Method Article

Reinigung von biotinylierten Zelloberflächenproteinen aus Rhipicephalus microplus Epithel-Darmzellen

DOI:

10.3791/55747

⸱

July 23rd, 2017

 ,  , 
1Queensland Alliance for Agriculture & Food Innovation, The University of Queensland, 2Centre for Comparative Genomics, Murdoch University

In This Article

Summary

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Eine modifizierte Dichte-Zentrifugations-Gradienten-basierte Methodik wurde verwendet, um Epithelzellen aus Rhipicephalus microplus- Darmgewebe zu isolieren. Oberflächengebundene Proteine ​​wurden biotinyliert und durch Streptavidin-Magnetperlen zur Verwendung in nachgeschalteten Anwendungen gereinigt.

Abstract

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Rhipicephalus microplus - die Rindertick - ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomischen Auswirkungen auf Viehbestand als Vektor von mehreren Krankheitserregern. Bemühungen wurden der Vieh-Tick-Kontrolle gewidmet, um ihre schädlichen Wirkungen zu verringern, wobei der Fokus auf die Entdeckung von Impfstoffkandidaten wie BM86, die sich auf der Oberfläche der Tick-Darm-Epithelzellen befinden, Die aktuelle Forschung konzentriert sich auf die Nutzung von cDNA und genomischen Bibliotheken, um für andere Impfstoffkandidaten zu screenen. Die Isolierung von Tick-Darmzellen stellt einen wichtigen Vorteil bei der Untersuchung der Zusammensetzung von Oberflächenproteinen auf der Tick-Darm-Zellmembran dar. Dieses Papier stellt eine neuartige und machbare Methode für die Isolierung von Epithelzellen dar, von den Tick-Darm-Inhalten von halb engorgestem R. microplus . Dieses Protokoll nutzt TCEP und EDTA, um die Epithelzellen aus dem subepithelialen Stützgewebe und einem diskontinuierlichen Dichtezentrifugationsgradie freizusetzenNt, um Epithelzellen aus anderen Zelltypen zu trennen. Zelloberflächenproteine ​​wurden biotinyliert und aus den Tick-Darm-Epithelzellen isoliert, wobei Streptavidin-verknüpfte magnetische Perlen verwendet wurden, die nachgeschaltete Anwendungen in FACS- oder LC-MS / MS-Analyse erlaubten.

Introduction

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Rhipicephalus microplus , die Viehzuttel, ist der bedeutendste Ektoparasit in Bezug auf die ökonomische Auswirkung auf die Viehwirtschaft der tropischen und subtropischen Regionen, da sie Rinder-Tick-Fieber (Babesiose), Anaplasmose und pferdeartige Piroplasmose 1 , 2 , 3 , 4 . Es wurden Anstrengungen zur Rindertickkontrolle unternommen, um die schädliche Wirkung zu verringern, aber herkömmliche Verfahren wie die Verwendung von chemischen Akariziden haben implizite Nachteile, wie das Vorhandensein von chemischen Rückständen in Milch....

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Protocol

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1. Dissektion des Darm-Epithels aus R. microplus

  1. Sammeln Sie am Tag des Experiments halb engagierte Zecken aus Rindern. Dissect-Ticks innerhalb von 24 Stunden nach dem Entfernen vom Wirt.
  2. Kleben Sie einen Streifen Klebeband auf den Boden der 92 mm x 16 mm Petrischale. Füge dem Tape einen Tropfen Superleim hinzu. Legen Sie die Zecke, ventral Seite nach unten auf den Super-Leim, lassen Sie für 2 min trocknen.
  3. 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Petrischale geben oder bis die Zecke vollständig eingetaucht ist.
  4. Unter Verwendung einer Skala der Größe 11, schneiden Sie von der Oberseite der A....

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Results

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Epithelzellen wurden aus dem Darmgewebe von R. microplus gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Schema isoliert. Repräsentative Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von Tick-Darm-Epithelzellen, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, sind in Fig. 2A gezeigt Und 2B. Da die Zellisolation auf halb engorgestem R. microplus durchgeführt.......

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Discussion

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Vieh-Tick-Befall stellt ein großes Problem für die Viehwirtschaft in tropischen und subtropischen Regionen der Welt dar, wobei die gängigste Methode der Kontrolle von der Verwendung von Akariziden 1 , 4 abhängig ist. Bm86 wurde zuvor innerhalb der Tick-Darm-Epitheloberfläche als Schutz-Antigen gegen R. microplus- Befall 10 identifiziert, mit begrenztem Erfolg als Impfstrategie aufgrund der Bm86-geographischen Sequenzvariation und.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Die Autoren möchten den Biosicherheit Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fischerei, Australien) für die Bereitstellung von Rhipicephalus Zecken micro für diese Studie verwendet, und Lucas Karbanowicz für die Unterstützung bei der Videoaufnahme danken.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,4 % TrypanblauThermoFisher Scientific15250061
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenEppendorf3322
100 mM Karbonatpuffer3,03 g Na2CO3, 6,0 g NaHCO3 1000 ml destilliertes Wasser pH 9,6
16 mL Zentrifugenröhrchen mit VerschlusskappeThermo Scientific3138-0016Vor dem Gradienten in Eis abkühlen
250 & Mikro; M ZellsiebThermo Fisher87791
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) Flüssigsubstrat System für ELISASigmaT0440gelagert bei 4C
30% WasserstoffperoxidLabsceneBSPA5.500
4-20% Tris-MOPS GelGen ScriptM42015
4-Chlor-1-naphtholTablette Sigma-AldrichC6788
50 mL Falcon TubeCorning Blue30 x 115 mm Stil. Konisches Rohr aus Polypropylen.
70 & Mikro; M ZellsiebBD Falcon352350
AP15 FilterpapierMilliporeAO1504200
Biotin (Typ A) KonjugationskitAbcamAb102865
DissektionsmikroskopOlympusSZX7
DP Manager Olympus2.2.1.195Software für Zellbilder
Duct TapeHome Handyman48mm x 25mm Duct
Tape Dulbecco' s Modified Eagle MediumGibco11995-065DMEM - eiskalt für Protokoll
EDTAAmresco0105-500G
F96 Maxisorp Immuno PlateNunc439454
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12003CFCS
Fluoreszenzmikroskop   Olympus BX51
Fluoroshield mit DAPISigma-AldrichF6057-20MLDAPI
PinzetteDumont#9 Dumont - Schweiz
GlycerinSigma-AldrichG5516Glycerin für die Molekularbiologie >99%
GlycinSigma-Aldrich410225
Handheld-ThekeOfficeworksJA0376230
Hank' s Balanced Salt SolutionSigma Life SciencesH9394HBSS – eiskalt für Protokoll
HämazytometerOptik Lakor--
L-Glutathion oxidiertSigma-AldrichG4376
Magnetischer TrennständerNovagen-4-TubeMagnetisches Trenngestell
MethanolSigma-Aldrich179337
Milli-Q WaterMilliporeZRXQ003WWIntegriertes Wasseraufbereitungssystem für Reinstwasser
NitrozellulosemembranLife Sciences6648530cm x 3M reine Nitrozellulosemembran
PageRuler Vorgefärbtes Protein LeiterThermo-FisherSM0671
PBS1,16 g Na2HPO4, 0,1 g KCl, 0,1 g K3PO4, 4,0 g NaCl (500 ml destilliertes Wasser) pH 7,4
PercollSigma-AldrichP1644-500ML
SchlauchpumpeMasterflex7518-10
PhosphorsäureSigma-AldrichP6560
Pierce Proteinfrei T20 PBS BlockierungspufferThermo-Scientific37573Lagerung bei 4C. Blockierungspuffer
Proteaseinhibitor CocktailSigma-AldrichP8215-5MLPIC – gelagert bei -20 ° C
Quick Start Bradford Farbstoffreagenz 1xBiorad500-0205für Bradford Assay
Quick Start BSA StandardsBiorad500-0207BSA Standards für Bradford Assay
ScalpelLab. CoSize 11 Scalpel
SilverQuest TM FärbekitInvitrogenLC6070
Simply Blue TM Safe Stain InvitrogenLC6060
Sorvall C6+ UltrazentrifugeThermo Scientific46910
Streptavidin (HRP)AbcamAB7403
Streptavidin Magnetische BeadsNew England BiolabsS1420S
Sekundenkleber - Ultra Fast MiniUHUUHU Sekundenkleber 1mg. Ultra Fast Mini
TischzentrifugeEppendorf22331
TCEPThermo Fisher20490
Triton X-100Biorad161-0407
Tween-20SigmaP2287-500ML
Vortex MixerRatekVM1
WasserbadGrantGD100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
  2. De Rose, R., et al.

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Rhipicephalus microplusEpithelial Gut CellsBiotinylated Cell Surface ProteinsPercoll GradientStreptavidin Magnetic BeadsCell Surface Protein IsolationTick Gut Epithelial CellsFluorescence MicroscopySDS PAGE AnalysisELISA Detection

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