Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus Rhipicephalus microplus Epithel-Darmzellen

Zusammenfassung

Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.

Zusammenfassung

Rhipicephalus microplus - die Rindertick - ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomischen Auswirkungen auf Viehbestand als Vektor von mehreren Krankheitserregern. Bemühungen wurden der Vieh-Tick-Kontrolle gewidmet, um ihre schädlichen Wirkungen zu verringern, wobei der Fokus auf die Entdeckung von Impfstoffkandidaten wie BM86, die sich auf der Oberfläche der Tick-Darm-Epithelzellen befinden, Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Nutzung von cDNA und genomischen Bibliotheken, um für andere Impfstoffkandidaten zu screenen. Die Isolierung von Tick-Darmzellen stellt einen wichtigen Vorteil bei der Untersuchung der Zusammensetzung von Oberflächenproteinen auf der Tick-Darm-Zellmembran dar. Dieses Papier stellt eine neuartige und machbare Methode für die Isolierung von Epithelzellen dar, von den Tick-Darm-Inhalten von halb engorgestem R. microplus . Dieses Protokoll nutzt TCEP und EDTA, um die Epithelzellen aus dem subepithelialen Stützgewebe und einem diskontinuierlichen Dichtezentrifugationsgradie freizusetzenNt, um Epithelzellen aus anderen Zelltypen zu trennen. Zelloberflächenproteine ​​wurden biotinyliert und aus den Tick-Darm-Epithelzellen isoliert, wobei Streptavidin-verknüpfte magnetische Perlen verwendet wurden, die nachgeschaltete Anwendungen in FACS- oder LC-MS / MS-Analyse erlaubten.

Einleitung

Rhipicephalus microplus , die Viehzuttel, ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomische Auswirkung auf die Viehwirtschaft der tropischen und subtropischen Regionen, da sie Rinder-Tick-Fieber (Babesiose), Anaplasmose und pferdeartige Piroplasmose ^{1 , 2 , 3 , 4} . Es wurden Anstrengungen zur Rindertickkontrolle unternommen, um die schädliche Wirkung zu verringern, aber herkömmliche Verfahren wie die Verwendung von chemischen Akariziden haben implizite Nachteile, wie das Vorhandensein von chemischen Rückständen in Milch und Fleisch und die Zunahme der Prävalenz von chemisch resistenten Zecken ^{5 , 6 , 7} Folglich wurde die Entwicklung alternativer Methoden der Zeckenkontrolle untersucht, wie die Verwendung von natürlichen Resistenzvieh, biologische Kontrolle (Biopestizide) und VaccInes ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Bei der Verfolgung von Proteinen, die als Impfstoffkandidaten verwendet werden können, konzentriert sich die aktuelle Forschung auf den Tick Darm. Die Mittelgutwand ist aus einer einzigen Schicht von Epithelzellen aufgebaut, die auf einer dünnen Basallamelle ruht, wobei die Außenseite der Basallamina ein Netz von Muskeln bildet. Licht- und Elektronenmikroskop Beobachtungen zeigen, dass die Midgut besteht aus drei Arten von Zellen: Reserve (undifferenziert), sekretorischen und Verdauung. Die Anzahl der Zelltypen variiert in Abhängigkeit von der physiologischen Phase erheblich. Sekretorische und Verdauungszellen stammen beide aus Reservezellen ^{18 , 19 , 20} .

Der Aufbau von cDNA-BibliothekenUm die Zusammensetzung des Zeckendarms zu untersuchen, hat zur Identifizierung von antigenen Proteinen wie Bm86 als potentielle Impfstoffkandidaten ^{2 , 3 , 4 geführt} . Das Glykoprotein Bm86 ist an der Oberfläche der Tick-Darmzellen lokalisiert und induziert eine schützende Immunantwort gegen die Rindertick ( R. microplus ) bei geimpften Rindern. Anti-Bm86-IgGs, die durch den immunisierten Wirt produziert werden, werden von der Zecke eingenommen, erkennen dieses Antigen auf der Oberfläche von Tick-Darmzellen und stören anschließend die Tick-Darm-Gewebefunktion und die Integrität. Impfstoffe basieren auf Bm86 Antigene wirksame Kontrolle von R. micro und Rhipicephalus annulatus, in einem reduzierten Larvenbefall durch die Verringerung der Zahl, Gewicht und Fortpflanzungsfähigkeit von Verschlingen Weibchen, was ⁴ in nachfolgenden Generationen tick gezeigt. Allerdings sind Bm86-basierte Impfstoffe nicht wirksam gegen alle Tick-Stufen und habenZeigte eine unbefriedigende Wirksamkeit gegen einige geographische Stämme von R. microplus , folglich haben die Rindfleisch- und Milchindustrie diese Impfstoffe schlecht angenommen ^{2 , 4} .

Die Fähigkeit, Epithelzellen aus dem Tick-Darm zu isolieren, ist eine signifikante Innovation, die es ermöglicht, die Projektion der Forschung zu bestimmen, um die Proteinmembranzusammensetzung einschließlich Morphologie und Physiologie unter verschiedenen Umgebungsbedingungen zu bestimmen. Das hier beschriebene Verfahren verwendet den Chelatbildner Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und das Reduktionsmittel Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP), um das Epithel aus seinen subepithelialen Trägergeweben ¹⁰ freizusetzen. Das Epithel wird nach mechanischer Zerstörung der Gewebe durch Schütteln gewonnen, gefolgt von einer diskontinuierlichen Gradientenzentrifugation in Percoll. Dieses Papier beschreibt eine machbare und neuartige Technik für die Isolierung von Tick Darm epiThelialen Zellen Biotinylierte Zelloberflächenproteine, die von der Oberfläche dieser Epithelzellen isoliert wurden, können anschließend in nachgeschalteten Anwendungen wie FACS und / oder LC-MS / MS-Analyse analysiert werden.

Protokoll

1. Dissektion des Darm-Epithels aus R. microplus

1. Sammeln Sie am Tag des Experiments halb engagierte Zecken aus Rindern. Dissect-Ticks innerhalb von 24 Stunden nach dem Entfernen vom Wirt.
2. Kleben Sie einen Streifen Klebeband auf den Boden der 92 mm x 16 mm Petrischale. Füge dem Tape einen Tropfen Superleim hinzu. Legen Sie die Zecke, ventral Seite nach unten auf den Super-Leim, lassen Sie für 2 min trocknen.
3. 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Petrischale geben oder bis die Zecke vollständig eingetaucht ist.
4. Unter Verwendung einer Skala der Größe 11, schneiden Sie von der Oberseite der Augen zu den unteren Girlanden, auf beiden Seiten der Zecke.
5. Mit sterilen Pinzetten, entfernen Sie vollständig das Scutum und alloscutum , um die inneren Organe freizulegen.
6. Entfernen Sie die feinen weißen fadenähnlichen Organe (Trachea) und andere Membranen, um eine Kontamination zu vermeiden.
7. Den Darm mit einer Pinzette entfernen, indem man den oberen Bereich einklemmt und aus demKarkasse. Entfernen Sie alle verbleibenden Darmgewebe, um sicherzustellen, dass keine anderen Gewebe seziert wurden.
8. Dose in eiskalter Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Calciumchlorid und Magnesiumsulfat mit Proteinase-Inhibitor Cocktail (PIC) aufbewahren. Schnappen Sie den Eingeweide in Trockeneis ein und lag bei -20 ° C auf.
   Anmerkung: Zur Unterstützung der Darmdissektion und Details der tick inneren Organe siehe Kapitel 3.1 von D. Sonenshine, "Biologie der Zecken" ¹⁹ .

2. Epithelzelldissoziation

1. Gießen Sie den sezierten Darm auf einen 70 μm Zellsieb in einem 50 mL Röhrchen.
2. Spülen Sie das Darmgewebe mit 50 mL eiskaltem HBSS mit PIC, bis die Lösung klar läuft und die Eingeweide ein weißes / klares Aussehen annehmen.
3. Den Magen in 30 mL eiskaltem HBSS mit PIC suspendieren, vorsichtig mischen und bei 500 ° C bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren, um den Darm zu pellet. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal.
5. Filtriere die Suspension durch einen 250 μm-Zellsieb, verwirre den Durchfluss und filtriere durch einen 70 μm-Zellsieb, der den verbleibenden Durchfluss sammelt.
6. Die Suspension bei 500 xg bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, um die einzelnen Zellen zu pelletieren.

3. Isolierung einzelner Epithelzellen unter Verwendung eines Dichte-Zentrifugationsgradienten

1. Den Dichte-Zentrifugationsgradienten ( zB Percoll) durch Filtrieren durch ein AP15-Vorfilterpapier vorbereiten. 40% und 20% Percoll in mqH ₂ 0 (v / v) vorbereiten und bei 4 ° C für 1 h abkühlen, bevor der Gradient geschichtet wird.
2. Mit einem peristaltischenPumpe auf die niedrigste Geschwindigkeit eingestellt, Schicht 3 ml von 40% Dichte Zentrifugation Gradient in ein 16 mL Ultrazentrifugenröhrchen, so dass es auf Eis für 15 min absetzen. Die Geschwindigkeit der Pumpe sollte zu einer <1 mL pro Minute Durchflussmenge führen.
3. Kippen des Rohres in einen 45 ° -Winkel, verwenden Sie die peristaltische Pumpe, um den 20% Dichte-Zentrifugationsgradienten auf der 40% -Schicht zu schichten. Die Geschwindigkeit der Pumpe sollte zu <1 mL pro min Durchfluss führen. Lassen Sie die Schichten 15 Minuten lang auf Eis absetzen.
4. Verwenden Sie die peristaltische Pumpe bei <1 mL pro Minute Durchflussmenge auf Schicht 3 ml DMEM-Medium, das Tick-Darmzellen über dem 20-40% Dichte-Zentrifugationsgradienten enthält.
5. Programmieren Sie die Zentrifuge für maximale Beschleunigung und minimale Verzögerung. Zentrifuge bei 600 xg für 10 min. Sammeln Sie Interphasen zwischen dem DMEM: 20% Dichte-Zentrifugationsgradient und den 20%: 40% Dichte-Zentrifugationsgradienten, um epitheliale Einzelzellen zu isolieren. Lagern Sie gesammelte Zwischenphasen bei 4 ° C für nachfolgende Analysen.

4. Bewertung der Zellisolation

1. Hemacytometer
   1. Reinigen Sie den Hämacytometer mit Alkohol.
   2. .Entfernen Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren der Zellen nach oben und unten. 100 μl der Zellsuspension pipettieren und in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben.
   3. Fügen Sie 400 μl 0,4% Trypan Blue hinzu. Vorsicht mischen, indem man die Röhre schlägt.
   4. 100 μl der mit Trypan Blue behandelten Zellsuspension pipettieren, um langsam beide Kammern des Hämocytometers zu füllen.
   5. Legen Sie das Hämocytometer unter ein Lichtmikroskop und fokussieren auf die Gitterlinien des Hämocytometers mit einem 10fachen Objektiv.
   6. Mit einem Hand-Tally-Zähler zählen die lebenden ungefärbten Zellen innerhalb eines Satzes von 16 Quadraten. Innerhalb des gleichen Platzes zählen die blauen toten Zellen. Weiterzählen, bis vier Sätze von 16 Quadraten gezählt werden.
   7. Berechnen Sie die Gesamtzellen pro ml mit der Formel:
      47eq1.jpg "/>
   8. Berechnen Sie die prozentuale Zelllebensfähigkeit anhand der Formel:
      
2. Zelle isolieren Visualisierung
   1. 1 μl der isolierten Zellen in 9 μl HBSS in einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen verdünnen. Das Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig mischen.
   2. 5 μl isolierte Zellen in HBSS in die Mitte einer Glasrutsche pipettieren. Tragen Sie drei Tropfen Montagemedium mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) auf.
   3. Inkubieren Sie den Objektträger bei Raumtemperatur für 5 min. Setzen Sie sorgfältig einen Deckel über die Vorbereitung, Vermeidung von Luftblasen.
   4. Visualisierung der mit DAPI gefärbten Zellen bei Anregung 360 nm und Emission bei 460 nm unter einem Fluoreszenzmikroskop.

5. Zelloberflächenprotein-Biotinylierung

1. Biotinylierung von 100 & mgr; l Einzelzell-Epithelzellen unter Verwendung von Biotin (Typ A) KonjugationKit, bei einem Molverhältnis von 1: 1 Oberflächenprotein zu konjugieren, wie nach Herstellerangaben
2. Für die Zelllyse werden 100 μl PBS, 1% Triton X-100, 10% Glycerin, 100 μM oxidiertes Glutathion und PIC zu den biotinylierten Zellen gegeben. Inkubieren auf Eis für 1 h mit sanften Mischen alle 10 min.
3. Die biotinylierten Zellen bei 20.000 xg bei 4 ° C für 20 min zentrifugieren, um unlösliches Material zu pelletieren. Sammeln Sie den Überstand, der zytoplasmatische und biotinylierte Membranproteine ​​enthält.
4. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay.

6. Isolierung von biotinylierten Oberflächenproteinen

1. 50 μl Streptavidin-Magnetperlen in ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen geben.
2. Legen Sie den Schlauch in einen Magnetständer und sammeln die Perlen gegen die Seite des Rohres. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
3. Füge 1000 μl TBS, 0,1% Tween-20 zum Röhrchen hinzu. Mischen Sie sanft und sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen StanD. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand.
4. Kombinieren Sie 40 μg biotinylierte Zelloberflächenproteine, verdünnt auf 300 μl in 1x PBS mit gewaschenen magnetischen Kügelchen. Inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur unter Rühren.
5. Die Perlen mit einem Magnetständer sammeln, den Überstand entfernen und entsorgen.
6. Zugabe von 300 μl TBS, 0,1% Tween-20 zum Röhrchen, sanftes Mischen zur erneuten Suspendierung der Perlen. Perlen sammeln, den Überstand entfernen und entsorgen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
7. 100 & mgr; l des 0,1 M Glycin pH 2,0 zu den magnetischen Kügelchen geben und bei Raumtemperatur für 5 min inkubieren. Sammeln Sie Perlen und entfernen Sie den Überstand, der eluierte biotinylierte Oberflächenproteine ​​enthält.
8. Visualisiere isolierte Oberflächenproteine ​​auf einem 4-20% Tris-MOPS SDS-PAGE-Gel.

7. Bewertung von biotinyliertem Oberflächenprotein

1. Dot Blot
   1. Schneiden Sie einen 7 cm x 3 cm Streifen Nitrozellulosemembran.
   2. Tragen Sie 10 μg total Tick GuT-Gehalt (ab 1.8) und 10 μg biotinyliertes Oberflächenprotein an die Membran. Trocknen 15 Minuten bei Raumtemperatur trocknen lassen.
   3. Übertragen Sie in einen Container und tauchen Sie in 100 ml Blockierpuffer ein. Inkubieren bei Raumtemperatur unter Rühren für eine Stunde. Blockierpuffer verwerfen
   4. Nitrozellulosemembran in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 5 min unter Rühren waschen. Verwerfen Sie Waschpuffer und wiederholen Sie die Waschungen für dreimal.
   5. Inkubieren in 1/5000 Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase (HRP) in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 2 h unter Rühren bei Raumtemperatur und entsorgen jede verbleibende Lösung.
   6. Nitrozellulosemembran in 100 μl PBS, 0,05% Tween-20 für 5 min unter Rühren abwaschen. Waschpuffer verwerfen und dreimal wiederholen.
   7. Zum Nachweis 1 Tablette 4-Chlor-1-napthol in 10 ml eiskaltem Methanol auflösen. Füge 4 ml Methanol-Stamm zu 20 ml TBS hinzu. Füge 10 μl frisches 30% iges Wasserstoffperoxid und sofort hinzuGelten für Nitrozellulosemembran.
   8. Inkubieren unter Rühren bei Raumtemperatur, bis Substrat ein unlösliches blaues Endprodukt erzeugt. Dies kann zwischen 2-15 min dauern.
   9. Die Erkennungslösung entsorgen und die Membran dreimal in 100 μl mqH ₂ O waschen.
2. ELISA-Assay
   1. Verdünnen Sie 200 ng jeder Probe mit 400 μl 100 mM Carbonat-Beschichtungspuffer und beschichten Sie 2 Bahnen der ersten Reihe (A #) der ELISA-Platte (flache Bodenwannen)
   2. Füge 100 μl 100 mM Carbonat-Beschichtungspuffer zu allen anderen entsprechenden Vertiefungen in Reihen (BH) hinzu.
   3. Vorbereiten der seriellen Verdünnungen jeder Probe durch Pipettieren von 100 & mgr; l von jeder Vertiefung in Reihe A und Übertragen in Reihe B. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren und vermeiden Sie die Herstellung von Blasen. Wiederholen Sie die Verdünnungen in jeder Zeile, wobei die letzten 100 & mgr; l aus jeder Vertiefung in der Reihe H entsorgt werden.
   4. Die Platte mit Parafilm bedecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
   5. Waschen Sie die PlatE mit 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pro Well dreimal.
   6. 200 μl Blockierungspuffer zu den beschichteten Vertiefungen geben, mit Parafilm abdecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
   7. 1 / 15.000 Streptavidin-HRP in Blockierungspuffer verdünnen und 100 μl zu jeder Vertiefung der Platte hinzufügen. Mit Parafilm abdecken und bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
   8. Waschen Sie die Platte in 200 μl PBS, 0,05% Tween-20 pro Brunnen fünfmal.
   9. Um zu detektieren, fügen Sie 100 & mgr; l TMB-Reagenz pro Vertiefung hinzu. Nach einer ausreichenden Farbentwicklung, üblicherweise zwischen 10-15 min, werden 100 μl 1 M Phosphorsäure zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
   10. Lesen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei λ = 450nm.

Ergebnisse

Epithelzellen wurden aus dem Darmgewebe von R. microplus gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Schema isoliert. Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Tick-Darm-Epithelzellen, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, sind in Fig. 2A gezeigt Und 2B. Da die Zellisolation auf halb engorgestem R. microplus durchgeführt...

Diskussion

Vieh-Tick-Befall stellt ein großes Problem für die Viehwirtschaft in tropischen und subtropischen Regionen der Welt dar, wobei die gängigste Methode der Kontrolle von der Verwendung von Akariziden ^{1 , 4} abhängig ist. Bm86 wurde zuvor innerhalb der Tick-Darm-Epitheloberfläche als Schutz-Antigen gegen R. microplus- Befall ¹⁰ identifiziert, mit begrenztem Erfolg als Impfstrategie aufgrund der Bm86-geographischen Sequenzvariation und...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,4 % Trypanblau	ThermoFisher Scientific	15250061
1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Eppendorf	3322
100 mM Karbonatpuffer			3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml destilliertes Wasser pH 9,6
16 mL Zentrifugenröhrchen mit Verschlusskappe	Thermo Scientific	3138-0016	Vor dem Gradienten in Eis abkühlen
250 & Mikro; M Zellsieb	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) Flüssigsubstrat System für ELISA	Sigma	T0440	gelagert bei 4C
30% Wasserstoffperoxid	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-Chlor-1-naphthol	Tablette Sigma-Aldrich	C6788
50 mL Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115 mm Stil. Konisches Rohr aus Polypropylen.
70 & Mikro; M Zellsieb	BD Falcon	352350
AP15 Filterpapier	Millipore	AO1504200
Biotin (Typ A) Konjugationskit	Abcam	Ab102865
Dissektionsmikroskop	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Software für Zellbilder
Duct Tape	Home Handyman		48mm x 25mm Duct
Tape Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - eiskalt für Protokoll
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12003C	FCS
Fluoreszenzmikroskop	Olympus	BX51
Fluoroshield mit DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML	DAPI
Pinzette	Dumont		#9 Dumont - Schweiz
Glycerin	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerin für die Molekularbiologie >99%
Glycin	Sigma-Aldrich	410225
Handheld-Theke	Officeworks	JA0376230
Hank' s Balanced Salt Solution	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – eiskalt für Protokoll
Hämazytometer	Optik Lakor	-	-
L-Glutathion oxidiert	Sigma-Aldrich	G4376
Magnetischer Trennständer	Novagen-4-Tube		Magnetisches Trenngestell
Methanol	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Integriertes Wasseraufbereitungssystem für Reinstwasser
Nitrozellulosemembran	Life Sciences	66485	30cm x 3M reine Nitrozellulosemembran
PageRuler Vorgefärbtes Protein Leiter	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml destilliertes Wasser) pH 7,4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Schlauchpumpe	Masterflex	7518-10
Phosphorsäure	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Proteinfrei T20 PBS Blockierungspuffer	Thermo-Scientific	37573	Lagerung bei 4C. Blockierungspuffer
Proteaseinhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – gelagert bei -20 ° C
Quick Start Bradford Farbstoffreagenz 1x	Biorad	500-0205	für Bradford Assay
Quick Start BSA Standards	Biorad	500-0207	BSA Standards für Bradford Assay
Scalpel	Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Färbekit	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ultrazentrifuge	Thermo Scientific	46910
Streptavidin (HRP)	Abcam	AB7403
Streptavidin Magnetische Beads	New England Biolabs	S1420S
Sekundenkleber - Ultra Fast Mini	UHU		UHU Sekundenkleber 1mg. Ultra Fast Mini
Tischzentrifuge	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Vortex Mixer	Ratek	VM1
Wasserbad	Grant	GD100