Optimiertes Protokoll zur Extraktion von Proteinen aus dem menschlichen Mitralventil

Summary

Die Proteinzusammensetzung des menschlichen Mitralklappens ist noch teilweise unbekannt, weil seine Analyse durch niedrige Zellularität und damit durch eine geringe Proteinbiosynthese kompliziert wird. Diese Arbeit liefert ein Protokoll zur effizienten Extraktion von Protein für die Analyse des Mitralklappenproteoms.

Abstract

Die Analyse des zellulären Proteoms kann dazu beitragen, die molekularen Mechanismen, die den Krankheiten zugrunde liegen, durch die Entwicklung von Technologien zu erhellen, die die großflächige Identifizierung und Quantifizierung der in komplexen biologischen Systemen vorhandenen Proteine ​​ermöglichen. Das Wissen, das aus einem proteomischen Ansatz gewonnen wird, kann möglicherweise zu einem Ein besseres Verständnis der pathogenen Mechanismen, die Krankheiten zugrunde liegen, die die Identifizierung von neuartigen diagnostischen und prognostischen Krankheitsmarkern und hoffentlich von therapeutischen Zielen ermöglichen. Allerdings stellt das Herz-Mitralklappen eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse aufgrund der geringen Zellularität in der Proteoglycan- und Kollagen-angereicherten extrazellulären Matrix dar. Dies macht es schwierig, Proteine ​​für eine globale Proteomanalyse zu extrahieren. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll, das mit der nachfolgenden Proteinanalyse kompatibel ist, wie z. B. quantitative Proteomik und Immunoblotting. Dies kann die Korrelation der Daten betreffenG Proteinexpression mit Daten über die quantitative mRNA-Expression und nicht-quantitative immunhistochemische Analyse. In der Tat werden diese Ansätze, wenn sie zusammen durchgeführt werden, zu einem umfassenderen Verständnis der molekularen Mechanismen führen, die Krankheiten zugrunde liegen, von mRNA zu posttranslationaler Proteinmodifikation. So kann diese Methode für Forscher relevant sein, die sich für die Untersuchung der Herz-Ventil-Physiopathologie interessieren.

Introduction

Der jüngste Beweis hat das Verständnis der Rollen der vielen regulatorischen Mechanismen, die nach der mRNA-Synthese auftreten, verändert. In der Tat können translatorische, posttranskriptionelle und proteolytische Prozesse die Proteinabundanz und -funktion regulieren. Das Dogma - das sagt, dass mRNA-Konzentrationen Proxies zu denen der entsprechenden Proteine ​​sind, unter der Annahme, dass Transkript-Ebenen die Hauptdeterminante der Protein-Häufigkeit sind - wurde teilweise überarbeitet. In den Transkript-Ebenen nur teilweise prognostizieren Protein-Fülle, was darauf hindeutet, dass post-Transkription Ereignisse Um die Proteine ​​innerhalb der Zellen ^{1 , 2 zu regulieren} .

Darüber hinaus diktieren Proteine ​​schließlich die Funktion der Zelle und diktieren daher ihren Phänotyp, der dynamische Veränderungen in Reaktion auf autokrine, parakrine und endokrine Faktoren erfahren kann; Blutübertragene Vermittler; Temperatur; Medikamentöse Behandlung; Und krankheit entwickeln sich. So ist eine Expressionsanalyse, die auf die Proteinebene fokussiert ist, nützlich, um das Proteom zu charakterisieren und die kritischen Veränderungen, die ihm als Teil der Krankheitspathogenese auftreten, zu entschlüsseln.

Daher sind die Chancen, die die Proteomik zur Klärung von Gesundheits- und Krankheitsverhältnissen bietet, trotz der bestehenden technologischen Herausforderungen furchtbar. Die besonders vielversprechenden Forschungsgebiete, denen die Proteomik beitragen kann, beinhalten: die Identifizierung der veränderten Proteinexpression auf jeder Ebene ( dh ganze Zellen oder Gewebe, subzelluläre Kompartimente und biologische Flüssigkeiten); Die Identifizierung, Überprüfung und Validierung von neuartigen Biomarkern, die für die Diagnose und Prognose von Krankheiten nützlich sind; Und hoffentlich die Identifizierung neuer Proteinziele, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, sowie für die Beurteilung der Arzneimittelwirksamkeit und Toxizität ⁴ .

Erfassen der Komplexität vonDas Proteom stellt eine technologische Herausforderung dar. Die aktuellen Proteomwerkzeuge bieten die Möglichkeit, eine groß angelegte Hochdurchsatzanalyse zur Identifizierung, Quantifizierung und Validierung veränderter Proteingehalte durchzuführen. Darüber hinaus hat die Einführung von Fraktionierungs- und Anreicherungstechniken, die darauf abzielen, die Interferenz zu vermeiden, die durch die am häufigsten vorkommenden Proteine ​​verursacht wird, auch die Proteinidentifizierung verbessert, indem sie die am wenigsten vorhandenen Proteine ​​einschließen. Schließlich wurde die Proteomik durch die Analyse von posttranslationalen Modifikationen ergänzt, die schrittweise als wichtige Modulatoren der Proteinfunktion auftauchen.

Allerdings bleiben die Probenvorbereitung und die Proteingewinnung in den untersuchten biologischen Proben nach wie vor die begrenzenden Schritte im proteomischen Arbeitsablauf und erhöhen das Potenzial für mögliche Fallstricke ⁵ . In der Tat, in den meisten der molekularbiologischen Techniken, die optimiert werden müssen, sind die ersten Schritte Gewebe HomogenisierungIonen- und Zelllyse, insbesondere während der Analyse von Proteinen mit geringer Häufigkeit, für die keine Amplifikationsmethoden existieren. Darüber hinaus kann die chemische Natur von Proteinen ihre eigene Erholung beeinflussen. Zum Beispiel ist die Analyse von hoch hydrophoben Proteinen sehr schwierig, da sie während der isoelektrischen Fokussierung leicht ausfallen, während trans-Membranproteine ​​nahezu unlöslich sind (siehe Referenz 5). Darüber hinaus schafft die Gewebszusammensetzungsvariabilität eine signifikante Barriere für die Entwicklung eines universellen Extraktionsverfahrens. Schließlich, da fast alle klinischen Proben von begrenzter Menge sind, ist es unerlässlich, die Proteinpräparation mit maximaler Wiedergewinnung und Reproduzierbarkeit aus minimalen Probenmengen zu ermöglichen ⁶ .

Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Protokoll für die Proteinextraktion aus dem normalen menschlichen Herzrhythmusventil, das eine sehr anspruchsvolle Probe für die proteomische Analyse darstellt. Das normale Mitralklappe ist ein KompLex-Struktur, die zwischen dem linken Vorhof und dem linken Ventrikel des Herzens liegt (Abbildung 1 ). Es spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Blutflusses vom Atrium zum Ventrikel, verhindert den Rückfluss und sorgt für die richtige Sauerstoffversorgung des ganzen Körpers, wodurch ein adäquates Herzzeitvolumen aufrechterhalten wird. Allerdings wird es oft als ein "inaktives" Gewebe betrachtet, mit einer geringen Zellularität und wenigen Komponenten, hauptsächlich in der extrazellulären Matrix. Dies liegt daran, dass unter normalen Bedingungen die residenten valvularen interstitiellen Zellen (VICs) einen ruhigen Phänotyp mit einer niedrigen Proteinbiosyntheserate ⁷ darstellen.

Es wurde jedoch gezeigt, dass in einem pathologischen Zustand die Anzahl der VICs in der Spongiosa zunimmt und ihre Proteinsynthese zusammen mit anderen funktionellen und phänotypischen Veränderungen aktiviert wird. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die minimalen Daten inDie Literatur konzentriert sich auf die Analyse der pathologischen Mitralklappen ^{9 , 10} , bei denen die erhöhte Anzahl aktivierter VICs die relativ hohe Anzahl identifizierter Proteine ​​erklären könnte.

Abschließend kann das vorliegende Protokoll dazu dienen, das Verständnis der pathogenen Mechanismen, die für Mitral-Ventil-Erkrankungen verantwortlich sind, durch die Untersuchung von Mitralklappen-Protein-Komponenten zu entwickeln. In der Tat könnte ein besseres Verständnis der zugrunde liegenden pathologischen Prozesse dazu beitragen, das klinische Management von Ventilkrankheiten zu verbessern, deren derzeitige Indikationen für die Intervention weitgehend auf hämodynamische Überlegungen beruhen.

Protocol

In diesem Protokoll werden die menschlichen Herzen während der Multiorgan-Explantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h, Mittelwert 6 ± 2 h) von Multiorganspendern, die aus der Organtransplantation aus technischen oder funktionalen Gründen ausgeschlossen sind, trotz normaler echokardiographischer Parameter gesammelt. Sie werden an die Herz-Kreislauf-Tissue Bank von Mailand, Monzino Cardiologic Center (Mailand, Italien) für die Bank der Aorten- und Pulmonalventile geschickt. Die Mitral-posterioren Blättchen werden nicht für klinische Zwecke verwendet, so dass sie während der Aorten- und Lungenventilisolation gesammelt werden, nachdem eine informierte Zustimmung von den Verwandten der Spender erhalten wurde. Das Gewebe für die Transplantation und Forschung wird erst nach der elterlichen Zustimmung gesammelt; Englisch : eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUri...0053: EN: HTML Auf der Einverständniserklärung genehmigen sie die Verwendung des Herzgewebes für die Forschung nur, wenn sie nicht für den menschlichen klinischen Gebrauch ( dh mikrobiologische, funktionelle und serologische Probleme) nach den Richtlinien des Ethik - Komitees vonMonzino Kardiologisches Zentrum.

1. Mitralklappenvorbereitung

1. Das menschliche Mitralklappe so schnell wie möglich nach der Organexplantation (kalte Ischämiezeit von 4-12 h) ernten.
2. In einem sauberen Raum, entfernen Sie das Herz aus dem Transportbeutel mit einer kalten (4 ° C) Lösung ( dh Kochsalzlösung oder ausgewogene Medium Eurocollins oder Wisconsin). Legen Sie es in einen Eimer und legen Sie ihn in einen Biosicherheitsschrank (Biohazard-Vertikal-Luftstrom, Klasse A, Good Manufacturing Practices (GMP) Klassifizierung), um mit der Ventilvorbereitung fortzufahren.
3. Legen Sie das Herz auf eine sterile Einweg-Tuch im Schrank. Mit einem sterilen Einweg-Skalpell, schneide das Herz ganz, senkrecht zu seiner Hauptachse, auf der Ebene der linken und rechten Ventrikel, etwa 4 cm entfernt von der Spitze.
4. Bewegen Sie die aufsteigende Aorta und die pulmonale Arterie, um das linke Vorhofdach anzuzeigen.
5. Mit sterilen autoklavierbaren Pinzetten und Picks, um die linke Ohrmuschel schneidenLinks atriales Dach, so dass das Mitralklappe sichtbar und ermöglicht die große Mitral-Prospekt (anterior) und die kleine Mitral-Broschüre (posterior) identifiziert werden.
   HINWEIS: Antero-laterale und hintere mediale Kommissuren definieren die Grenze der vorderen Broschüre und des hinteren Bereichs.
6. Mit sterilen autoklavierbaren Scheren und nichttraumatischen Zangen sezieren Sie den linken Vorhof und die Ventrikelwanddicke um den Umfang des gesamten Mitralklappens .
7. Identifizieren Sie die Mitro-Aortenklappen-Kontinuität.
   HINWEIS: Der linke Ventrikel enthält das ganze Mitralklappe und Akkorde.
8. Trennen Sie die vordere Mitralklappe aus dem hinteren Mitralklappenblatt, schneiden Sie die hintere Blättchen entlang der Einfügung mit dem Ventrikel (Commissure).
9. Waschen Sie die hintere Broschüre in der Kochsalzlösung. Schneiden Sie die Broschüre in kleine Stücke (<1 cm ² ) und wickeln Sie sie einzeln in Aluminiumfolie ein. Snap-freeze sie mit flüssigem Stickstoff.
   Achtung: Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff die organisatorischen Sicherheitsmaßnahmen beachten.
   1. Den Tisch des Schrankes mit einer 70% igen Isopropylalkohollösung und einer 6% igen Wasserstoffperoxidlösung am Ende des Verfahrens abgeben.

2. Proteinextraktion

1. Verwenden Sie Pinzette, um die in flüssigem Stickstoff gespeicherte Probe aufzunehmen und sofort auf Trockeneis zu legen, während sie noch in die Aluminiumfolie eingewickelt ist. Lassen Sie die Probe nicht während der Transfers auftauen.
2. Vor dem Schleifen den Porzellan / Zirkonium-Mörser und die Stößel eines Mahlsystems ( z. B. CryoGrinder) zusammen mit der Probe kühlen, indem man sie in einen Dewar-Kolben mit flüssigem Stickstoff (~ 500 ml) bringt.
   Achtung: Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff die organisatorischen Sicherheitsmaßnahmen beachten.
3. Setzen Sie den Mörser und die Pistillen in eine Polystyrol-Box mit Trockeneis. Entfernen Sie die Probe von der Aluminiumfolie und stecken Sie sie in den Mörtel.
4. Schleifen tEr Probe mit der großen Stößel gegen den Mörtel 15-20 mal, mit dem Schraubendreher, um die Stößel zu drehen. Mischen Sie die Probe mit der Spitze eines vorgekühlten Spatels während des Mahlprozesses.
   1. Wiederholen Sie mit der kleinen Stößel.
5. Übertragen Sie die Bodenprobe auf ein zuvor gewogenes Rohr ( z. B. 15 mL Zentrifugenröhrchen), indem Sie das Röhrchen umkehren, über den Mörtel legen und umdrehen, um die Probe in die Röhre zu bewegen. Verwenden Sie einen vorgekühlten Spatel, um alle Materialien aus dem Mörser zu erholen.
   1. Halten Sie das Röhrchen mit der Probe auf Trockeneis, um Probenproben während der Übertragung zu vermeiden.
6. Berechnen Sie das Nettogewicht der Probe.
7. Reinigen Sie den Mörser und die Pistillen nach jeder Probe und dekontaminieren sie durch Autoklavieren oder Erwärmen bei 200 ° C für 2 h.
8. Übertragen Sie die pulverförmige Probe aus dem Zentrifugenröhrchen in die Glasröhre eines Homogenisators durch Inversion.
9. Füge gefilterten Harnstoff zu(8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% G / V CHAPS, 20 mM Tris und 55 mM Dithiotreitol) zum Glasröhrchen, 200 μl Harnstoffpuffer für je 10 mg pulverförmiges Gewebe.
   HINWEIS: Die im Zentrifugenröhrchen verbleibende Restpulverprobe kann unter Verwendung eines Teils des berechneten Harnstoffpaketes zurückgewonnen werden.
10. Homogenisieren der Probe unter Verwendung eines Rührers, der mit einem Borosilikatglasmörtel und einem Polytetrafluorethylen (PTFE) Pistill ausgestattet ist. Langsam die Pistille mit einer Drallbewegung (1.500 U / min) 10 mal auf die Probe drücken.
11. Den Überstand wiederherstellen und in ein sauberes 1,7-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Wiederholen Sie die restliche Probe mit frischem Harnstoffpuffer, indem Sie die Hälfte des bei der ersten Extraktion verwendeten Volumens hinzufügen.
12. Wiederholen Sie Schritt 2.10.
13. Erholen Sie den Überstand und kombinieren Sie ihn mit dem Überstand aus Schritt 2.11. Den zusammengesetzten Überstand für 30 min auf einen Rohrrotator stellen.
14. Das Röhrchen für 30 min bei 13.000 xg und 4 ° C zentrifugieren.
15. Den Überstand wiederherstellenD messen die Proteinkonzentration unter Verwendung des Bradford-Protein-Assays nach den Anweisungen des Herstellers. Die Probe bei -80 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.

Results

Die Extraktion und Auflösung von Proteinen im Harnstoffpuffer ist direkt mit proteomischen Methoden auf der Basis von Isoelektrofokussierung (zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) ¹¹ und Flüssigphasen-isoelektrische Fokussierung (IEF) ¹² ) und mit Immunoblotting nach Verdünnung im Laemmli-Puffer ¹³ verträglich Mit einem Protease-Inhibitor-Cocktail ¹⁴ .

Discussion

Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Verwendung von flüssigem Stickstoff, um die Probe einzufrieren und das Mahlsystem zu kühlen. Die Verwendung von flüssigem Stickstoff verhindert biologischen Abbau und ermöglicht eine effiziente Pulverisierung, erfordert aber eine spezielle Schulung für eine sichere Handhabung.

In diesem Protokoll ist ein Schleifsystem für das Probenschleifen, da kleine Proben schwer von Standardmörtel und Stößeln zu erholen sind. In diesem Fall breiten sich kl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kochsalzlösung			0,9 % NaCl
Eurocollins A	SALF	30874046	Transportmedium für ausgeglichene Organe. Kombinieren Sie 400 mL Eurocollins A mit 100 mL Eurocollins B, um das ausgewogene Medium Eurocollins
Eurocollins B	SALF	30874022	Transportmedium des ausgeglichenen Organs zu erhalten. Kombinieren Sie 400 mL Eurocollins A mit 100 mL Eurocollins B, um ein ausgewogenes Medium zu erhalten Eurocollins
Wisconsin	Brückenlebensdauer	RM/N 4081	Ausgeglichenes Organtransportmedium
Biohazard vertikale Strömung	Luft Burdinola		Klasse A GMP-Klassifizierung
Dewarflasche	Thermo Scientific	Nalgene 4150-1000
Kryoschleifer-System	OPS-Diagnose	CG 08-01	Schleifsystem mit Mörsern, Stößeln und Schraubendrehern
Pinzetten
Edelstahl Spatel
Steriles Einwegskalpell	Medisafe	MS-10
Edelstahlschere			Autoklavierbar
Plektren			Autoklavierbar
Steriles Einwegtuch	Mon& Tex	3.307.08
Sterilisationslösung mit Isopropylalkohol			70% Isopropylalkohol
Sterilisationslösung mit Wasserstoffperoxid			6% Wasserstoffperoxid
Mikropipette, 1 mL, mit Spitzen
15 mL Zentrifugenröhrchen	VWR international	9278
1,7 mL Zentrifugenröhrchen	VWR international	PIER90410
Harnstoffpuffer			8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol
Harnstoff	Sigma aldrich	U6504-1KG	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
Thioharnstoff	Sigma aldrich	T8656	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
CHAPS	Sigma aldrich	C3023-5GR	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
Dithiotreitol	Sigma aldrich	D0632-5G	Zur Verwendung für Harnstoffpuffer
Spritze 50 mL	PIC		Zur Verwendung zur Filterung von Harnstoffpuffer
0,22 & Mikro; m Filter	Millipore	SLGP033RB	Zur Verwendung zur Filtration von Harnstoffpuffer
PFTE Stößel, 2 mL	Kartell	6302	Teil des Potter-Elvehjem Homogenisators
Borosilikatglasmörser	Kartell	6102	Teil des Potter-Elvehjem Homogenisators
Rührer VELP	scientifica	Rührer DLH	Zur Verwendung für die Homogenisierung durch Potter-Elvehjem
Bradford Protein Assay	Bio-Rad Laboratorien	5000006
Röhrenrotator	Pbi International	F205
Flüssigstickstoff
Aluminiumfolie
Eis
Polystyrolbox
Trockeneiszentrifuge
			Für die Zentrifugation von 1,7 mL Zentrifugenröhrchen bei 13.000 x g
Gefrierschrank -80°; C
Präzisionswaage
Autoklav			Für die
Sterilisation Kryogene Handschuhe für Flüssigstickstoff
Handschuhe
Professionelle Zwangsbeatmung und natürlicher Luftkonvektionsofen			Für die Sterilisation
Proteasehemmer Cocktail	Sigma aldrich	P8340-5ML	100X Lösung
ProteoExtract Protein Precipitation Kit	Calbiochem	539180
RapiGest	Waters	186001861
Cytoscape	www.cytoscape.org	Version 2.7	Softwareplattform für die Gen-Ontologie-Analyse
BiNGO	http://apps.cytoscape.org/apps/bingo	Version 3.0.3	Plugin für die Gen-Ontologie-Analyse
AlphaB Crystallin/CRYAB Antikörper	Novus Biologicals	NBP1-97494	Maus monoklonaler Antikörper gegen CryAB
Septin-11 Antikörper	Novus Biologicals	NBP1-83824	Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen Septin-11
FHL1 Antikörper	Novus Biologicals	NBP-188745	Kaninchen polyklonaler Antikörper gegen FHL-1
Dermatopontin Antikörper	Novus Biologicals	NB110-68135	Polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Dermatopontin
Ziege Anti-Maus-IgG HRP Sigma	aldrich	A4416-0,5ML	Sekundärer Antikörper gegen Immunblotting
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	HRP Bio-Rad Laboratorien	170-5046	Sekundärer Antikörper gegen Immunblotting