Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Summary

Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.

Abstract

Die Analyse des zellulären Proteoms kann dazu beitragen, die molekularen Mechanismen, die den Krankheiten zugrunde liegen, durch die Entwicklung von Technologien zu erhellen, die die großflächige Identifizierung und Quantifizierung der in komplexen biologischen Systemen vorhandenen Proteine ​​ermöglichen. Das Wissen, das aus einem proteomischen Ansatz gewonnen wird, kann möglicherweise zu einem Ein besseres Verständnis der pathogenen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, die die Identifizierung von neuartigen diagnostischen und prognostischen Krankheitsmarkern und hoffentlich von therapeutischen Zielen ermöglichen. Allerdings stellt das Herz-Mitralklappen eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse aufgrund der geringen Zellularität in der Proteoglycan- und Kollagen-angereicherten extrazellulären Matrix dar. Dies macht es schwierig, Proteine ​​für eine globale Proteomanalyse zu extrahieren. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das mit der nachfolgenden Proteinanalyse kompatibel ist, wie z. B. quantitative Proteomik und Immunoblotting. Dies kann die Korrelation der Daten betreffenG Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analyse. In der Tat werden diese Ansätze, wenn sie zusammen durchgeführt werden, zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die Krankheiten zugrunde liegen, von mRNA zu posttranslationaler Proteinmodifikation. So kann diese Methode für Forscher relevant sein, die sich für die Untersuchung der Herz-Ventil-Physiopathologie interessieren.

Introduction

Der jüngste Beweis hat das Verständnis der Rollen der vielen regulatorischen Mechanismen, die nach der mRNA-Synthese auftreten, verändert. In der Tat können translatorische, posttranskriptionelle und proteolytische Prozesse die Proteinabundanz und -funktion regulieren. Das Dogma - das sagt, dass mRNA-Konzentrationen Proxies zu denen der entsprechenden Proteine ​​sind, unter der Annahme, dass Transkript-Ebenen die Hauptdeterminante der Protein-Häufigkeit sind - wurde teilweise überarbeitet. In den Transkript-Ebenen nur teilweise prognostizieren Protein-Fülle, was darauf hindeutet, dass post-Transkription Ereignisse Um die Proteine ​​innerhalb der Zellen

Protocol

In diesem Protokoll werden die menschlichen Herzen während der Multiorgan-Explantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h, Mittelwert 6 ± 2 h) von Multiorganspendern, die aus der Organtransplantation aus technischen oder funktionalen Gründen ausgeschlossen sind, trotz normaler echokardiographischer Parameter gesammelt. Sie werden an die Herz-Kreislauf-Tissue Bank von Mailand, Monzino Cardiologic Center (Mailand, Italien) für die Bank der Aorten- und Pulmonalventile geschickt. Die Mitral-posterioren Blättchen werden nicht für klinische Zwecke verwendet, so dass sie während der Aorten- und Lungenventilisolation gesammelt werden, nachdem eine informierte Zustimmung von den ....

Results

Die Extraktion und Auflösung von Proteinen im Harnstoffpuffer ist direkt mit proteomischen Methoden auf der Basis von Isoelektrofokussierung (zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) ¹¹ und Flüssigphasen-isoelektrische Fokussierung (IEF) ¹² ) und mit Immunoblotting nach Verdünnung im Laemmli-Puffer ¹³ verträglich Mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail ¹⁴ .

Discussion

Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung von flüssigem Stickstoff, um die Probe einzufrieren und das Mahlsystem zu kühlen. Die Verwendung von flüssigem Stickstoff verhindert biologischen Abbau und ermöglicht eine effiziente Pulverisierung, erfordert aber eine spezielle Schulung für eine sichere Handhabung.

In diesem Protokoll ist ein Schleifsystem für das Probenschleifen, da kleine Proben schwer von Standardmörtel und Stößeln zu erholen sind. In diesem Fall breiten sich kl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kochsalzlösung			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Transportmedium für ausgeglichene Organe. Kombinieren Sie 400 mL Eurocollins A mit 100 mL Eurocollins B, um das ausgewogene Medium Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Transportmedium des ausgeglichenen Organs zu erhalten. Kombinieren Sie 400 mL Eurocollins A mit 100 mL Eurocollins B, um ein ausgewogenes Medium zu erhalten Eurocollins
Wisconsin	Brückenlebensdauer	RM/N 4081	Ausgeglichenes Organtransportmedium
Biohazard vertikale Strömung	Luft Burdinola		Klasse A GMP-Klassifizierung
Dewarflasche	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
Kryoschleifer-System	OPS-Diagnose	CG 08-01	Schleifsystem mit Mörsern, Stößeln und Schraubendrehern
Pinzetten
Edelstahl Spatel
Steriles Einwegskalpell	Medisafe	MS-10
Edelstahlschere			Autoklavierbar
Plektren			Autoklavierbar
Steriles Einwegtuch	Mon& Tex	3.307.08
Sterilisationslösung mit Isopropylalkohol			70% Isopropylalkohol
Sterilisationslösung mit Wasserstoffperoxid			6% Wasserstoffperoxid
Mikropipette, 1 mL, mit Spitzen
15 mL Zentrifugenröhrchen	VWR international	9278
1,7 mL Zentrifugenröhrchen	VWR international	PIER90410
Harnstoffpuffer			8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Harnstoff	Sigma aldrich	U6504-1KG	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
Thioharnstoff	Sigma aldrich	T8656	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
Dithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
Spritze 50 mL	PIC		Zur Verwendung zur Filterung von Harnstoffpuffer
0,22 & Mikro; m Filter	Millipore	SLGP033RB	Zur Verwendung zur Filtration von Harnstoffpuffer
PFTE Stößel, 2 mL	Kartell	6302	Teil des Potter-Elvehjem Homogenisators
Borosilikatglasmörser	Kartell	6102	Teil des Potter-Elvehjem Homogenisators
Rührer VELP	scientifica	Rührer DLH	Zur Verwendung für die Homogenisierung durch Potter-Elvehjem
Bradford Protein Assay	Bio-Rad Laboratorien	5000006
Röhrenrotator	Pbi International	F205
Flüssigstickstoff
Aluminiumfolie
Eis
Polystyrolbox
Trockeneiszentrifuge
			Für die Zentrifugation von 1,7 mL Zentrifugenröhrchen bei 13.000 x g
Gefrierschrank -80°; C
Präzisionswaage
Autoklav			Für die
Sterilisation Kryogene Handschuhe für Flüssigstickstoff
Handschuhe
Professionelle Zwangsbeatmung und natürlicher Luftkonvektionsofen			Für die Sterilisation
Proteasehemmer Cocktail	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X Lösung
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	Version 2.7	Softwareplattform für die Gen-Ontologie-Analyse
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	Version 3.0.3	Plugin für die Gen-Ontologie-Analyse
AlphaB Crystallin/CRYAB Antikörper	Novus Biologicals	NBP1-97494	Maus monoklonaler Antikörper gegen CryAB
Septin-11 Antikörper	Novus Biologicals	NBP1-83824	Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen Septin-11
FHL1 Antikörper	Novus Biologicals	NBP-188745	Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen FHL-1
Dermatopontin Antikörper	Novus Biologicals	NB110-68135	Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Dermatopontin
Ziege Anti-Maus-IgG HRP Sigma	aldrich	A4416-0,5ML	Sekundärer Antikörper gegen Immunblotting
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	HRP Bio-Rad Laboratorien	170-5046	Sekundärer Antikörper gegen Immunblotting