Protokolle für C-Brick DNA Standard Assembly mit Cpf1

Summary

Das CRISPR-assoziierte Protein Cpf1 kann durch eine speziell entwickelte CRISPR-RNA (crRNA) geführt werden, um doppelsträngige DNA an gewünschten Stellen zu spalten und klebrige Enden zu erzeugen. Basierend auf dieser Eigenschaft wurde ein DNA-Assembler-Standard (C-Brick) etabliert, und ein Protokoll, das seine Verwendung beschreibt, wird hier beschrieben.

Abstract

CRISPR-assoziiertes Protein Cpf1 spaltet doppelsträngige DNA unter der Leitung von CRISPR RNA (crRNA) und erzeugt klebrige Enden. Aufgrund dieser Eigenschaft wurde Cpf1 für die Etablierung eines DNA-Assembler-Standards namens C-Brick verwendet, der den Vorteil von langen Erkennungsstellen und kurzen Narben hat. Auf einem Standard-C-Brick-Vektor gibt es vier Cpf1-Erkennungsstellen - das Präfix (T1- und T2-Standorte) und das Suffix (T3- und T4-Standorte) - flankierende biologische DNA-Teile. Die Spaltung von T2- und T3-Stellen erzeugt komplementäre klebrige Enden, die die Montage von DNA-Teilen mit T2- und T3-Stellen ermöglichen. Mittlerweile wird eine kurze "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen nach der Montage erzeugt. Da das neu gebildete Plasmid noch einmal die vier Cpf1-Spaltstellen enthält, erlaubt die Methode die iterative Assemblierung von DNA-Teilen, die denjenigen von BioBrick- und BglBrick-Standards ähnlich ist. Ein Verfahren, das die Verwendung des C-Brick-Standards zur Zusammenstellung von DNA-Teilen skizziertWird hier beschrieben. Die C-Brick-Standard kann weit verbreitet von Wissenschaftlern, Absolventen und Studenten und sogar Amateure verwendet werden.

Introduction

Die Standardisierung von DNA-biologischen Teilen ist wichtig für die Entwicklung der synthetischen Biologie ¹ . Die Entwicklung eines DNA-Assemblierungsverfahrens kann Ad-hoc- experimentelle Entwürfe ersetzen und viele der unerwarteten Ergebnisse entfernen, die bei der Montage von genetischen Komponenten in größere Systeme entstehen. Der BioBrick Standard (BBF RFC 10) war einer der frühesten vorgeschlagenen DNA Assembly Standards. Es verwendet die Präfixsequenz (die EcoRI- und XbaI-Schneidstellen enthält) und die Suffixsequenz (die SpeI- und PstI-Schneidstellen enthält) ^{2 , 3} . Da XbaI und SpeI komplementäre zusammenhängende Enden haben, können BioBrick DNA-Teile, die mit XbaI und SpeI geschnitten werden, miteinander verbunden werden und einen neuen BioBrick für eine weitere iterative Montage erzeugen.

Bei der Verwendung des BioBrick-Standards ⁴ wurden einige Mängel festgestellt. Zum Beispiel produziert es eine 8-bp-NarbeZwischen den DNA-Teilen, die nicht die Konstruktion von In-Fusionsproteinen ermöglicht. Außerdem müssen die vier vorgenannten Typen von 6-bp-Restriktionsstellen aus den DNA-Teilen entfernt werden, was sehr unpraktisch ist. Der BglBrick-Standard wurde eingerichtet, um das erste Problem zu lösen ⁵ . Es schafft eine 6-bp "GGATCT" Narbe, die Herstellung von Gly-Ser und ermöglicht die Fusion von mehreren Proteinen oder Protein-Domains. IBrick wurde entwickelt, um mit dem zweiten Problem umzugehen ⁶ . Es verwendet Homing-Endonukleasen (HEs), die lange DNA-Sequenzen erkennen. Da die Erkennungsstandorte selten in natürlichen DNA-Sequenzen existieren, kann der iBrick-Standard für den direkten Aufbau von iBrick-Teilen ohne Modifikation ihrer DNA-Sequenzen verwendet werden. Allerdings verlässt der iBrick-Standard eine 21 bp-Narbe zwischen den DNA-Teilen, was der Grund für seine Unbeliebtheit sein könnte.

In den letzten Jahren gingen die gruppierten regelmäßig kurzen palindromischen Wiederholungen (CRIS) zusammenPR) System hat sich schnell entwickelt ^{7 , 8} . Unter den CRISPR-assoziierten (Cas) Proteinen ist Cas9 Endonuklease aus Streptococcus pyogenes heute weit verbreitet . Es führt meist doppelsträngige DNA-Pausen (DSBs) mit stumpfen Enden ^{9 ein} .

Im Jahr 2015 charakterisierten Zhang und Mitarbeiter Cpf1 (CRISPR von Prevotella und Francisella 1) zum ersten Mal. Es gehört zum Klasse-2-Typ-V-CRISPR-Cas-System und ist eine CRISRP-RNA (crRNA) -geführte Endonuklease ¹⁰ . Im Gegensatz zu Cas9 führt Cpf1 einen DSB mit einem 4 oder 5 nt 5 'Überhang ^{10 ein} . Basierend auf dieser Eigenschaft wurde Cpf1 verwendet, um einen DNA-Assemblystandard C-Brick ⁴ zu entwickeln. Auf einem C-Brick-Standardvektor flankieren vier Cpf1-Zielstellen von vorangestellten T1 / T2 und suffixed T3 / T4 die biologischen Teile; Dies ähnelt dem BioBrick-Standard. Als Spaltung von T2- und T3-Stellen pFührt zu komplementären klebrigen Enden, es ist möglich, die iterative Anordnung von DNA-Teilen durchzuführen, während eine "GGATCC" Narbe zwischen den Teilen erzeugt wird. Bemerkenswerterweise hat der C-Brick-Standard zwei Hauptvorteile: Erkennung langer Zielsequenzen und kurzer Narben. Die von C-Brick erzeugte 6 bp "GGATCC" Narbe kodiert Gly-Ser, was den Aufbau von Fusionsproteinen ermöglicht. Darüber hinaus ist der C-Brick-Standard auch teilweise mit den BglBrick- und BioBrick-Standards kompatibel.

Protocol

1. Vorbereitung von crRNA

1. Vorbereitung von crRNA-Vorlagen
   1. Die Oligonukleotide ( Tabelle 1 ) in RNase-freiem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM erneut suspendieren.
   2. Füge 22,5 μl Top-Strang-Oligonukleotid (T7-F in Tabelle 1 ), 22,5 μl Bottomstrang-Oligonukleotid ( Tabelle 1 ) und 5 μl 10x-Annealing-Puffer zu einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen hinzu. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
      ANMERKUNG: Sechs verschiedene untere Strang-Oligonukleotide sind in Tabelle 1 gezeigt , von denen jede einzeln mit dem Top-Strang T7-F gepaart werden sollte. Die Kleinbuchstaben in Tabelle 1 stellen die zu transkribierende Sequenz in die Führungssequenz von crRNA dar. 10x Taq PCR Puffer kann anstelle des 10x Glühpuffers verwendet werden.
   3. Legen Sie die PCR-Röhre in einen Thermocycler.
   4. Führen Sie das Glühprogramm aus: anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für5 min und dann eine Abklingzeit von 95-20 ° C, mit einer 1 ° C Abnahme pro Minute auf dem Thermocycler.
      HINWEIS: Sofort die Proben für Schritt 1.2.1 verwenden.
2. Transkription und Reinigung von crRNA
   1. Zugabe von 38 μl RNase-freiem Wasser, 8 μl der Matrize aus Schritt 1.1.4, 20 μl 5x T7 Transkriptionspuffer, 20 μl NTP-Gemisch (10 μM), 4 μl rekombinantem RNase-Inhibitor (RRI) und 10 ΜL T7-RNA-Polymerase zu einem 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 100 μl beträgt.
   2. Das Mikrozentrifugenröhrchen über Nacht in ein 37 ° C Wasserbad geben (ca. 16 h).
   3. Verwenden Sie einen RNA-Cleanup- und Konzentrations-Kit, um die transkribierte RNA zu reinigen. Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
   4. Quantifizieren Sie die RNAs mit UV-Vis-Spektrophotometern und verdünnen Sie die RNA auf eine Konzentration von 10 μM. Benutzen Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bei -80 ° C.
      HINWEIS: Die crRNA-SequenzS sind in Tabelle 2 aufgelistet .

2. Konstruktion von C-Brick Parts ( dh das Einfügen von biologischen Teilen in einen C-Brick Standard Vector)

HINWEIS: Dieser Schritt hat drei Teilschritte. Für kurze biologische Teile ( z. B. Promotoren und Terminatoren) ist es am besten, die direkte PCR-Methode zu verwenden, um die biologischen Teile in einen C-Brick-Standardvektor 4 einzusetzen. Die gesamte Vektorsequenz wird in den ergänzenden Daten gezeigt, und die Präfix- und Suffixsequenz ist in Fig. 1 gezeigt (Schritt 2.1, unten). Für biologische Teile, die leicht über PCR erhalten werden können ( z. B. mit Templaten von genomischen DNA, Plasmiden oder de novo synthetisierten DNA-Sequenzen), ist es am besten, das nahtlose Assemblierungsverfahren zu verwenden, um die biologischen Teile in einen C-Brick-Standardvektor einzusetzen (Schritt 2.2, unten). Für diejenigen Teile aus BioBrick und BglBrick Standards, BeschränkungEnzym-vermittelte Verdauung und T4-DNA-Ligase-vermittelte Ligation können verwendet werden, um die biologischen Teile in einen C-Brick-Standardvektor einzusetzen (Schritt 2.3 unten).

1. Aufbau durch direkte PCR-Verstärkung
   1. Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation aufbauen und bestellen.
      HINWEIS: Das 5'-Ende des Oligonukleotids enthält die Sequenz des DNA-Teils und das 3'-Ende des Oligonukleotids enthält die Vektorsequenz ( dh "GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG" am 3'-Ende des Vorwärtsstranges und "GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG" Im umgekehrten strang). Entweder kann kein Überhang oder ein ~ 20-bp-Überhang am 5'-Ende des Oligonukleotids entworfen werden. Spezielle Beispiele finden sich in einer früheren Studie ⁴ .
   2. Die Oligonukleotide in ultrareinem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM erneut suspendieren.
   3. PCR-Reaktionen auf Eis in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen aufbauen: 18 μl ultrareines Wasser geben, 25 μl 2x PCR-Puffer, 1 & mgr; l DNTPs (10 & mgr; M), jeweils 2,5 & mgr; l der Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 & mgr; M) aus Schritt 2.1.2, 0,5 & mgr; l C-Brick-Standardvektor (50 ng) als Matrize und 0,5 & mgr; l Von High-Fidelity-DNA-Polymerase. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
   4. Legen Sie die Röhre direkt in einen Thermocycler und starten Sie das Thermocycler-Programm. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
   5. Thermocycler-Programm: ein Zyklus für 3 min bei 98 ° C; Dreißig Zyklen für 10 s bei 98 ° C, 20 s bei 55 ° C und 2 min bei 72 ° C; Und einen Zyklus für 10 min bei 72 ° C. Halten Sie die Probe bei 16 ° C.
   6. Zugabe von 9 μl der Mischung aus Schritt 2.1.4 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
   7. 1 μl DpnI zugeben und 1 h in einem Wasserbad von 37 ° C inkubieren.
      HINWEIS: Wenn die Primer keine überlappenden Sequenzen haben, fügen Sie 0,5 μl T4-Polynukleotidkinase (PNK) und 0,5 μl T4-DNA-Ligase hinzu und inkubieren inEin 22 ° C Wasserbad für 1 h. Andernfalls, wenn die Primer eine ~ 20 nt überlappende Sequenz enthalten, transformieren Sie die DpnI-behandelten Produkte direkt in E. coli (DH10B) -kompetente Zellen (Schritt 2.4). Das linearisierte PCR-Produkt wird durch das Rekombinationssystem im Wirt zirkuliert.
   8. Benutzen Sie die Proben sofort oder lagern Sie sie bei -20 ° C.
2. Aufbau durch nahtlose Montage
   1. Oligonukleotide für die PCR-Amplifikation aufbauen und bestellen.
      HINWEIS: Das 3'-Ende des Oligonukleotids enthält die terminale Sequenz des DNA-Teils und das 5'-Ende des Oligonukleotids enthält das Ende der linearisierten C-Brick-Standard-Vektorsequenz ( dh "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" für die 5'- -end des vorderen Strangs und "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" für das 5'-Ende des umgekehrten Strangs). Spezielle Beispiele finden sich in einer früheren Studie ⁴ .
   2. Das einzeln aussetzenUal-Oligonukleotiden in ultrareinem Wasser bis zu einer Konzentration von 10 μM
   3. PCR-Reaktionen auf Eis in einem 0,2-ml-PCR-Röhrchen aufbauen: 18 μl ultrareines Wasser, 25 μl 2x PCR-Puffer, 1 μl dNTPs (10 μM), 2,5 μl jeweils die Vorwärts- und Rückwärtsprimer (10 μM ) Aus Schritt 2.2.2, 0,5 μl Schablone (20-500 ng) und 0,5 μl hochflexitiver DNA-Polymerase. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 50 μl beträgt.
   4. Legen Sie den Schlauch direkt in den Thermocycler und führen Sie das Thermocycler-Programm. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
      HINWEIS: Das Thermocycler-Programm auf: einen Zyklus für 3 min bei 98 ° C einstellen; 30 Zyklen für 10 s bei 98 ° C, 20 s bei 55 ° C (nach der Glühtemperatur des Primers) und 1 min (je nach Länge der biologischen Teile) bei 72 ° C; Und einen Zyklus für 10 min bei 72 ° C. Halten Sie die Probe bei 16 ° C.
   5. Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR Cleanup SysTem kit; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
   6. Digitieren Sie den C-Brick-Standardvektor mit BamHI: Fügen Sie 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (1 μg), 5 μl 10x Puffer und 1 μl BamHI zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Inkubieren für bis zu 2 h bei 37 ° C im Wasserbad.
   7. Reinigen Sie das obige Produkt mit einem Gel Cleanup System Kit; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
   8. Füge 2 μl linearisierter Vektor (50 ng) aus Schritt 2.2.7, 5 μl Fragment (200 ng) aus Schritt 2.2.4, 2 μl 5x nahtloser Montagepuffer und 1 μl nahtloses Montageenzym aus einem nahtlosen Montagekit hinzu Zu einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen 10 μl beträgt.
   9. Legen Sie diese in ein 37 ° C Wasserbad für 30 min. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
3. Aufbau durch Restriktionsenzym-vermittelte Verdauung und T4-DNA-Ligase-vermittelte Ligation.
   HINWEIS: Für diejenigen Teile, die aus dem BioBrick (Schritt 2.3.4-2.3.7) und BglBrick (Schritt 2.3.1-2.3.3) Standards gewonnen wurden, können Restriktionsenzym-vermittelte Verdauung und T4-DNA-Ligase-vermittelte Ligation verwendet werden, um die Biologischen Teilen in einen C-Brick-Standard-Vektor.
   1. Die BglBrick-Standardteile mit BamHI und BglII verdauen: 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (2 μg), 5 μl 10x Puffer 3, 0,5 μl BamHI und 0,5 μl BglII in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Inkubieren für 2 h in einem 37 ° C Wasserbad.
   2. Führen Sie eine 1% Agarose-Gelelektrophorese und reinigen Sie das Fragment mit einem Gel Cleanup System Kit.
   3. Ligat das Fragment und der C-Brick-Standardvektor: 2 μl linearisierter Vektor (50 ng) aus Schritt 2.1.12 und 6 μl Fragment (200 ng) aus Schritt 2.3.3 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zugeben. Füge 1 μl 10 x T4 DNA Ligase Puffer und 1 μl T4 DNA Ligase hinzu. Inkubieren für 2 h bei 22 ° C. Benutzen Sie die Proben sofort oder freezE und lagern bei -20 ° C.
   4. Diginieren Sie die BioBrick-Standardteile mit XbaI und SpeI: Fügen Sie 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (2 μg), 5 μl 10x Puffer, 0,5 μl XbaI und 0,5 μl SpeI zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Inkubieren für 2 h in einem 37 ° C Wasserbad.
   5. Digzen Sie den C-Brick-Standardvektor mit XbaI und SpeI: Fügen Sie 34 μl ultrareines Wasser, 10 μl Plasmid (1 μg), 5 μl 10x Puffer, 0,5 μl XbaI und 0,5 μl SpeI zum Mikrozentrifugenröhrchen hinzu . Inkubieren für 2 h in einem 37 ° C Wasserbad.
   6. Führen Sie eine 1% Agarose-Gelelektrophorese aus und reinigen Sie das Fragment aus Schritt 2.3.4 und den linearisierten Vektor aus Schritt 2.3.5 mit einem Gel-Cleanup-System-Kit; Nach dem Protokoll des Herstellers.
   7. Ligat das Fragment und der C-Brick-Vektor: 2 μl linearisierter Vektor (50 ng) aus Schritt 2.3.5 und 6 μl Fragment (200 ng) aus Schritt 2.3.4 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen zugeben. AnzeigeD 1 & mgr; l 10 × T4-DNA-Ligasepuffer und 1 & mgr; l T4-DNA-Ligase. Inkubieren für 2 h bei 22 ° C. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
4. Fügen Sie 10 μl der Produkte aus Schritt 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 oder 2.3.7 für die chemische Umwandlung in die kompetenten Zellen von E. coli (DH10B) hinzu.
5. Nehmen Sie mehrere Klone zu einem 5-ml flüssigen Luria-Bertani (LB) Röhrchen auf und inkubieren bei 37 ° C auf einem Shaker (220 U / min) über Nacht.
6. Extrahieren des Plasmids unter Verwendung eines Plasmidpräparationskits; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
7. Identifizierung der richtigen Klone durch Sanger-Sequenzierung ¹¹ .

3. C-Brick Assembly ( Abbildung 2 )

1. Verdauung des C-Brick-Vektors mit Cpf1
   1. Füge 22,5 μl RNase-freies Wasser, 4 μl 10x Cpf1-Puffer, 10 μl des Plasmids aus Schritt 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI und 1 &# 181; L von Cpf1 (5 μM) zu einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Cpf1 kann nach einer vorherigen Studie kommerziell gekauft oder gereinigt werden.
   2. Um ein fremdes DNA-Fragment in die T1- und T2-Stellen einzufügen, wird 1 μl CrRNA-T2 (10 μM) zugegeben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min inkubiert. Eine dd 1 & mgr; l CrRNA-T1 (10 & mgr; M) und Cpf1 (5 & mgr; M) für weitere 30 min.
      HINWEIS: Um ein fremdes DNA-Fragment in die T3- und T4-Stellen einzufügen, fügen Sie 1 μl CrRNA-T3 (10 μM) hinzu und inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min. 1 & mgr; l CrRNA-T4 (10 & mgr; M) für weitere 30 min zugeben.
   3. 1 & mgr; l wärmeempfindliche alkalische Phosphatase zugeben und das Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für weitere 1 h inkubieren.
   4. Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch und reinigen Sie den Vektor mit einem Gel-Cleanup-System-Kit. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
2. Verdauung des DNA-Fragments mit Cpf1
   1. Fügen Sie 21,5 μl RNase-freies Wasser, 4 μl 10x Cpf1-Puffer, 10 μl Plasmid aus Schritt 2.6 (2 μg), 0,5 μl RRI und 2 μL Cpf1 (5 μM) zu einem 1,5-mL-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
   2. Um ein fremdes DNA-Fragment in die T1- und T2-Stellen einzufügen, werden 1 μl CrRNA-T1 (10 μM) und 1 μl CrRNA-T3 (10 μM) zugegeben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 h inkubiert.
      HINWEIS: Alternativ dazu 1 μl CrRNA-T2 (10 μM) und 1 μl crRNA-T4 (10 μM) zugeben und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 2 h inkubieren.
   3. Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch und reinigen Sie das Fragment mit einem Gel-Cleanup-System-Kit. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
3. C-Brick Montage und weitere Überprüfung
   1. Ligat das fremde DNA-Fragment und C-Brick-Vektor: 2 μl des linearisierten Vektors (50 ng) aus Schritt 3.1.4 und 6 μl des DNA-Fragments (200 ng) aus Schritt 3.2.3 zu einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Füge 1 μl 10x T4 DNA Ligase Puffer und 1 μl T4 DNA Ligase hinzu. Inkubieren für 2 h bei 22 ° C. Benutzen Sie die Proben sofort oder gefrieren Sie sie und lagern Sie sie bei -20 ° C.
   2. Fügen Sie 10 μl der Ligationsprodukte (Schritt 3.3.1) für die chemische Umwandlung in E. coli (DH10B) -kompetenten Zellen hinzu.
   3. Fügen Sie mehrere Klone zu einem 5 ml flüssigen LB-Röhrchen hinzu und inkubieren Sie über Nacht auf einem Schüttler bei 220 U / min und 37 ° C.
   4. Extrahieren des Plasmids unter Verwendung eines Plasmidpräparationskits; Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
   5. Identifizieren Sie korrekte Klone durch Sanger-Sequenzierung ¹¹ .
4. Führen Sie eine neue Runde von C-Brick Montage. Korrekte Klone aus Schritt 3.3.4 können als neuer C-Brick-Vektor oder DNA-Teil für weitere iterative C-Brick-Assembly nach dem gleichen Protokoll aus den Schritten 3.1-3.3 verwendet werden.
   HINWEIS: T2 'und T3' sItes sind als Backup von T2- und T3-Standorten konzipiert ( Abbildung 1a ). Für Plasmide, die aus Schritt 2.3.7 erhalten wurden, können nur T2 'und T3' für die C-Brick-Standardanordnung verwendet werden.

Results

Dieses Protokoll zeigte die Zusammenstellung von drei Chromoproteinkassetten (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) und amilGFP (BBa_K592010)). Zuerst wurden die kodierenden Sequenzen der drei vorgenannten Gene und Terminatoren einzeln in einen C-Brick-Standardvektor kloniert. Kurze DNA-Teile, Promotor und Terminator wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern, die die kurzen DNA-Teile am 5'-Terminus enthalten, in den C-Brick-Vektor eingeführt. Darauf folgte die Sel...

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für den DNA-Assemblierungsstandard C-Brick. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Linearisierung des C-Brick-Standardvektors; Eine unvollständige Spaltung des Vektors könnte die Erfolgsquote ernsthaft beeinträchtigen. Zusätzlich, obwohl Cpf1 hauptsächlich Ziel-DNA-Sequenzen in dem "18-23" -Spaltmuster spaltet, wurde auch eine ungenaue Spaltung nahe den beiden Basen ⁴ nachgewiesen, was eine kleine Anzahl von Mutationen nach der DNA-A...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kommerzielles Oligonukleotid	Sangon Biotech
10x Taq PCR Puffer	Transgen	#J40928
Reinstes destilliertes Wasser	Invitrogen	10977-015
5x RNA-Transkriptionspuffer	Thermo Scientific	K0441
T7 RNA-Polymerase	Thermo Scientific	#EP0111 NTP-Mischung
	Sangon	#ND0056
RRI (rekombinanter RNase-Inhibitor)	Takara	2313A
RNA reinigen & Concentrator-5	Zymo Research	R1015
UV-Vis Spektrometer	Thermo Scientific	Nano-Drop 2000c
2x Phanta Max Puffer	Vazyme	PB505	PCR Puffer
dNTPs	Transgen	AD101
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase	Vazyme	P505-d1
Ezmax für die einstufige Klonierung	Tolobio	24303-1	nahtloser Bausatz
5x Puffer für Ezmax One-Step Cloning	Tolobio	32006
BamHI	NEB	#R0136L
BamHI-HF	NEB	#R3136L
BglII	NEB	#R0144L
XbaI	NEB	#R0145L
SpeI	NEB	#R3133L
10x Buffer 3	NEB	#B7003S
10x CutSmart Buffer	NEB	B7204S
10x T4 DNA Ligase Buffer	Tolobio	32002
T4 PNK	Tolobio	32206
T4 DNA Ligase	Tolobio	32210
DpnI	NEB	#R01762
SV Gel und PCR-Reinigungssystem	Promega	A9282
Plasmid Mini Kit I	Omega	D6943-02	Plasmidvorbereitungskit
thermosensitive alkalische Phosphatase	Thermo Scientific	#EF0651	FastAP
10x Cpf1 Puffer	Tolobio	32008
Cpf1	Tolobio	32105	FnCpf1
Thermocycler	Applied Biosystems	veriti 96 well
C-Brick Standard Vektor	Tolobio	98101
E. coli [DH10B]	Invitrogen	18297010
Luria-Bertani media (Trypton)	Oxoid	LP0042
Luria-Bertani media (Hefeextrakt)	Oxoid	LP0021
Luria-Bertani media (NaCl)	Sangon Biotech	B126BA0007