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Methodenartikel

In-vitro- Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in funktionellen Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen

10.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/55757

⸱

9. August 2017

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine Methode, um effizient die kardialen Differenzierung junge Quellen humaner mesenchymaler Stammzellen um funktionelle, Auftraggeber, Cardiomyocyte-wie Zellen erzeugen Potenzial in-vitro-.

Zusammenfassung

Myokardinfarkt und der anschließenden ischämischen Kaskade führen zu den umfangreichen Verlust von Kardiomyozyten, führt zu Herzinsuffizienz, die führende Todesursache weltweit. Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind eine vielversprechende Option für zellbasierte Therapien, aktuelle, invasive Techniken zu ersetzen. MSCs mesenchymalen Abstammungen, kardiale Zelltypen, einschließlich differenzieren können, aber vollständige Differenzierung in funktionellen Zellen noch nicht erreicht. Bisherige Methoden der Differenzierung beruhten auf pharmakologische Wirkstoffe oder Wachstumsfaktoren. Mehr physiologisch relevante Strategien ermöglichen jedoch auch MSCs Cardiomyogenic Transformation unterziehen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Differenzierung-Methode mit MSC Aggregate auf Cardiomyocyte Feeder Schichten, um Cardiomyocyte-wie auftraggebende Zellen zu produzieren.

Menschlichen Nabelschnur perivaskuläre Zellen (HUCPVCs) haben gezeigt, dass eine größere Differenzierung als potenzielle haben häufig untersucht MSC-Typen, z. B. Knochenmark MSCs (BMSCs). Als ontogenetisch jüngere Quelle untersuchten wir das Cardiomyogenic Potential des Ersttrimester-(FTM) HUCPVCs im Vergleich zu älteren Quellen. FTM HUCPVCs sind eine neuartige, reiche Quelle von MSCs, die ihre in Utero Immunabwehr Eigenschaften beim kultivierten behalten in Vitro. Mit dieser Differenzierung Protokoll, FTM und Begriff erreicht HUCPVCs deutlich erhöhte Cardiomyogenic Differenzierung im Vergleich zu BMSCs, wie durch die erhöhte Expression von Cardiomyocyte Marker (d. h. Myozyten Enhancer Faktor 2 C, kardiale Troponin T schwere Kette kardialen Myosin, Signal regulatorischen Protein α und Connexin 43) angegeben. Sie behielten auch deutlich geringer Immunogenität, wie durch ihren niedrigeren HLA-A Ausdruck und höheren Ausdruck von HLA-G. Aggregat-basierte Differenzierung anwenden, zeigte FTM HUCPVCs erhöhte Aggregatbildung Potenzial und generierten contracting Zellen Cluster innerhalb 1 Woche nach Kokultur auf kardiale Feeder Schichten, immer die erste MSC-Art, dies zu tun.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese Differenzierungsstrategie effektiv das Cardiomyogenic Potential des jungen MSCs wie FTM HUCPVCs nutzen kann und deutet darauf hin, dass in-vitro- Pre-Differenzierung könnte eine mögliche Strategie, um ihre regenerativen Wirksamkeit in Vivozu erhöhen.

Einleitung

Herzinsuffizienz (CHF) bleibt als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. CHF tritt häufig nach den massiven Verlust von Kardiomyozyten und die Entwicklung der zellfreien Narbengewebe als pathologische Ergebnis ein Myokardinfarkt (MI)1. Während das Herz ein teilweise selbst erneuernde Organ ist, verringert sich residente Stamm- und Vorläuferzellen Zelle Pool verantwortlich für die Regeneration des Gewebes deutlich Ausführung in Hülle und Fülle und Funktion bei gealterten Patienten oft nicht ausreichend für optimale Erholung nach einer Verletzung zu. So gibt es großes Interesse an der Entwicklung von experimentellen Behandlungen, bei denen die Transplantation von gesunden Spenderzellen in den Geschädigten Myokard. Es ist zwingend notwendig, dass die Spenderzellen nicht nur die Struktur des Gewebes wiederherzustellen, sondern auch die funktionelle Wiederherstellung der betroffenen Myokard.

Die native Herz beschäftigt Herz Gewebe-Resident und endogenen Knochenmark stammen Stammzellen zur posttraumatischen reparieren2,3,4. Regenerative Zellen-Host und Spender abgeleitet gleichermaßen muss haben die Fähigkeit, die entsprechenden Phänotyp und Funktion in der Mikroumgebung umgestaltet Myokard, sowie die Fähigkeit, effizient und sicher die verlorenen Zellen ersetzen zu erhalten. In Vitro Differenzierung Methoden sind weitgehend benutzt, um eine hocheffiziente, stammzellbasierte Cardiomyocyte Produktion5,6zu erreichen. Expressionsprofil kardiale Linie Marker wird verwendet, um den Prozess der Stammzell-Differenzierung in der kardialen Linie7Richtung zu definieren. Frühe Differenzierung Marker wie NKX2.5, Myozyten Enhancer Faktor 2 C (Mef2c) und GATA48,9, kann einen Hinweis über die Einleitung des Cardiomyogenic Prozesses. Reife Cardiomyocyte Marker häufig verwendet, um Differenzierung Wirksamkeit zu beurteilen sind Signal regulatorischen Protein α (SIRPA)10, kardiale Troponin T (cTnT)11, schwere Kette kardialen Myosin (MYH6)8,12,13und Connexin 43 (Cx43)14,15,16. Die Methoden, die Verwendung von embryonalen Stammzellen (WSR) und pluripotenten Stammzellen (EAP) wurden sorgfältig optimiert und diskutiert über die Details der induktive Faktoren, Sauerstoff und Nährstoff Steigungen und der genaue Zeitpunkt der Aktion5,6,7,17,18. Dennoch präsentieren ESC und PSC-basierten Technologien noch mehrere Sicherheit und ethische Bedenken zusammen mit suboptimalen elektrophysiologische und immunologischen Funktionen19,20. Gastgeber, die oft mit diesen Zellen transplantiert erleben Immunorejection und erfordern ständige Immunsuppression. Dies ist vor allem auf großen Histocompatibility Komplexes (MHC) Moleküle in dem Host und dem Spender und der daraus resultierenden T-Zell Antwort21Fehlanpassungen. Während einzelne MHC Klasse I matching ist eine mögliche Lösung, eine zugänglichere klinische Praxis würde benötigen eine Zelle, die allgemein die Immunabwehr, die Sorge der Ablehnung zu überwinden ist.

Als alternative Zelle Quelle für den Einsatz in der klinischen Anwendung, MSCs und insbesondere BMSCs, wurden für den Einsatz in Geweberegeneration seit ihrer Erstbeschreibung im Jahr 199522untersucht. MSCs werden geglaubt, um Wohnsitz regenerativen Zellen, die in nahezu jedem vaskularisierte Gewebe23gesucht werden kann. Bei der Isolierung von der gewünschten Quelle MSCs können leicht erweitert werden, in der Kultur, haben umfangreiche parakrine Kapazität und oft besitzen Immunabwehr oder immunmodulatorische Eigenschaften24,25. Ihre Sicherheit und Wirksamkeit wurden bereits in mehreren präklinischen Studien, insbesondere zur kardialen Regeneration3,26gezeigt.

Viele MSC Differenzierungsstrategien nutzen pharmakologische Wirkstoffe, wie z. B. 5-Azacytidine22 und DMSO27, und Wachstum oder morphogenetische Faktoren wie BMPs5,7,28,29 oder Angiotensin-II30, mit Variablen Wirkungsgrad. Diese Strategien basieren jedoch nicht auf die Hindernisse, die eine naiven regenerative Zelle nach Homing oder an der Stelle der Verletzung auftreten dürfte in-vivo. Mehr physiologisch relevante Strategien zwar schwieriger zu definieren und zu manipulieren, basieren auf der Prämisse, dass MSC Differenzierung durch Signale aus dem Gewebe Mikroumgebung selbst induziert werden kann. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Exposition gegenüber der Herzmuskelzellen Lysates31 oder Linksventrikuläres Myokard32,33, oder direkt Kontakt mit primären Kardiomyozyten in-vitro-15,34, den Ausdruck der kardialen Marker im MSCs erhöhen kann. Andere zeigten spontane Cardiomyogenesis nach Behandlung von kardialen Verletzungen mit MSCs35,36,37,38, zwar einerseits die Verschmelzung von BMSCs und Herzzellen39,40 der im Entstehen begriffenen Myokard generiert. Nach unserem Kenntnisstand haben funktionelle, spontan Auftraggeber Herzzellen von menschlichen MSCs (hMSCs) von einer beliebigen Quelle Gewebe noch nicht gemeldet.

Der aktuelle Konsens ist, dass alle MSCs aus perivaskuläre Zellen23entstehen. Young-MSCs mit Pericyte Eigenschaften können aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur Gewebe41,42,43isoliert werden. Im Vergleich zu BMSCs besitzen HUCPVCs erhöhte Differenzierungspotenzial und einige andere regenerative Vorteile, sowohl in-vitro-41,44 und in Vivo45,46,47. Insbesondere habe die Quelle als mütterlich fötalen Schnittstelle, HUCPVCs deutlich geringer im Vergleich zu Erwachsenen Quellen von MSCs Immunogenität. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Charakterisierung und prä-klinischen Anwendungen von FTM HUCPVCs, die jüngste Quelle der MSCs untersucht, die wir zuvor gezeigt haben, proliferative und höhere Multilineage gestiegen Differenzierung Kapazitäten, namentlich auf der Cardiomyogenic Linie41.

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Aggregatbildung und primäre kardiale Zellschichten Feeder verbindet wie induktive Kräfte, die komplette Cardiomyogenic Differenzierung von MSCs. Aggregate zu erreichen eine 3D Umgebung bieten die besseren Bedingungen in Vivo im Vergleich zu 2D anhaftende Kulturen Modelle. Verwendung von kardialen Feeder Schichten bietet eine Umgebung, die repräsentativ für die ultimative Transplantation-Website für die MSCs ist. Wir zeigen, dass jüngere Quellen von MSCs isoliert vor oder nach der Geburt die Nabelschnur eine höhere Kapazität, Form Aggregate und den kardialen Phänotyp im Vergleich zu Erwachsenen BMSCs haben, unter Beibehaltung ihrer immun-Privileg zu erreichen. Neben der steilen Höhe des kardialen Linie Marker-Gene und die induzierte Expression von intrazellulären (d. h. cTnT und MYH6) und Zelle-Oberfläche Proteine (z.B. SIRPA und Cx43) speziell für Kardiomyozyten, wir zeigen, dass die Differenzierung Potenzial von FTM HUCPVCs kann, mit dieser Methode genutzt werden und sie spontan Infizierung Cardiomyocyte-ähnlichen Zellen hervorrufen können.

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Protokoll

Alle Studien mit Tieren wurden gemäß den ANARRIVE-Richtlinien durchgeführt und berichtet48. Alle Studien wurden mit Genehmigung des institutionellen Forschungsethikrats durchgeführt (REB-Nummer 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Universität Toronto, Toronto, Kanada). Alle Tierverfahren wurden vom Animal Care Committee des University Health Network (Toronto, Kanada) genehmigt, und alle Tiere erhielten eine humane Pflege in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8. Auflage (National Institutes of Health 2011).

1. Gewebekultur

  1. Kultur FTM HUCPVCs, Begriff HUCPVCs (zuvor etabliert, n ≥ jeweils 3 unabhängigen Linien)42 und kommerziell erhältliche BMSCs in Alpha-Minimum Essential Medium (MEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und einem 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) Cocktail. Kultur von primären Kardiomyozyten und MSC-Kardiomyozyten-Cokulturen der Ratte in Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 (DMEM-F12) mit 10 % FBS und 1 % P/S.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,2-μm-Filter. Vorbereitete mittelgroße Lösungen bis zu 3 Wochen bei 4 °C lagern.
  2. Bewahren Sie Zellkulturen in befeuchteten Inkubatoren (95 % relative Luftfeuchtigkeit, 37 °C und 5 % CO2) und Passage bei 70-80 % Konfluenz auf, bestimmt durch Phasenkontrastmikroskopie. Verwenden Sie geeignete Volumina des Mediums für die Größe der verwendeten Gewebekulturschale (z. B. 10 ml in einer 10-cm-Schale und 2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Gewebekulturplatte). Verwenden Sie diese Kulturbedingungen für die Dauer des Protokolls.
  3. MSC-Monolayer für die Passage oder MSC-Kardiomyozyten-Cokultur-Etablierung mit einer Dissoziationsenzymlösung (2 ml/Well in einer 6-Well-Platte) dissoziieren und 4 min bei 37 °C inkubieren.
  4. Die dissoziierten Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen umgefüllt und 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert.
  5. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml eines Kulturmediums, das für die Zählung mit einem automatisierten Zellzähler geeignet ist. Führen Sie ein Seeding für die Zellen aus, wie in den folgenden Protokollabschnitten beschrieben.

2. Vorbereitung von primären Kardiomyozyten-MSC-Cokulturen der Ratte

  1. Entnahme von Herzgewebe für die Isolierung von primären Kardiomyozyten.
    1. Euthanasieren Sie Rattenwelpen (5-6 Tage nach der Geburt) mit CO2 -Erstickung. Stellen Sie die CO2 -Kammern auf 20 % Gasaustausch ein (Durchflussmenge = 0,2 x Kammervolumen pro min). Bestätigen Sie den Exitus durch das Fehlen des Einklemmreflexes.
    2. Entfernen Sie die Vorhöfe mit den verbindenden großen Blutgefäßen mit sterilisierten Instrumenten (z. B. Pinzetten und gebogenen Scheren)41. Übertragen Sie die Herzen in 50-ml-Röhrchen mit sterilem PBS mit 1 % P/S (PBS-P/S) auf Eis.
    3. Die Ventrikuli halbieren und das Blut in einer 10-cm-Schale mit 10 mL PBS-P/S auf Eis ausspülen lassen. Schneiden Sie die Ventrikelwände mit einer gebogenen Schere in kleine Stücke (Durchmesser = 2-3 mm).
    4. Übertragen Sie die Herzstücke von 10-12 Tieren mit einer serologischen Pipette in ein 50-ml-Röhrchen und lassen Sie sie sich absetzen.
    5. Entfernen Sie so viel PBS-P/S wie möglich, ohne Herzstücke zu entfernen. Fügen Sie 10 mL neues PBS-P/S hinzu.
  2. Verdauen Sie das Herzgewebe, um die Kardiomyozyten zu isolieren.
    1. Lassen Sie die Herzstücke ruhen. Ersetzen Sie das PBS-P/S durch 10 mL 0,15% Trypsin in PBS und schütteln Sie es 10 Minuten lang bei 37 °C.
    2. Entsorgen Sie den Überstand. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2.1 beschriebenen Aufschluss noch dreimal, aber dekantieren Sie die Überstände in 50-ml-Sammelröhrchen mit 10 ml 100 % FBS.
  3. Die Zellen zentrifugieren (400 x g, 5 min) und den Überstand ansaugen. Resuspendieren Sie die Zellen in DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S und säen Sie sie auf eine 6-Well-Platte (1 x 10,5 Zellen/cm2, 2 ml Medium pro Well).
  4. Nach 1 Stunde wird das Medium mit den nicht anhaftenden Zellen in ein 50-ml-Röhrchen umgefüllt und die angehängten Zellen verworfen. Zählen Sie die Zellen in Suspension und plattieren Sie sie wieder in neue 6-Well-Platten (1 x 105 Zellen/cm2, 2 mL DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S pro Well).
  5. Hemmung der Zellproliferation mit Bromodeoxyuridin (BrdU).
    Achtung: BrdU ist ein starkes Teratogen und steht im Verdacht, mutagen zu sein. Bitte stellen Sie sicher, dass eine angemessene Schulung durchgeführt wird, und lesen Sie vor der Verwendung das Sicherheitsdatenblatt.
    1. Sobald sich die Zellen anheften, ersetzen Sie das Medium in der 6-Well-Platte durch DMEM-F12, das 10 % FBS, 1 % P/S (2 mL Medium pro Well) und 5 μM BrdU enthält. 16 h (37 °C, 5 % CO2) inkubieren.
    2. Entfernen Sie das BrdU-haltige Medium und ersetzen Sie es durch DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S (2 ml Medium pro Well).
  6. Bereiten Sie vorgefärbte MSCs vor.
    1. Sobald die MSC-Kulturen in 10-cm-Schalen eine Konfluenz von 70-80 % erreicht haben, entfernen Sie das Kulturmedium und fügen Sie 3 ml Zelldissoziationslösung hinzu. Das Gericht bei 37 °C und 5 % CO2 5 min inkubieren.
    2. Die dissoziierten Zellen werden in ein 15-ml-Röhrchen umgefüllt und 5 Minuten lang bei 400 x g zentrifugiert.
    3. Aspirieren Sie den Überstand, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM-F12, das 10 % FBS und 1 % P/S enthält, zur Zählung mit einem automatisierten Zellzähler.
    4. Verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 106 MSC/ml DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S.
    5. Inkubieren Sie die MSCs mit lebensfähigem, nicht übertragbarem Fluoreszenzfarbstoff (5 μM, 30 min, 37 °C, 5 % CO2) in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für 1 h.
    6. Die Röhrchen werden 5 min lang bei 400 x g zentrifugiert. Der Überstand wird aspiriert und das Pellet in DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S für eine Zellkonzentration von 1 x 106 MSC/ml resuspendiert. Wiederholen Sie dies insgesamt 3 Mal.
  7. Die MSC werden in einer Konzentration von 10 x 10 4 Zellen pro Vertiefung der 6-Well-Platte auf Kardiomyozyten (Schritt 2.5.2) übertragen.

3. Vorbereitung von Aggregat-Co-Kulturen

  1. Bereiten Sie eine einzellige Suspension von MSCs (2 x 104 Zellen/ml Medium, Passage # ≤ 6) in alpha-MEM vor, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S (siehe Schritt 2.6).
    HINWEIS: Siehe Abschnitt 1 des Protokolls für die Passage von Zellen. Alternativ können MSCs gemäß Schritt 2.6 vorgefärbt werden.
  2. Initiieren Sie die Aggregatbildung, indem Sie 25-μl-Tropfen der Zellsuspension (500 Zellen) auf die Innenfläche der Deckel von 10-cm-Gewebekulturschalen (bis zu 50 Tropfen pro Deckel) geben. Setzen Sie die Deckel auf die unteren Gegenstücke, die PBS-P/S enthalten. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO2,
    HINWEIS: Geben Sie 5-7 ml PBS-P/S in die Kulturschale unter den hängenden Tropfen, um eine Verdunstung der Tropfen zu vermeiden.
  3. Beobachten Sie die Aggregatbildung in den Tropfen nach 3 Tagen mit einem Stereomikroskop. Wenn mehr als 40 von 50 Tropfen gebildete Aggregate enthalten, die Tropfen mit einer 1-ml-Mikropipette von den Lidern auffangen und die Aggregate direkt auf primäre Kardiomyozyten-Monoschichten der Ratte übertragen (hergestellt in den Schritten 2.1-2.7; 10 Tropfen/Vertiefung). Vermeiden Sie heftiges Pipettieren, um die Integrität des Aggregats zu erhalten.
  4. Bewahren Sie aggregierte Co-Kulturen bis zu 2 Wochen in den Inkubatoren auf und wechseln Sie das gesamte Volumen des Mediums (2 ml DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S pro Vertiefung) alle 72 Stunden.
    1. Beobachten Sie täglich Aggregate, die sich mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie an den Feeder-Zellschichten anlagern. Erfassen Sie Vertragsaggregate, wenn sie beobachtet werden.
  5. Bereiten Sie Aggregate für die Analyse vor.
    1. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 2 ml PBS pro Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturschale hinzu. Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 2 ml Dissoziationslösung pro Vertiefung hinzu. 3 min bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren.
    2. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 400 x g, um ein Zellpellet zu erhalten. Resuspendieren Sie in einem Medium, wie für die in den nachfolgenden Schritten beschriebenen Anwendungen (siehe Schritte 4.1, 5.1 und 6.1) und passieren Sie ein 70-μm-Zellsieb.

4. Durchflusszytometrie (FC) und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

  1. Inkubieren Sie Zellsuspensionen (1 x 105 Zellen in 200 μl PBS mit 3 % FBS) mit Fluorophor-konjugierten (FITC oder APC) Primärantikörpern (d. h. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G und SIRPA für FC oder TRA-1-85 für FACS; 1:40) bei 4 °C für 30 min und vor Licht geschützt.
  2. Zentrifugieren (400 x g, 5 min) und resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL PBS mit 3 % FBS für FC oder PBS mit 0,5 % FBS für FACS.
    HINWEIS: Der FC von MSCs wurde von Hong et al. optimiert.41.
  3. Halten Sie die Zellen im Dunkeln bei 4 °C, bis sie bereit sind, mit FC (mindestens 1 x 104 Ereignisse) oder FACS analysiert zu werden. Sortieren Sie die Zellen wie beschrieben41. Re-Plate von TRA-1-85 hoch-positiven sortierten Zellen in 6-Well-Platten (1 x 104 Zellen/Well, 2 mL DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S) innerhalb von 1 h.
    HINWEIS: Für die Gating-Strategie des TRA-1-85 menschlichen Zelloberflächenantigens siehe die ergänzende Abbildung.

5. Immunzytochemie (ICC) und Mikroskopie

  1. Die aus den Co-Kulturen (Schritt 3.5.2) oder FACS (Abschnitt 4) gewonnenen Zellsuspensionen werden erneut auf Kammerobjektträger aufgebracht (1 x 104 Zellen/Well, 2 ml DMEM-F12 mit 10 % FBS und 1 % P/S pro Well). Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator anheften (siehe Abschnitt 1 für die Bedingungen).
  2. Fixieren Sie die Zellen mit 3 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie 3 Mal mit 3 ml PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA; PBS-BSA) für 5 min pro Waschgang
    Achtung: Tragen Sie beim Umgang mit PFA geeignete persönliche Schutzausrüstung.
  3. Permeabilisieren Sie die Zellen in 3 mL PBS-BSA mit 0,1% Triton X-100. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten für intrazelluläre Antigene (d. h. alpha-sarkomerisches Actinin (aSarc) und Cx43) oder 25 Minuten für intranukleäre Antigene (d. h. Mef2c und humanes nukleäres Antigen (HuNu)). 3 Mal mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang waschen.
  4. Blockieren Sie die Proben gegen unspezifische Antikörperreaktionen mit 3 ml PBS, die 5 % normales Ziegenserum (NGS) und 1 % BSA enthalten, für 15 Minuten bei Raumtemperatur. 3 Mal mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang waschen.
  5. Inkubieren Sie die Zellen in den primären Antikörpern (d. h. Mef2c, aSarc, Cx43 und HuNu), verdünnt 1:200 in 3 ml PBS-BSA bei 4 °C über Nacht.
  6. 3 x waschen mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang und 30 min bei Raumtemperatur mit Sekundärantikörpern inkubieren. 3 Mal mit 3 mL PBS-BSA für 5 min pro Waschgang waschen.
  7. Lagern Sie die gefärbten Proben in 3 ml Einbettmedium.
  8. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop auf. Verwenden Sie ein 10-faches Objektiv (NA = 0,3) und ein 20-faches Objektiv (NA = 0,45) für Aufnahmen mit geringerer Vergrößerung. Für die verwendeten Sekundärantikörper sind Fluoreszenzfilterwürfel und Wellenlängen für GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) und RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) zu verwenden (siehe Tabelle Materialien und Ausrüstung).
  9. Quantifizieren Sie Bilder mit Bildgebungssoftware (die empfohlene Software finden Sie in der Tabelle "Materialien und Ausrüstung"). Normalisieren Sie die Messwerte der Fluoreszenzintensität auf die Sekundärkontrollerfassungen.

6. RNA-Isolierung und quantitative RT-PCR

  1. Bereiten Sie RNA-Proben aus undifferenzierten MSC-Kulturen oder MSCs, die aus Co-Kulturen mit säulenbasierter RNA-Isolierung sortiert wurden, gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Bereiten Sie 1 x 104 bis 1 x 106 Zellen in 0,7 ml Zelllysepuffer (im Lieferumfang des RNA-Isolationskits enthalten) pro Probe vor.
  2. Bereiten Sie cDNA aus bis zu 2 μg RNA pro 100-μl-RT-Reaktion vor.
  3. Führen Sie die qPCR mit 10 ng cDNA pro Reaktion durch (40 Zyklen, 60 °C Glüh-/Verlängerungstemperatur).
    1. Verwenden Sie Primer für humanes MY6H und cTnT in einer Konzentration von 500 nM und 1-100 ng cDNA pro Reaktion (siehe Material- und Ausrüstungstabelle). Verwenden Sie GAPDH, ACTB und HPRT als interne Normalisierer für die Haushaltsführung. Als Positivkontrolle werden kommerziell erhältliche human-induzierte pluripotente Stammzell-Kardiomyozyten verwendet.
      HINWEIS: Drücken Sie die Faltungsänderung der Expression im Vergleich zu undifferenzierten MSC-abgeleiteten cDNA-Proben aus.

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Ergebnisse

HUCPVCs weisen ein höheres Potenzial für die Bildung von Aggregaten und höhere Expressionen von CD49f im Vergleich zu BMSCs auf:

Um die Differenzierung von hMSCs (d. h. FTM HUCPVCs, term HUCPVCs und BMSCs) zu induzieren, wurden Einzelzell-Suspensionen undifferenzierter MSCs bzw. MSC-haltige Hängtropfen (Tabelle 1) auf primäre Kardiomyozyten-Monolayer von Ratten übertragen, um direkte Ko...

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Diskussion

Die kardialen Differenzierung von Stammzellen wird mit mehreren unterschiedlichen Strategien genutzt, um Cardiomyocyte-wie Zellen aus MSC Quellen erzeugen seit über 2 Jahrzehnten entwickelt. Viele dieser Strategien sind jedoch ineffizient und die Bedingungen sind oft nicht repräsentativ für die Umwelt transplantierten Zellen Begegnung in Vivo.

Im Gegensatz zu bestehenden Verfahren nutzt das Protokoll hier vorgestellten eine Kombination von primären kardiale Feeder Schichten und MSC Ag...

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Offenlegungen

Dr. Clifford L. Librach ist Mitinhaber des Patents: Methoden der Isolation und der Verwendung von Zellen aus ersten Trimester Nabelschnur Gewebe, in Kanada und Australien gewährt.

Danksagungen

Die Autoren danken den folgenden Mitarbeiter und Forschung Personal für ihre Beiträge: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg und Andrée Gauthier-Fisher. Diese Arbeit wurde von der Ontario Research Fund - Research Excellence (ORF-RE, Runde #7) und erstellen Programm Inc. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,25 % Trypsin/EDTAGibco25200056Für die Zelldissoziation
Alpha-MEMGibco12571071Für HUCPVC- und BMSC-Kulturmedien.
PE-konjugierter Anti-Human/Maus-CD49f-AntikörperBiolegend313612Integrin-Marker für FC
APC-konjugierten humanen Cx43/GJA1-AntikörperR& D SystemsFAB7737AConnexin 43 Marker für FC
FITC-konjugierten HLA-A2-AntikörperGenway Biotech Inc.GWB-66FBD2Immunogenitätsmarker für FC
FITC-konjugierten anti-HLA-G [MEM-G/9]-AntikörperAbcamab7904Immunogenitätsmarker für FC
FITC-konjugierten Maus-Anti-humanen SIRPA/CD172a-AntikörperAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FHerzmarker für FC
APC-konjugierten humanen TRA-1-85/CD147-AntikörperR& D SystemsFAB3195Ahumaner Zellmarker für FC- und
humane TRA-1-85/CD147-AntikörperR& D SystemsFAB3195Fhumaner Zellmarker für FC und FACS
Anti-Connexin 43/GJA1 AntikörperAbcamab11370Cx43. Für ICC
Goat Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzresorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Für ICC
Anti-sarkomerisches Alpha-Actinin [EA-53] AntikörperAbcamab9465aSARC. Für ICC
Ziegen-Anti-Maus-IgM-Schwerketten-Kreuzabsorber-Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426Für ICC
Mef2C (D80C1) XP Kaninchen-AntikörperNew England BioLabs Ltd.5030SFür ICC
Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L) Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Für ICC
Anti-Nuclei (HuNu) (Klon 235-1) AntikörperEMD MilliporeMAB1281Für ICC
MZ9.5 StereomikroskopLeicaFür bildgebende Aggregate.
1,5 ml Zentrifugen-MikroröhrchenAxygenMCT-150-CZum Färben von MSCs mit Fluoreszenzfarbstoff.
ImageJOpen-Source-Bildverarbeitungssoftware.
Aria II BD UHN SickKids FC Einrichtung. Für die Zellsortierung.
mesechymale Stromazellen des Knochenmarks,LonzaPT-2501BMSCs,
RinderserumalbuminSigma-Aldrich, A7030-100G, BSA. Zur Vorbereitung von Lösungen für ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424Achtung: BrdU ist ein starkes Teratogen und steht im Verdacht, mutagen zu sein. Bitte achten Sie auf eine ordnungsgemäße Schulung und lesen Sie vor der Verwendung das Sicherheitsdatenblatt.
Canto IIBDUHN SickKids FC Einrichtung. Für die Durchflusszytometrie.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570Zur Vorbereitung von cDNA für die qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Fluoreszierende Bildgebung von Zellzytoplasma
Countess automatisierter ZellzählerInvitrogen Inc.C10227Für die Zellzählung
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Für primäres Kardiomyozyten-Kulturmedium für Ratten.
Dulbecco's Phosphatgepufferte KochsalzlösungGibco10010023D-PBS, ohne Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesHauseigenes Fluoreszenzmikroskop
FACSCaliburBDInhouse. Für die Durchflusszytometrie.
Fötales Rinderserum (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Bestandteil des Zellkulturmediums.
IDT Prime Time qPCR-SondenIntegrated Data TechnologiesFAM-Fluorophorhttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Wässriges EindeckmediumThermoScientificTA-030-FMZur Lagerung von Zellen für die ICC
LSR II BD UHN SickKids FC Einrichtung. Für die Durchflusszytometrie.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Einrichtung. Für die Zellsortierung.
Normales ZiegenserumCell Signaling Technology5425SNGS. Wird in der Blockierungslösung für ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass verwendet, 8 VertiefungenThermo Scientific Nunc155409Zur Vorbereitung von Proben für ICC
OmniPur Triton X-100 TensidEMD Millipore9410-OPAls Bestandteil einer permeabilisierenden Lösung bei der Vorbereitung von Zellen für ICC
Paraformaldehyd, 16%ige Lösung, EM GradeElektronenmikroskopie Sciences15710Zur Fixierung von Zellen für ICC.
Penicillin/StreptomycinGibco15140122Bestandteil des Zellkulturmediums.
PrimerSigmaCustom Standard DNA-Oligos, entsalzt, 0,2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G
Quorum Spinning Disk KonfokalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Aus hiPS-Zellen gewonnene KardiomyozytenReproCellRCD001NPositivkontrolle für qPCR
RNeasy Mini-KitQiagen74106Zur Isolierung von RNA für die qPCR
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Für qPCR mit Mastermix
RPMI 1640GibcoA1049101Für MSC, Monozyten-Cokulturmedium.
TaqMan qPCR-Primer-AssaysThermo Fisher Scientific4444556Für qPCR
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Färbung von Zellen auf Lebensfähigkeit und Zählung
TrypsinGibco272500108Für die Zelldissoziation
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3Bildgebungssoftware
0,2 μ m PorenfilterThermo Fisher Scientific566-0020Zur Sterilisation von Gewebekulturmedien
HERAcell 150i CO2 InkubatorThermo Fisher Scientific51026410Zur Inkubation von Zellen
Dulbecco's phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-AldrichD8537PBS. 1X, Ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid
PinzetteAlmedic7727- A10-704Zum Reichen von Rattenherzen. Kann jede ähnliche Pinzette verwenden.
SchereFine Science Tools14059-11Zum Zerkleinern von Rattenherzen. Gebogene Schere empfohlen.
50-ml-RöhrchenBD Falcon352070Für die Entnahme bei der Kardiomyozyten-Entnahme und allgemeinen Gewebekulturverfahren
15-ml-RöhrchenBD Falcon352096Für allgemeine Gewebekulturverfahren
6-Well-PlattenThermo Scientific NuncCA73520-906Für Gewebekulturen
10 cm GewebekulturschalenCorning25382-428Für die Aggregatbildung
Axiovert 40C MikroskopZeissFür die Hellfeld-Bildgebung in unserer Gewebekultur und dem Rest des Protokolls
70 & mu; m Zell-SiebFisherbrand22363548Zur Sicherstellung einer Einzelzellsuspension vor der Durchflusszytometrie oder Sortierung
Triton X-100EMD Millipore9410-1LWird in der Permeabilisierungslösung für ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Fleck verwendet, der bei der Visualisierung der Cx43-Lokalisierung verwendet
FACS-FITC-konjugierte, , wird

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