Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

Summary

Ein selektives und empfindliches Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieverfahren (LC-MS / MS), gekoppelt mit einer effizienten Festphasenextraktion auf einer gemischten Kationenaustausch- (MCX) 96-Well-Mikroplatte, wurde für die Messung von freiem 3-Nitrotyrosin ( 3-NT) im menschlichen Urin mit hohem Durchsatz, der für klinische Anwendungen geeignet ist.

Abstract

Freies 3-Nitrotyrosin (3-NT) wurde weitgehend als möglicher Biomarker für oxidativen Stress eingesetzt. Erhöhte Niveaus von 3-NT wurden in einer Vielzahl von pathologischen Bedingungen berichtet. Allerdings fehlt es den vorhandenen Methoden an der ausreichenden Empfindlichkeit und / oder Spezifität, die notwendig sind, um das niedrige endogene Niveau von 3-NT zuverlässig zu messen und für klinische Anwendungen zu schwerfällig zu sein. Daher ist eine analytische Verbesserung dringend erforderlich, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und die Rolle von 3-NT in pathologischen Zuständen zu überprüfen. Dieses Protokoll stellt die Entwicklung einer neuartigen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Erkennung in Kombination mit einer miniaturisierten Festphasenextraktion (SPE) für die schnelle und genaue Messung von 3-NT im menschlichen Urin als nicht-invasiven Biomarker dar Für oxidativen Stress SPE mit einer 96-Well-Platte vereinfachte den Prozess durch die Kombination von Probenreinigung und Analytanreicherung ohne mühsame Derivatisierungs- und Verdampfungsschritte deutlich, Verringerung des Lösemittelverbrauchs, Abfallentsorgung, Verunreinigungsgefahr und Gesamtverarbeitungszeit. Die Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat (NH ₄ OAc) bei pH 9 als SPE-Elutionslösung verbesserte die Selektivität wesentlich. Die Massenspektrometrie-Signalantwort wurde durch die Einstellung der MRM-Übergänge (MRM) verbessert. Die Verwendung von 0,01% HCOOH als Additiv auf einer Pentafluorphenyl (PFP) -Säule (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) verbesserte die Signalantwort weiter 2,5-fach und verkürzte die Gesamtlaufzeit auf 7 min. Es wurde eine untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) von 10 pg / ml (0,044 nM) erreicht, was eine signifikante Empfindlichkeitsverbesserung gegenüber den angegebenen Assays darstellt. Diese vereinfachte, schnelle, selektive und empfindliche Methode erlaubt es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten. In Anbetracht der deutlich verbesserten analytischen Leistungsfähigkeit und der nicht-invasiven und kostengünstigen Urinprobenentnahme ist der vorgeschlagene Assay für präklinische und klinische Zwecke von VorteilStudien.

Introduction

Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die klinische Präsentation wurden in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt ¹ . Einer der untersuchten Biomarker ist 3-Nitrotyrosin (3-NT), ein endstabiles Produkt, das gebildet wird, wenn reaktive Stickstoffspezies (RNS) mit Tyrosin, einem Catecholamin-Neurotransmitter-Vorläufer, zusammenwirken. Während 3-NT klinischen Wert als Biomarker für RNS in vivo haben kann, können die wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Tyrosin die entsprechenden Proteine ​​und zellulären Funktionen ^{1 , 2} nachteilig beeinflu....

Protocol

Alle Studien mit menschlichen Urinproben wurden unter Einhaltung des von Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB) genehmigten Verfahrens durchgeführt.

1. Urinprobenentnahme und Creatinin (Cr) Bestimmung

1. Sammle 5 ml des nächsten Morgens Urinproben nach ca. 10 h über Nacht in einem 5 mL Transportrohr A mit 250 μl 3 N HCl als Konservierungsmittel und bei -20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
2. Tau und Wirbel 5 mL Transport Urin Eine Röhre und zentrifugieren in einer Zentrifuge ( zB Sorvall) (2297 xg, 10 min).
3. Aliquot 1 ml Urin zweimal aus dem 5 ml Transportrohr A
4. Bestimmen Si....

Results

Fig. 1 veranschaulicht, daß 3-NT vollständig chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosin-Analoga unter der optimierten LC-Bedingung getrennt ist, was die Co-Elutions-Interferenzen aufgrund dieser stark übermäßigen Verbindungen eliminiert und folglich den Grad der Assay-Selektivität erhöht. Darüber hinaus ermöglicht die Gradientenelution mit 0,01% HCOOH als Additiv in MA und Methanol bei einer Durchflussrate von 0,45 mL / min eine schnelle Elu.......

Discussion

Wesentliche Schwankungen der bisher in der Literatur berichteten Konzentrationen für das endogene freie 3-NT in menschlichen Urinproben zeigen methodische Probleme, die mit den verfügbaren Assays ^{8 , 9 , 10 , 11 verbunden sind} . Eine genaue Bestimmung des niedrigen Basalniveaus von 3-NT im menschlichen Urin bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe, die besondere Vorkehrungen für die Probenvorbereitu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Nitro-L-Tyrosin	Sigma	N7389-5g
3-Nitro-L-Tyrosin-13C9	Sigma	652296-5.0mg
Gold Urin	Golden West Biologicals	MSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well & Mikro; Elutionsplatte	Waters	186001830BA
2 mL 96 Well-Sammelplatte	Phenomenex	AH0-7194
96 positiver Prozessor	Wasser
LC-MS Ultra CHROMASOLV Methanol	Sigma	14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV Wasser	Sigma	14263-2L
Ameisensäure für die Massenspektrometrie	Sigma	94318-50ML-F
Ammoniumhydroxidlösung	Sigma	338818-1L
Ultra PFP Propylsäulen	Restek	9179362
5500 Triple Quad	AB Sciex	/	Kontaktieren Sie den Hersteller für weitere Details
UFLC-XR	Shimadzu	/	Kontaktieren Sie den Hersteller für weitere Informationen
Integra 400 Plus	Roche	/	Kreatinin Jaff&eakut im Urin; Gen 2 Methode
LCMS-zertifiziert 12 x 32 mm Fläschchen mit Schraubhals	Wasser	600000751CV
LCGC-zertifiziert 12 x 32 mm Fläschchen mit Schraubhals und vollständiger Rückgewinnung	Wasser	186000384C
5 mL Transportröhrchen	Phenix	TT-3205
50 mL Zentrifugenröhrchen	Kristallinen	23-2263
15 mL Zentrifugenröhrchen	kristallgen	23-2266
eLine elektronische Pipette	Sartorius	730391
Mikrofuge-Zentrifuge	Beckman Coulter	A46474
OHAUS Auswucht	Kennedy Scales, Inc.	735
Vortex-Mischer	Bernstead Thermolyne	M16715