Method Article

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Abstract

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Das Genexpressionsprogramm des Zellzyklus stellt einen kritischen Schritt zum Verständnis von zellzyklusabhängigen Prozessen und deren Rolle bei Krankheiten wie Krebs dar. Die zellzyklusregulierte Genexpressionsanalyse hängt von der Zellsynchronisation in spezifische Phasen ab. Hier beschreiben wir eine Methode, die zwei komplementäre Synchronisationsprotokolle verwendet, die üblicherweise zum Studieren einer periodischen Variation der Genexpression während des Zellzyklus verwendet werden. Beide Verfahren basieren auf einer vorübergehenden Blockierung des Zellzyklus in einem definierten Punkt. Das Synchronisationsprotokoll durch Hydroxyharnstoffbehandlung (HU) führt zu einem zellulären Arrest in der späten G1 / frühen S-Phase, und die Freisetzung aus dem HU-vermittelten Arrest liefert eine zelluläre Population, die gleichmäßig durch S und G2 / M fortschreitet. Das Synchronisationsprotokoll durch Thymidin- und Nocodazol (Thy-Noc) -Behandlung blockiert Zellen in der frühen Mitose und die Freisetzung von Thy-Noc-vermittelten Arrest liefert eine synchronisierte zelluläre Population, die für die G1-Phase und die S-Phase-en geeignet istVersuche Studien. Die Anwendung beider Verfahren erfordert die Überwachung der Zellzyklusverteilungsprofile, die typischerweise nach der Propidiumjodid (PI) -Färbung der Zellen und der Durchflusszytometrie-vermittelten Analyse des DNA-Gehalts durchgeführt wird. Wir zeigen, dass die kombinierte Verwendung von zwei Synchronisationsprotokollen ein robuster Ansatz ist, um die Transkriptionsprofile von Genen, die im Zellzyklus unterschiedlich reguliert sind ( dh E2F1 und E2F7), klar zu bestimmen und folglich ein besseres Verständnis ihrer Rolle im Zellzyklus zu haben Prozesse. Darüber hinaus zeigen wir, dass dieser Ansatz für die Untersuchung von Mechanismen, die Drogen-basierten Therapien ( dh Mitomycin C, ein Antikrebsmittel) zugrunde liegen, nützlich ist, da es erlaubt, Gene zu unterscheiden, die auf das genotoxische Mittel reagieren, von denen, die nur von Zellzyklus-Störungen betroffen sind Verhängt durch den agent

Introduction

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Der Übergang durch alle Phasen des Zellzyklus ist an ein streng reguliertes Genexpressionsprogramm gekoppelt. Dieses koordinierte "On und Off" der Gen-Transkription im gesamten Zellzyklus wird vermutlich unter der Kontrolle von komplexen Transkriptionsregulationssystemen liegen, was nicht nur das Timing, sondern auch die Ebenen der Genexpression reguliert. Die Deregulierung von Schlüssel-Zell-Zyklus-Komponenten ist bekannt, um zur Entwicklung von mehreren Krankheiten beitragen und ist ein etabliertes Kennzeichen der Tumorigenese 1 , 2 . Genom-weite transkriptomische Analysen, die in Hefe- und Säugetierzellen ....

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Protocol

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1. Zelluläre Synchronisation, Freigabe und Überwachung der Zellzyklusprogression

  1. Thymidin- und Nocodazol-basierte (Thy-Noc) Synchronisation und Freisetzung von U2OS-Zellen aus Mitose
    1. Bereiten Sie das erforderliche Zellkulturmedium vor. U2OS-Zellen werden routinemäßig in DMEM-Glutamin-Medium, ergänzt mit 10% (vol / vol) FBS (optional: 1% Penicillin / Streptomycin), gezüchtet. Führen Sie die mittlere Vorbereitung und Manipulation unter sterilen Bedingungen durch und erwärmen Sie das komplementierte Medium (von nun an als "komplettes Medium") bis 37 ° C vor dem Gebrauch aufwärmen.
    2. Samen 2 x 10 6 U2OS Zellen pro 1....

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Results

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Schematische Darstellung von Thy-Noc- und HU-basierten Protokollen zur Zellsynchronisation.

Abbildung 1 fasst die Schritte zusammen, die für die U2OS-Zellsynchronisation und die anschließende Probensammlung erforderlich sind, um die Progression durch den Zellzyklus zu überprüfen und Genexpressionsanalysen durchzuführen.

Phospho-H3 und PI-Färbung sind gute.......

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Discussion

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Die Analyse von Feinabstimmungsregulierten Genen, die an transienten und spezifischen Rollen im Zellzyklus beteiligt sind, erfordert eine einheitliche Zellpopulation. Viele Forscher verwenden routinemäßig langjährige Tumorzelllinien für diese Zwecke und es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um synchrone (oder teilweise synchrone) Zellpopulationen zu erhalten, mit dem Ziel, möglichst viele Zellen in definierten Zellzyklusphasen zu akkumulieren. Darüber hinaus wurden starke Anstrengungen unternommen, um bewährte Syn.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Wir danken den Mitgliedern der Zubiaga und den Altmeyer Laboratorien für hilfreiche Diskussionen und für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des spanischen Ministeriums (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), der Baskischen Regierung (IT634-13 und KK-2015/89) und der Universität des Baskenlandes UPV / EHU ( UFI11 / 20).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, hoher Glukosegehalt, GutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, qualifiziert, EU-zugelassen, Herkunft aus SüdamerikaThermo Fisher Scientific10270-106
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% Trypsin-EDTA (1x), phenolrotThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidinSIGMAT1895-5GFrisch zubereitet. Eine leichte Erwärmung kann helfen, Thymidin aufzulösen.
NocodazolSIGMAM-1404Stammlösung in DMSO gelagert bei -20 μm C in kleinen Aliquoten
HydroxyharnstoffSIGMAH8627Frisch zubereitetes
Mitomycin C aus Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 mM Stammlösung in sterilem H2O lichtgeschützt und gelagert bei 4 & ordm; C
DimethylsulfoxidSIGMAD2650
PropidiumiodidSIGMAP4170Stammlösung in sterilem PBS bei 5 mg/ml, gelagert bei 4 & ordm; C vor Licht geschützt.
PBS pH 7,6Hausgemachtes
EthanolPANREACA3678,2500
ChloroformSIGMAC2432
NatriumcitratPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAse AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagenzLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini KitQIAGEN74106
Reverse Transkriptionskit für cDNA mit hoher KapazitätThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 AntikörperCell Signaling41291:1000 Verdünnung in 5 % Milch, o/n, 4 & ordm; C
Anti-Cyclin B1 AntikörperZellsignalisierung41351:1000 Verdünnung in 5% Milch, o/n, 4 & ordm; C
Anti-β-AktinSIGMAA-54411:3000 Verdünnung in 5 % Milch, 1 Std., RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570Spezifiziert im Protokoll
Sekundärer Anti-Kaninchen-Antikörper AlexaFluor 488InvitrogenR37116Spezifiziert im Protokoll
Sekundärer Anti-Maus-HRP-AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-36971:3000 Verdünnung in 5 % Milch, 1 Std., RT
Forward E2F1 Antikörper (human)                                     TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 Antikörper (Mensch)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 Antikörper (Mensch)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 Antikörper (human)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioEntwickelt von PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 Antikörper (human)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 Antikörper (human)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP Antikörper (Mensch) Referenzgen                                       BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP Antikörper (human)                                       BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L-Antikörper (human) Referenzgen    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   Antikörper (Mensch)      CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                               BiolegioDesigned by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Optische 96-Well-ReaktionsplatteThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC-behandelte KulturschaleCorning Corning
Costar Zellkulturplatten 6 WellCorning3506
Tisch-MikrozentrifugeEppendorf5415 R
Gekühlte Tischzentrifuge Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite SpektralphotometerThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur DurchflusszytometerBD Bioscience
QuantStudio 3 Echtzeit-PCR-SystemThermo Fisher ScientificA28567
gekühlte

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

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