Methodenartikel

Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

DOI:

10.3791/55775

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15. Juni 2017

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1Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Insititutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das CRISPR-assoziierte Protein Cpf1 kann durch eine speziell entwickelte CRISPR-RNA (crRNA) geführt werden, um doppelsträngige DNA an gewünschten Stellen zu spalten und klebrige Enden zu erzeugen. Basierend auf dieser Eigenschaft wurde ein DNA-Assembler-Standard (C-Brick) etabliert, und ein Protokoll, das seine Verwendung beschreibt, wird hier beschrieben.

Zusammenfassung

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CRISPR-assoziiertes Protein Cpf1 spaltet doppelsträngige DNA unter der Leitung von CRISPR RNA (crRNA) und erzeugt klebrige Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde Cpf1 für die Etablierung eines DNA-Assembler-Standards namens C-Brick verwendet, der den Vorteil von langen Erkennungsstellen und kurzen Narben hat. Auf einem Standard-C-Brick-Vektor gibt es vier Cpf1-Erkennungsstellen - das Präfix (T1- und T2-Standorte) und das Suffix (T3- und T4-Standorte) - flankierende biologische DNA-Teile. Die Spaltung von T2- und T3-Stellen erzeugt komplementäre klebrige Enden, die die Montage von DNA-Teilen mit T2- und T3-Stellen ermöglichen. Mittlerweile wird eine kurze "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen nach der Montage erzeugt. Da das neu gebildete Plasmid noch einmal die vier Cpf1-Spaltstellen enthält, erlaubt die Methode die iterative Assemblierung von DNA-Teilen, die denjenigen von BioBrick- und BglBrick-Standards ähnlich ist. Ein Verfahren, das die Verwendung des C-Brick-Standards zur Zusammenstellung von DNA-Teilen skizziertWird hier beschrieben. Die C-Brick-Standard kann weit verbreitet von Wissenschaftlern, Absolventen und Studenten und sogar Amateure verwendet werden.

Einleitung

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Die Standardisierung von DNA-biologischen Teilen ist wichtig für die Entwicklung der synthetischen Biologie 1 . Die Entwicklung eines DNA-Assemblierungsverfahrens kann Ad-hoc- experimentelle Entwürfe ersetzen und viele der unerwarteten Ergebnisse entfernen, die bei der Montage von genetischen Komponenten in größere Systeme entstehen. Der BioBrick Standard (BBF RFC 10) war einer der frühesten vorgeschlagenen DNA Assembly Standards. Es verwendet die Präfixsequenz (die EcoRI- und XbaI-Schneidstellen enthält) und die Suffixsequenz (die SpeI- und PstI-Schneidstellen enthält) 2 , 3 ....

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Protokoll

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1. Vorbereitung von crRNA

  1. Vorbereitung von crRNA-Vorlagen
    1. Die Oligonukleotide ( Tabelle 1 ) in RNase-freiem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM erneut suspendieren.
    2. Füge 22,5 μl Top-Strang-Oligonukleotid (T7-F in Tabelle 1 ), 22,5 μl Bottomstrang-Oligonukleotid ( Tabelle 1 ) und 5 μl 10x-Annealing-Puffer zu einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
      ANMERKUNG: Sechs verschiedene untere Strang-Oligonukleotide sind in Tabelle 1 gezeigt , von denen jede einzeln mit dem Top-Strang T7-F gepaart we....

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Ergebnisse

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Dieses Protokoll zeigte die Zusammenstellung von drei Chromoproteinkassetten (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) und amilGFP (BBa_K592010)). Zuerst wurden die kodierenden Sequenzen der drei vorgenannten Gene und Terminatoren einzeln in einen C-Brick-Standardvektor kloniert. Kurze DNA-Teile, Promotor und Terminator wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die die kurzen DNA-Teile am 5'-Terminus enthalten, in den C-Brick-Vektor eingeführt. Darauf folgte die Sel.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für den DNA-Assemblierungsstandard C-Brick. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Linearisierung des C-Brick-Standardvektors; Eine unvollständige Spaltung des Vektors könnte die Erfolgsquote ernsthaft beeinträchtigen. Zusätzlich, obwohl Cpf1 hauptsächlich Ziel-DNA-Sequenzen in dem "18-23" -Spaltmuster spaltet, wurde auch eine ungenaue Spaltung nahe den beiden Basen 4 nachgewiesen, was eine kleine Anzahl von Mutationen nach der DNA-A.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir danken Shanghai Tolo Biotech für ihre technische Unterstützung bei der Entwicklung des C-Brick Standards. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Strategischen Schwerpunktforschungsprogramm der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Grant Nr. XDB19040200) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Kommerzielles OligonukleotidSangon Biotech
10x Taq PCR PufferTransgen#J40928
Reinstes destilliertes WasserInvitrogen10977-015
5x RNA-TranskriptionspufferThermo ScientificK0441
T7 RNA-PolymeraseThermo Scientific#EP0111 NTP-Mischung
Sangon#ND0056
RRI (rekombinanter RNase-Inhibitor)Takara2313A
RNA reinigen & Concentrator-5Zymo ResearchR1015
UV-Vis SpektrometerThermo ScientificNano-Drop 2000c
2x Phanta Max PufferVazymePB505PCR Puffer
dNTPsTransgenAD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA PolymeraseVazymeP505-d1
Ezmax für die einstufige KlonierungTolobio24303-1nahtloser Bausatz
5x Puffer für Ezmax One-Step CloningTolobio32006
BamHINEB#R0136L
BamHI-HFNEB#R3136L
BglII NEB#R0144L
XbaINEB#R0145L
SpeINEB#R3133L
10x Buffer 3NEB#B7003S
10x CutSmart BufferNEBB7204S
10x T4 DNA Ligase BufferTolobio32002
T4 PNKTolobio32206
T4 DNA LigaseTolobio32210
DpnINEB#R01762
SV Gel und PCR-ReinigungssystemPromegaA9282
Plasmid Mini Kit IOmegaD6943-02Plasmidvorbereitungskit
thermosensitive alkalische Phosphatase Thermo Scientific#EF0651FastAP
10x Cpf1 PufferTolobio32008
Cpf1Tolobio32105FnCpf1
ThermocyclerApplied Biosystemsveriti 96 well
C-Brick Standard VektorTolobio98101
E. coli [DH10B]Invitrogen18297010
Luria-Bertani media (Trypton)OxoidLP0042
Luria-Bertani media (Hefeextrakt)OxoidLP0021
Luria-Bertani media (NaCl)Sangon BiotechB126BA0007

Referenzen

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  1. Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
  3. ....

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Schlagwörter

C Brick StandardCpf1 AssemblyDNA Part AssemblyCRISPR RNASeamless AssemblyVector DigestionChromoprotein CassettesPlasmid PreparationSanger SequencingChemical Transformation

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