Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten

Summary

Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Methyl-CpG-Bindungsdomäne (MBD) Sequenzierungsprotokoll und eine rechnerische Pipeline zur Identifizierung von differentiell methylierten CpG-reichen Regionen bei chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) Patienten.

Abstract

Die Rolle der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) bei Krebs kommt in den Vordergrund, da das Interesse an dem Verständnis ihrer mechanistischen Funktionen während der Krebsentwicklung und -progression zunimmt. Trotzdem wurde die globale epigenetische Regulation von lncRNAs und repetitiven Sequenzen bei Krebs insbesondere bei chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL) nicht gut untersucht. Diese Studie konzentriert sich auf einen einzigartigen Ansatz: die immunpräzipitationsbasierte Erfassung von doppelsträngigen, methylierten DNA-Fragmenten unter Verwendung von Methylbindungsdomänen (MBD) -Proteinen, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq). CLL-Patientenproben, die zu zwei prognostischen Untergruppen gehörten (5 IGVH-mutierte Proben + 5 IGVH-unmutierte Proben), wurden in dieser Studie verwendet. Die Analyse ergab 5.800 hypermethylierte und 12.570 hypomethylierte CLL-spezifische differentiell methylierte Gene (cllDMGs) im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse mehrere CLL-spezifische, differentiell methylierte lncRNAs identifiziertenPetitive Elemente und Protein-kodierende Gene mit potenziellem prognostischen Wert. Diese Arbeit skizziert ein detailliertes Protokoll für eine MBD-Seq- und Bioinformatik-Pipeline, die für die umfassende Analyse globaler Methylierungsprofile in hochcpG-reichen Regionen mit CLL-Patientenproben entwickelt wurde. Schließlich wurden ein Protein-kodierendes Gen und eine lncRNA mittels Pyrosequenzierung validiert, was eine hochquantitative Methode zur Analyse von CpG-Methylierungsniveaus ist, um die Befunde aus dem MBD-seq-Protokoll weiter zu bestätigen.

Introduction

Die Verwendung von Sequenztechniken der nächsten Generation zur Analyse globaler DNA-Methylierungsprofile wurde in den letzten Jahren zunehmend populär. Genom-weite Methylierungs-Assays, einschließlich Mikroarray- und Nicht-Mikroarray-basierte Methoden, wurden auf der Grundlage der folgenden entwickelt: die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, methylierungsempfindliche Restriktionsenzymverdauungen und die Immunpräzipitation von methylierter DNA unter Verwendung von Methyl-CpG-spezifischen Antikörpern .

Aberrant DNA-Methylierung ist eines der Kennzeichen der Leukämie und Lymphome, einschließlich der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL). Früher charakterisierten mehrere Gruppen, einschließlich unserer, die DNA-Methylierungsprofile verschiedener CLL-prognostischer Untergruppen und normale, gesunde B-Zell-Kontrollen unter Verwendung der Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, gefolgt von Mikro-Array-basierten Methoden oder Voll-Genom-Sequenzierung ^{1 , 2 , 3 , 4. Die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA führt zur Deamination von unmodifizierten Cytosinen zu Uracil, wobei die modifizierten methylierten Cytosine im Genom zurückbleiben. Nach der Umwandlung kann der Methylierungsstatus der DNA durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung unter Verwendung unterschiedlicher quantitativer oder qualitativer Methoden, wie z. B. Mikro-Array-basierte oder Voll-Genom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS), bestimmt werden. Obwohl Bisulfit-umwandlungsbasierte Verfahren viele Vorteile haben und in verschiedenen Krebsarten weit verbreitet sind, um DNA-Methylierungsniveaus zu analysieren, gibt es einige Nachteile, die mit dieser Technik verbunden sind. Die WGBS-Sequenzierung ermöglicht eine Single-Base-Paar-Auflösung mit niedrigeren DNA-Mengen und ist die beste geeignete Option zur Analyse einer großen Anzahl von Proben. Diese Methode unterscheidet jedoch nicht die Modifikationen zwischen den 5 mC und 5 hmC Ebenen im Genom 5 , 6 . Darüber hinaus bieten Microarray-basierte Methoden nicht komplette cÜberleben des Genoms}

In einer aktuellen Studie aus unserem Labor ⁷ wurden immunpräzipitationsbasierte Verfahren anstelle von Bisulfit-Umwandlung verwendet, um hochgradig CpG-reiche, differentiell methylierte Regionen auf globaler Ebene bei CLL-Patienten und normalen gesunden Kontrollen zu identifizieren. Inmethyl-CpG-bindende Domäne (MBD) Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq), die Anreicherung von doppelsträngiger fragmentierter DNA hängt vom Grad der CpG-Methylierung ab. Dieses Verfahren kann die Nachteile des Bisulfit-Umwandlungsverfahrens überwinden und kann auch eine genomweite Abdeckung der CpG-Methylierung in einer unvoreingenommenen und PCR-unabhängigen Weise bereitstellen. Zusätzlich kann im Gegensatz zu auf der Basis von Bisulfit-umwandlungsbasierten Mikroarray-Methoden MBD-seq verwendet werden, um den Methylierungsstatus von sich wiederholenden Elementen zu analysieren, wie z. B. lange durchbrochene nukleare Elemente (LINEs), kurze durchbrochene nukleare Elemente (SINEs), lange terminale Wiederholungen (LTRS) Usw. Im Vergleich zu Bisulfit-Umwandlungsverfahren,Ein MBD-seq-Protokoll erfordert eine relativ große Menge an Input-DNA. Auch die Qualität der Sequenzierung liest und die Daten hängen von der Spezifität, Affinität und Qualität der verwendeten Antikörper ab.

Die aktuelle Studie erklärt ein detailliertes MBD-seq-Protokoll, um methylierte DNA für die Sequenzierung der nächsten Generation zu bereichern. Es verwendet ein kommerzielles, methyliertes DNA-Bindungsanreicherungs-Kit (aufgeführt in der Materialtabelle ) sowie eine rechnerische Pipeline zur Visualisierung und Interpretation von Methylierungssequenzdaten zur Identifizierung von CLL-spezifischen hyper- und hypomethylierten Regionen im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Grundsätzlich nutzt dieses Verfahren die Fähigkeit des MBD der humanen MBD2-Protein-Wechselwirkung mit methylierten CpGs, um mit Methyl-CpGs angereicherte DNA zu extrahieren, worauf die Hochdurchsatz-Sequenzierung von methylierter DNA folgt.

Protocol

Die ethische Genehmigung für das Sammeln der CLL-Muster ist von 2007-05-21 mit der folgenden Registriernummer: EPN Gbg dnr 239/07. Alle CLL-Patienten wurden nach kürzlich revidierten Kriterien ⁸ diagnostiziert und die Proben wurden zum Zeitpunkt der Diagnose gesammelt. Die Patienten in der Studie wurden von verschiedenen Hämatologie-Abteilungen im westlichen Teil von Schweden aufgenommen, nachdem schriftliche Zustimmung erhalten worden war. In dieser Studie wurden nur CLL-periphere Blutmononukleäre Zellen (PBMC) mit einem Tumoranteil von Leukämiezellen ≥ 70% ausgewählt.

1. Vorbereitungen

1. Isolieren Sie PBMCs für DNA-Extraktionen von CLL und normale, gesunde periphere Blutproben unter Verwendung eines kommerziellen Isolationskits (siehe Materialtabelle ) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Autoklav 1,5 mL Röhrchen. Tauschen Sie alle Reagenzien im methylierten DNA-Bindungskit (siehe Materialtabelle ).
3. Verwenden Sie DNase-freies Wasser, um 10 ml 1x Wulstwaschpuffer aus dem 5x Vorratsspülpuffer vorzubereiten, der vom Kit bereitgestellt wird, um Perlen zu waschen und das vom Kit bereitgestellte MBD-Protein zu verdünnen.
4. Erhalten oder bereiten die folgenden Gegenstände vor: 3 M Natriumacetat, absolutem Ethanol und 70% Ethanol zur DNA-Präzipitation ( Materials Table ).

2. Genomische DNA-Extraktion und Sonikation

1. Verwenden Sie einen handelsüblichen DNA-Extraktionskit ( Materials Table ), um genomische DNA von Patienten und normalen PBMC-Proben nach dem Protokoll des Herstellers zu isolieren. Quantifizierung der genomischen DNA unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 260 nm.
   HINWEIS: Die DNA-Extraktionsspaltenkapazität beträgt 5-6 Millionen Zellen, maximal; Daher ist es wichtig, mehr als eine Spalte für Proben mit mehr als 5 Millionen Zellen zu verwenden. Eluieren Sie die DNA zweimal in gleichen Volumina, die 100 μl 10 mM Tris EDTA (TE) Puffer enthält. Das in der Methyl verwendete MBD-Biotin-ProteinMiner-Kit für MBD-Sequenzierung wird nicht an einzelsträngige DNA binden. So ist es sehr wichtig, die eluierte DNA entweder eingefroren oder bei 4 ° C zu halten, um ihre doppelsträngige Natur zu bewahren.
2. 5 μg genomische DNA aus jeder Probe auf insgesamt 200 μl unter Verwendung von TE-Puffer (pH 8) verdünnen, wobei eine Endkonzentration von 25 ng / μL erhalten wird.
3. Führen Sie die Beschallung in speziell entworfenen Rohren mit einem Ultraschallgerät ( Materialtabelle ) für insgesamt 30 Zyklen (30 s an und 30 s aus pro Zyklus, nach jeweils 5 Zyklen, kurz die Röhrchen drehen, um die Proben nach unten zu sammeln).
   HINWEIS: Dies führt zu fragmentierter DNA zwischen 150 bp und 300 bp, was für dieses Protokoll optimal ist.
4. Überprüfen Sie den Beschallungsbereich für alle Proben, bevor Sie mit dem nächsten Schritt der MBD-Sequenzierung fortfahren, indem Sie 1 μl der fragmentierten DNA-Proben und eine DNA-Größenleiter auf einem handelsüblichen, vorgegossenen 2% Agarosegel unter Verwendung von DNA-Elektrophorese-Bildgebungsgeräten laufen lassen. Visualisierung tEr DNA mit einem Standard-UV-Transilluminator.

3. Perlenpräparation vor der Bindung mit MBD-Biotin-Protein

1. Die magnetischen Streptavidin-Kügelchen aus dem durch den Bausatz bereitgestellten Vorratsschlauch resuspendieren, vorsichtig nach oben und unten pipettieren, um eine homogene Suspension zu erhalten. Verwirren Sie die Perlen nicht oder lassen Sie sie trocknen.
2. Legen Sie 50 & mgr; l Perlen (für jede 5 & mgr; g fragmentierte DNA-Probe) in getrennten, sauberen und markierten 1,5 ml Röhrchen. Füge 50 μl 1x Wulstwaschpuffer hinzu, um das Endvolumen von 100 μl zu erreichen.
   HINWEIS: Bei der Verwendung von kleinen 0,5 mL Polymerase Kettenreaktion (PCR) Streifen zum Waschen von Perlen werden etwa 150-200 & mgr; l Waschpuffer pro Röhrchen verwendet, wie im Kit-Protokoll erwähnt. Im Falle von 1,5 ml Röhrchen werden jedoch mindestens 250 μl zu 300 μl Waschpuffer pro Röhrchen für die Wulstwäsche zugegeben.
3. Legen Sie die Röhrchen für eine Minute auf einen Magnetständer, damit sich alle magnetischen Perlen auf die Innenwand des Rohres konzentrieren könnenMit dem Magneten Entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Perlen zu berühren, mit einer 200 μl Pipette.
4. Entfernen Sie die Röhrchen aus dem Magnetständer, fügen Sie 250 μl 1x Wulstwaschpuffer hinzu und mischen Sie die Perlen vorsichtig mit einer Pipette.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4 mindestens 4-5 mal für alle Proben und schließlich in 250 μl 1x Wulstwaschpuffer resuspendieren. Halten Sie sie auf Eis.

4. Bindung des MBD-Biotin-Proteins an die gewaschenen Perlen

1. Füge 35 μl MBD-Protein (7 μl für 1 μg DNA-Probe) hinzu, um Röhrchen zu trennen und das Gesamtvolumen bis zu 250 μl unter Verwendung von 1x Bead Wash Puffer zu bringen.
2. Füge 250 μl verdünntes MBD-Protein zu den 250 μl gewaschenen Perlen hinzu und läßt sie bei Raumtemperatur 1 h bei einer End-to-End-Rotation liegen.
3. Nach dem Mischen der Perlen und des Proteins für 1 h, waschen Sie das MBD-Protein-Biotin, das mit magnetischen Streptavidin-Perlen gebunden ist.
   1. Legen Sie die Röhrchen 1 min auf den Magnetständer und entfernen Sie tEr fließt, ohne die Perlen mit einer Pipette zu berühren. Füge 250 μl 1x Wulstwaschpuffer hinzu und lege die Röhrchen 5 min bei Raumtemperatur auf einen Rotationsmischer.
4. Wiederholen Sie Schritt 4.3.1 zwei weitere Male und schließlich die gewaschenen MBD-Biotinperlen in 200 μl 1x Bead-Waschpuffer resuspendieren, wodurch die Perlen für die methylierte DNA-Capture bereit sind.
   HINWEIS: Waschen 2-3 mal auf diese Weise entfernt alle Hintergrund ungebundenen MBD-Protein-Perlen und verbessert die effiziente Bindung von MBD-Protein-gekoppelten Perlen mit fragmentierten genomischen DNA.

5. Bindung von MBD-Biotin-Perlen mit Fragmentierter Genom-DNA

1. In einem sauberen 1,5 ml DNase-freien Röhrchen werden 100 & mgr; l 5 & times; Perlenwaschpuffer und 180 & mgr; l der fragmentierten genomischen DNA zugegeben (Schritt 2.3). Bringen Sie das Endvolumen auf 500 μl mit DNase freiem Wasser.
2. Füge 380 μl DNase-freies Wasser zu den restlichen 20 μl der fragmentierten genomischen DNA hinzu und gefriere sie. Verwenden Sie diese Samples als Eingabe DNEine Kontrolle und fällt sie später zusammen mit den endgültigen eluierten methylierten DNA-Proben (siehe Schritt 7.1).
3. Legen Sie die Röhrchen mit gewaschenen MBD-Biotinperlen (Schritt 4.4) auf einen Magnetständer für 1 min und entfernen Sie die Flüssigkeit, ohne die Perlen zu stören. Fügen Sie 500 μl fragmentierte genomische DNA hinzu, die in Perlenwaschpuffer verdünnt ist.
4. Alle Röhrchen fest mit Paraffinfolie abdichten und über Nacht bei 4 ° C auf einem End-to-End-Rotationsständer bei 8-10 U / min belassen.
   ANMERKUNG: Die DNA- und Biotin-Bead-Bindungsreaktion kann für 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt werden, aber bei 4 ° C über Nacht kann die Wiederherstellung der endgültigen methylierten DNA verbessert werden.

6. Entfernen der ungebundenen DNA und Eluieren der methylierten DNA aus den Perlen

1. Nach der DNA- und MBD-Perlen-Bindungsreaktion die Röhrchen für 1 min auf die magnetische Zahnstange stellen, um alle Perlen auf die Innenwand des Röhrchens zu konzentrieren.
2. Entfernen Sie die überstehende Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne zu berührenDie Perlen und speichern diese ungebundene DNA-Probenfraktion auf Eis.
3. Füge 200 μl 1x Wulstwaschpuffer zu den Perlen hinzu und lege die Röhrchen 3 min bei Raumtemperatur auf den rotierenden Ständer. Legen Sie die Rohre auf den Magnetständer und entfernen Sie die Flüssigkeit. Wiederholen Sie die Wäsche noch zwei Mal, um die restliche ungebundene DNA zu entfernen.
4. Nach dem abschließenden Waschen werden 200 & mgr; l hochsalziger Elutionspuffer (2.000 mM NaCl) zugegeben, der in dem Kit zur Eluierung der DNA bereitgestellt wird.
5. Die Röhrchen 15 min bei Raumtemperatur auf den rotierenden Ständer stellen. Legen Sie sie 1 min auf den Magnetständer und verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand sorgfältig auf ein neues, sauberes 1,5 mL Röhrchen zu übertragen.
6. 200 μl Hochsalz-Elutionspuffer zugeben und die Elution durch Drehen der Röhrchen bei Raumtemperatur für 15 min wiederholen. Füge die zweite Elute zu demselben Röhrchen hinzu, das die 200 μl des ersten Eluats enthält.
   HINWEIS: Die endgültigen 400 μl der gesamten eluierten DNA ist nun bereit für die Ethanol-Präzipitation, um die gereinigten zu extrahierenDNA, die für die Sequenzierung der nächsten Generation geeignet ist.

7. Ethanol-Präzipitation und die Anreicherung von methylierter DNA

1. Füge 1 μl Glykogen (20 μg / μL, im Kit enthalten) ein; 40 & mgr; l 3 M Natriumacetat, pH 5,2; Und 800 & mgr; l eiskaltes absolutes Ethanol zu 400 & mgr; l eluierter DNA und auch zu den in Schritt 5.2 hergestellten 400 & mgr; l Input-DNA-Proben
2. Mischen Sie die Röhrchen gut durch Vortexen und inkubieren sie bei -80 ° C über Nacht.
3. Die Röhrchen mit 12.000 xg (Höchstgeschwindigkeit) und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand sorgfältig verwerfen, ohne das Pellet zu stören, 500 μl 70% iges Ethanol zuzugeben und die Röhrchen zu verwirbeln.
4. 10 Minuten bei 4 ° C mit maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren und den Überstand sorgfältig mit einer Pipette entfernen. Die Röhrchen mit maximaler Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und das restliche Ethanol vollständig mit einer Pipettenspitze entfernen.
5. Das Pellet für 5 min bei Raumtemperatur abtrocknenReifen Füge 10 μl DNase-freies Wasser zum DNA-Pellet hinzu. Weiter mit der methylierten DNA-Quantifizierung (Schritt 7.6), MBD-Sequenzierung (Schritt 7.7) und Analyse (Abschnitte 8 und 9).
6. Quantifizieren Sie die endgültig gewonnenen methylierten DNA-Proben unter Verwendung eines handelsüblichen fluorometrischen Quantifizierungskits (siehe Materialtabelle ) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
7. Anmerkung: Mit diesem Protokoll wurden 30-50 ng endgültige DNA aus jeder Probe gewonnen. DNA-Proben sind bereit, auf Trockeneis für nachgeschaltete Bibliotheksbau und Hochdurchsatz-MBD-Sequenzierung zu senden
8. Durchführen einer DNA-Bibliothekskonstruktion und einer Hochdurchsatz-MBD-Sequenzierung unter Verwendung einer kommerziellen Plattform ( Materials Table ), wie in Referenz ⁹ beschrieben.
   ANMERKUNG: Für die anfängliche Qualitätskontrolle der endgültigen methylierten DNA führen Sie Bibliothekszubereitungen unter Verwendung von 50-bp-Paar-End-Sequenzierungen für alle Proben durch. Verarbeiten Sie die Rohdaten für die Nachsequenzierung der Qualitätskontrolle, aS, die in Schritt 8.1 ausgearbeitet wurden, und weiterverarbeiten sie mit bioinformatischen Ansätzen und statistischen Methoden, wie unten beschrieben (Schritte 8.2-9.6).

8. Bioinformatik-Analyse Methode 1: Identifizierung von CLL-assoziierten differenziell methylierten Regionen (cllDMRs)

1. Reinigen Sie die erhaltenen 49-bp-Lesungen (FASTQ-Format) für Adapter mit den verfügbaren Qualitätskontrollwerkzeugen wie Trimmomatic ¹⁰ oder Cutadapt. Crosscheck die Qualität der getrimmten Lesungen mit dem FastQC Toolkit:
   Java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP: adapters.fasta: 2: 30: 10
2. Richten Sie die gereinigten FASTQ-Dateien mit dem Kurzlesen-Genom-Aligner Bowtie gegen ein Referenzgenom aus ^{11 aus} . Geben Sie die folgenden Parameter an:
   1. Erlaube bis zu zwei Fehlanpassungen (Bowtie-Parameter: -v 2).
   2. Begrenzung der Berichterstattung auf die sechs besten Ausrichtungen pro Lesen (Bowtie-Parameter: -m 6) zur SteuerungFür Multi-Mapping liest.
      Bowtie -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S SAMPLE.fastq> SAMPLE.sam
      HINWEIS: Konvertieren Sie die SAM-Dateien, die für einzelne Samples generiert wurden, nach der Ausrichtung in BAM mit SAMtools.
      Samtools sehen -bS -o SAMPLE.bam SAMPLE.sam
3. Verwenden Sie die modellbasierte Analyse des ChIP-Seq (MACS) Peak Callers auf ausgerichteten Samples (BAM), um angereicherte / methylierte Regionen aus den CLL-Subgruppen ¹² vorherzusagen.
   HINWEIS: Vergleich I: Verwenden Sie das Input-Beispiel als Kontrollgruppe und die Normal- und CLL-Patientenproben als Behandlungsgruppen. Dieser Schritt ist, alle negativen Spitzen zu sammeln (Spitzen, die in Eingang / Hintergrund angereichert sind). Vergleich II: Verwenden Sie die Normal-Probengruppe als Kontrollgruppe und die CLL-Patienten-Probengruppe als Behandlungsgruppe. Erhaltene positive Peaks sind CLL-hypermethylierte Regionen, und negative Peaks sind CLL-hypomethylierte Regionen über normale oder differentiell methylierte Regionen (DMRs).
   Macs14 -t SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam - Format BAM -g hs
4. Vergleiche I-Hintergrund-Peaks aus differentiell methylierten Regionen (DMRs) mit BEDtools ¹³ .
   Bedtools subtrahieren -a -b
5. Vorhersage des Prozentsatzes der Wiederholungselemente (SINE-Alu, LINE, etc. ), angereichert in DMRs.
   1. Verwenden Sie Fastacmd, um die FASTA-Sequenz von DMRs durch die chromosomalen Koordinaten aus dem Referenzgenom HG19 zu extrahieren.
      Fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosom -L Start, Ende -l 50000> DMRs.fasta
   2. Verwenden Sie das RepeatMasker-Befehlszeilen-Tool, um den Prozentsatz der Wiederholungselemente, die in der FASTA-Sequenz von DMRs vorhanden sind, vorherzusagen.
      RepeatMasker -gc -gccalc -s -species mensch -html DMRs.fasta
6. Annotieren Sie die vorhergesagten DMRs mit Homer "annotatePeaks.pl" mit dem verfügbaren Ensembl [PMC4919035] oR Gencode [PMID 22955987] Transkript-Annotation (Protein-Codierung und nicht-kodierende Transkripte).
   AnnotatePeaks.pl DMRs.bed -gtf
   HINWEIS: Hier finden Sie Informationen über die Verteilung von Peaks über verschiedene genetische Regionen ( zB Promotor, Exon, Intron, 3 'UTRs und 5' UTRs) und intergene Regionen. Transkripte oder Gene, die mit DMRs assoziiert sind, werden als differentiell methylierte Gene (DMGs) bezeichnet.
7. Verwenden Sie das Anreicherungswerkzeug mit der aktualisierten oder aktuellen Funktionsdatenbank, um Funktionen zu finden, die mit CLL DMGs angereichert sind (nur Protein-codierende Gene) ¹⁴ .
   HINWEIS: Gene Set Clustering basierend auf Functional Annotation (GeneSCF) ¹⁴ ist ein Echtzeit-basiertes Tool zur funktionalen Anreicherungsanalyse, das aktualisierte KEGG und Gene Ontology als Referenzdatenbank verwendet.

9. Bioinformatik-Analyse Methode 2: Identifizierung CLL-assoziiert signifikant DiffErentlich Methylierte Regionen (cll sigDMRs)

1. Befolgen Sie die Schritte 8.1-8.5 von Methode I (Abschnitt 8) und verwenden Sie die Read-Count-basierte Differentialanreicherungsanalyse, indem Sie die verfügbaren Tools verwenden, wie in den Schritten 9.2 - 9.6 ausgearbeitet, um der Analyse-Pipeline eine weitere Statistikebene hinzuzufügen.
2. Quantifizieren Sie die Anzahl der Lesevorgänge, die einzelnen Peaks oder DMRs in Normal- und CLL-Patientenproben zugeordnet sind, mit "featureCounts" aus dem "Subread" -Paket ¹⁵ .
   Subread / bin / featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam
   HINWEIS: Ein Mapping-Qualitätsfilter kann eingeführt werden, um eine Bestätigung der schlechten Qualität zu vermeiden ( z. B. -Q 30). Für diesen Schritt bereite ich SAF-Dateien für die erhaltenen DMRs vor. Für weitere Informationen über das SAF-Dateiformat verwenden Sie bitte diesen Link http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/.
3. Verwenden Sie eine RAW-Lese-Zähler-Tabelle mit der Anzahl der Lesevorgänge für die einzelnen Peaks in Normal anD CLL Patientenprobengruppen in edgeR als Eingang ¹⁶ .
   HINWEIS: Vergleichen Sie normale versus CLL Patientenprobengruppen, um sigDMRs zu finden. Zur differenziellen Anreicherungsanalyse folgen Sie der Anleitung von edgeR für detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf).
4. Filtern Sie die sigDMRs mit der falschen Discovery Rate (FDR) und Log-Fold-Änderung, die von edgeR ¹⁶ vorhergesagt wird.
5. Annotieren Sie die vorhergesagten SigDMRs mit Homer "annotatePeaks.pl" mit der verfügbaren Ensembl- oder Gencode-Transkript-Annotation (Protein-Codierung und nichtcodierende Transkripte).
   AnnotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf -CpG
   HINWEIS: Hier finden Sie Informationen über die Verteilung von Peaks über verschiedene genetische Regionen ( zB Promotor, Exon, Intron, 3 'UTRs und 5' UTRs) und intergene Regionen. Transkripte oder Gene, die mit si assoziiert sindGDMRs heißen sigDMGs.
6. Verwenden Sie ein Anreicherungswerkzeug mit der aktualisierten oder aktuellen Funktionsdatenbank, um mit CLL sigDMGs angereicherte Funktionen zu finden (nur Protein-kodierende Gene) ¹⁴ .
   HINWEIS: GeneSCF, eines der Echtzeit-Tools für die funktionale Anreicherungsanalyse, verwendet KEGG und Gene Ontology als Referenzdatenbanken.

Results

MBD-seq wurde vor kurzem bei CLL-Patienten und abgestimmten, normalen, gesunden Kontrollen durchgeführt, um CLL-spezifische differentiell hyper- und hypomethylierte Gene zu identifizieren ⁷ . Die experimentelle und bioinformatische Pipeline, die für die Analyse der von CLL und normalen gesunden Proben erzeugten Daten verwendet wird, ist in 1A und 1B gezeigt . Diese Analysen identifizierten mehrere CLL-spezifische diff...

Discussion

MBD-seq ist eine kostengünstige, immunpräzipitationsbasierte Technik, die verwendet werden kann, um Methylierungsmuster mit vollständiger genomweiter Abdeckung zu untersuchen. Sowohl MeDIP-Seq (methylierte DNA-Immunopräzipitation als auch Sequenzierung) und MBD-Seq führen zur Anreicherung von CpG-reicher methylierter DNA. Allerdings zeigt MBD-seq mehr Affinität zur Bindung an hoch-cpG-reiche Regionen im Vergleich zu MeDIP seq ¹⁹ . Unter Verwendung eines Methyl-bindenden Anreicherungs-Kits kann ma...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dneasy Blut- und Gewebekit	Qaigen	69504
Lymphoprep solution	A X I S-S H I E L D
Nano drop 2000	Thermo Fischersceintific
TE Puffer pH 8	Sigma aldrich	93283
Bioruptor Standard-Beschallungsgerät	Diagenode	UCD-200
TPX Bioruptorröhrchen 1,5 mL	Diagenode	C30010010-300
3 M Natriumacetat-Diagenode		C03030002
E-Gel iBase Safe Imager Kombi-Kit	Thermo Fischersceintific	G6465EU
E-Gel 2% Agarose-Gele	Thermo Fischersceintific	G441002
Methylminer Methylierte DNA-Anreicherungskit	Thermo Fischersceintific	ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators	Thermo Fischersceintific	415110
Dynal MPC-S	Thermo Fischersceintific	A13346
Vortex Mixer	VWR	12620-848
Absolutes Ethanol	Jedes Unternehmen
70% Ethanool	Jedes Unternehmen
DNAse freies Wasser	Milli Q
DNA-Fällungsmittel (3M-Natriumacetat)	Diagenode	C03030002
Safe Seal 1,5 mL Eppendorf Röhrchen	Eppendorf	4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fischersceintific	Q32851
Qubit 0,5 mL Röhrchen	Thermo Fischersceintific	Q32856
Qubit	Thermo Fischersceintific	Q32866
Illumina Hiseq2000 Plattform	Illumina
Wasser  Bath	Grant
Heizblock-Zuschuss
Rohrrotater	Labquake