en geeignet istVersuche Studien. Die Anwendung beider Verfahren erfordert die Überwachung der Zellzyklusverteilungsprofile, die typischerweise nach der Propidiumjodid (PI) -Färbung der Zellen und der Durchflusszytometrie-vermittelten Analyse des DNA-Gehalts durchgeführt wird. Wir zeigen, dass die kombinierte Verwendung von zwei Synchronisationsprotokollen ein robuster Ansatz ist, um die Transkriptionsprofile von Genen, die im Zellzyklus unterschiedlich reguliert sind ( dh E2F1 und E2F7), klar zu bestimmen und folglich ein besseres Verständnis ihrer Rolle im Zellzyklus zu haben Prozesse. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Ansatz für die Untersuchung von Mechanismen, die Drogen-basierten Therapien ( dh Mitomycin C, ein Antikrebsmittel) zugrunde liegen, nützlich ist, da es erlaubt, Gene zu unterscheiden, die auf das genotoxische Mittel reagieren, von denen, die nur von Zellzyklus-Störungen betroffen sind Verhängt durch den agent

Einleitung

Der Übergang durch alle Phasen des Zellzyklus ist an ein streng reguliertes Genexpressionsprogramm gekoppelt. Dieses koordinierte "On und Off" der Gen-Transkription im gesamten Zellzyklus wird vermutlich unter der Kontrolle von komplexen Transkriptionsregulationssystemen liegen, was nicht nur das Timing, sondern auch die Ebenen der Genexpression reguliert. Die Deregulierung von Schlüssel-Zell-Zyklus-Komponenten ist bekannt, um zur Entwicklung von mehreren Krankheiten beitragen und ist ein etabliertes Kennzeichen der Tumorigenese ¹ ^, ² . Genom-weite transkriptomische Analysen, die in Hefe- und Säugetierzellen ....