Method Article

Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

DOI:

10.3791/55778

⸱

July 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Pharmasan Labs, Inc., 2NeuroScience, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ein selektives und empfindliches Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieverfahren (LC-MS / MS), gekoppelt mit einer effizienten Festphasenextraktion auf einer gemischten Kationenaustausch- (MCX) 96-Well-Mikroplatte, wurde für die Messung von freiem 3-Nitrotyrosin ( 3-NT) im menschlichen Urin mit hohem Durchsatz, der für klinische Anwendungen geeignet ist.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Freies 3-Nitrotyrosin (3-NT) wurde weitgehend als möglicher Biomarker für oxidativen Stress eingesetzt. Erhöhte Niveaus von 3-NT wurden in einer Vielzahl von pathologischen Bedingungen berichtet. Allerdings fehlt es den vorhandenen Methoden an der ausreichenden Empfindlichkeit und / oder Spezifität, die notwendig sind, um das niedrige endogene Niveau von 3-NT zuverlässig zu messen und für klinische Anwendungen zu schwerfällig zu sein. Daher ist eine analytische Verbesserung dringend erforderlich, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und die Rolle von 3-NT in pathologischen Zuständen zu überprüfen. Dieses Protokoll stellt die Entwicklung einer neuartigen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Erkennung in Kombination mit einer miniaturisierten Festphasenextraktion (SPE) für die schnelle und genaue Messung von 3-NT im menschlichen Urin als nicht-invasiven Biomarker dar Für oxidativen Stress SPE mit einer 96-Well-Platte vereinfachte den Prozess durch die Kombination von Probenreinigung und Analytanreicherung ohne mühsame Derivatisierungs- und Verdampfungsschritte deutlich, Verringerung des Lösemittelverbrauchs, Abfallentsorgung, Verunreinigungsgefahr und Gesamtverarbeitungszeit. Die Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat (NH 4 OAc) bei pH 9 als SPE-Elutionslösung verbesserte die Selektivität wesentlich. Die Massenspektrometrie-Signalantwort wurde durch die Einstellung der MRM-Übergänge (MRM) verbessert. Die Verwendung von 0,01% HCOOH als Additiv auf einer Pentafluorphenyl (PFP) -Säule (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) verbesserte die Signalantwort weiter 2,5-fach und verkürzte die Gesamtlaufzeit auf 7 min. Es wurde eine untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) von 10 pg / ml (0,044 nM) erreicht, was eine signifikante Empfindlichkeitsverbesserung gegenüber den angegebenen Assays darstellt. Diese vereinfachte, schnelle, selektive und empfindliche Methode erlaubt es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten. In Anbetracht der deutlich verbesserten analytischen Leistungsfähigkeit und der nicht-invasiven und kostengünstigen Urinprobenentnahme ist der vorgeschlagene Assay für präklinische und klinische Zwecke von VorteilStudien.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die klinische Präsentation wurden in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt 1 . Einer der untersuchten Biomarker ist 3-Nitrotyrosin (3-NT), ein endstabiles Produkt, das gebildet wird, wenn reaktive Stickstoffspezies (RNS) mit Tyrosin, einem Catecholamin-Neurotransmitter-Vorläufer, zusammenwirken. Während 3-NT klinischen Wert als Biomarker für RNS in vivo haben kann, können die wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Tyrosin die entsprechenden Proteine ​​und zellulären Funktionen 1 , 2 nachteilig beeinflussen. Emerging Research hat vorgeschlagen, dass 3-NT eine wichtige Rolle bei entzündlichen Zuständen spielen kann 3 , neurodegenerative Erkrankungen 4 , 5 , Herz-Kreislauf-Erkrankungen 6 und Diabetes 7 sowie Zustände im Zusammenhang mit oxidativem Stress. Doch diese obseRvations basiert auf Ergebnissen aus Methoden, denen keine Sensitivität und / oder Selektivität fehlt 8 , 9 , 10 , 11 . Die enormen 3-NT-Konzentrationsbereiche für die bisher in der Literatur berichteten biologischen Proben zeigen, dass mit diesen Assays ernsthafte analytische Probleme verbunden sind und technische Verbesserungen erforderlich sind, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und ihre Rolle in der Pathologie dieser Bedingungen zu überprüfen .

Die Quantifizierung von freiem 3-NT in biologischen Matrizen stellt eine besondere Herausforderung für Mensch und Instrument 8 , 9 , 10 , 11 dar . Erstens verlangt der Spurengrad des endogenen 3-NT eine hochempfindliche Detektion; Zweitens die Existenz zahlreicher strukturell ähnlicher Analoga, insbesondere Tyrosin, die inGroßer Überschuss erfordert einen hohen Grad an Selektivität; Drittens erfordert die artefaktuelle Bildung von 3-NT durch Tyrosin-Nitrierung mit ubiquitärem Nitrat und Nitrit eine besondere Berücksichtigung während der Probenvorbereitung, um eine falsche Überschätzung von 3-NT zu vermeiden.

Unter einer Vielzahl von Methoden, die zur Messung von 3-NT eingesetzt wurden, wurde MS / MS aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und Selektivität 11 , 12 , 13 , 14 als Goldstandardmethode angesehen. Gaschromatographie (GC) gekoppelte MS / MS bietet die beste Empfindlichkeit, jedoch sind die unentbehrlichen Probenderivatisierungsschritte zu langwierig und zeitaufwendig, um für den klinischen Nutzen 15 , 16 effizient zu sein. LC-MS / MS erfordert keine komplexe Musterderivatisierung und ist damit vielversprechender. Dennoch gibt es mehrere Hindernisse zu überwinden wie die seDie in der Literatur berichteten LC-MS / MS-Methoden müssen sich für die Messung von niedrigen 3-NT 7 , 17 , 18 verbessern und die relativ lange Durchlaufzeit für die Hochdurchsatzanwendungen 12 , 13 , 17 , 19 verkürzen .

Darüber hinaus spielt bei der Betrachtung klinischer Anwendungen die verwendete biologische Matrix eine bedeutende Rolle. Es sollte einfach und kostengünstig zu erhalten und nicht-invasiv, wenn möglich 20 , 21 , 22 . Plasma, die traditionell verwendete Probe in der Literatur, ist keine klinisch wünschenswerte Matrix, so dass eine Methodik, die Urin verwendet, die nicht-invasiv und kostengünstig ist, gesucht wurde.

Mehrere Versuche zu entwickeln relUnd spezielle LC-MS / MS-Methoden wurden mit Urin 9 , 10 , 11 gemacht . Allerdings haben sie alle nicht selektiv, zuverlässig oder effizient genug für die klinische Anwendung. Die Effektivität der vorherrschenden SPE mit herkömmlicher Umkehrphasenpatrone (C18-Typ) als Probenreinigung für die 3-NT-Analyse wurde in Frage gestellt und eine sequentielle SPE von starkem Kationenaustausch (SCX) und umgekehrter Phase C18-OH wurde vorgeschlagen 6 , 7 , 19 Eine kürzlich entwickelte LC-MS / MS-Methode verwendete ein mehrstufiges Reinigungsverfahren von manueller C18 SPE, präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Online-SPE zur Analyse von 3-NT 23 . Obwohl diese Methode für klinische Zwecke empfindlich genug war, mit einem LLOQ von 0,041 nM, war der Cleanup-Prozess intensiv und langwierig und requiRote 3 ml Urin, die ihre Durchführbarkeit für Hochdurchsatz begrenzt. Ein molekular geprägtes Polymer wurde als SPE-Sorptionsmittel verwendet, um die Effizienz des Reinigungsverfahrens 14 zu verbessern, aber das resultierende LLOQ (0,7 & mgr; g / ml) war für klinische Proben nicht niedrig genug. Eine andere Methode erforderte zweidimensionale (2D) LC-MS / MS- und Immunoaffinitätschromatographie zur Probenreinigung, um eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,022 nM 24 zu erreichen . Während alle diese Methoden Fortschritte bei der Bewertung von 3-NT gemacht haben, hat keiner die Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und Effizienz für klinische Anwendungen erreicht.

Um die Pathologie der freien 3-NT und seine Rolle als Biomarker für oxidativen Stress im klinischen Umfeld zu untersuchen, haben wir eine Methode entwickelt , die einfache, effiziente, genaue und präzise ist, so dass für Hochdurchsatz - klinische Anwendungen 25. Ein miniaturisierter Mischmodus Kation exc(MCX) 96-well Extraktion Mikroplatte wurde implementiert, um eine einfache und effektive Probenreinigung und Anreicherung von 3-NT in einer einzigen Extraktion zu erreichen, die die Nachteile bei den bestehenden Methoden, die eine Derivatisierung, Verdampfung und 2D-LC erfordern, umgehen. Die Flüssigkeitschromatographie mit 0,01% HCOOH als Additiv in der mobilen Phase lieferte eine verbesserte Signalantwort mit einer schnellen Zykluszeit. Die Selektivität wurde durch die Anwendung einer milden NH 4 OAc-Elutionslösung für die selektive Elution von 3-NT und die Verwendung des MRM-Übergangs für sowohl 3-NT als auch den internen Standard (IS) weiter verbessert. Der Matrixeffekt wurde durch die Verwendung einer reduzierten Menge eines bevorzugten 13 C-markierten Isotopen IS zur Quantifizierung kompensiert. Mit dem Aufkommen dieser Methodik werden Forscher und Kliniker in der Lage sein, die Rolle von 3-NT in klinischen Zuständen zu überprüfen und die Auswirkungen von oxidativem Stress weiter zu erforschen.

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Protocol

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Alle Studien mit menschlichen Urinproben wurden unter Einhaltung des von Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB) genehmigten Verfahrens durchgeführt.

1. Urinprobenentnahme und Creatinin (Cr) Bestimmung

  1. Sammle 5 ml des nächsten Morgens Urinproben nach ca. 10 h über Nacht in einem 5 mL Transportrohr A mit 250 μl 3 N HCl als Konservierungsmittel und bei -20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
  2. Tau und Wirbel 5 mL Transport Urin Eine Röhre und zentrifugieren in einer Zentrifuge ( zB Sorvall) (2297 xg, 10 min).
  3. Aliquot 1 ml Urin zweimal aus dem 5 ml Transportrohr A
  4. Bestimmen Sie Cr durch eine Urin-Kreatinin-Methode 26 .

2. Vorbereitung von Standard-, IS- und Qualitätskontroll- (QC) Proben

  1. Eine Stammlösung von 3-NT mit 100 μg / ml in Wasser mit 0,01% HCOOH-Mobilphase A (MA) herstellen und bei -20 ° C aufbewahren.
  2. MachenEine 3-NT-Arbeits-Standardlösung bei einer Konzentration von 100 ng / ml durch Verdünnen der 100 μg / ml 3-NT-Stammlösung mit MA.
  3. Generierung von Standards von 5 bis 2500 pg / ml durch Verdünnung des 100 ng / mL-Arbeitsstandards mit 0,15 M HCl angesäuerter Blindurin frei von 3-NT zusammen mit leeren und doppelten Blindproben.
  4. Eine Stammlösung von IS 13 C 9 -3-NT bei 100 μg / mL in Wasser mit MA vorbereiten und bei -20 ° C aufbewahren.
  5. Machen Sie eine IS-Arbeitslösung bei 500 pg / ml durch Verdünnung der 100 μg / mL 13 C 9 -3-NT IS-Stammlösung mit MA.
  6. Stellen Sie fünf Niveaus von QC-Proben fest, die das LLOQ, niedrige, mittlere und hohe Niveaus ( dh 10, 25, 100, 500 und 1.250 pg / ml) abdecken, durch Verdünnung des 3-NT-Arbeitsstandards im angesäuerten leeren Urin.

3. Festphasenextraktion

  1. Tau-und Vortex Urin Proben, Standards und QC Proben.
  2. Fügen Sie Urin Proben, Standards und QC-SampLes (jeweils 250 & mgr; l) bis 32 Vertiefungen einer sauberen 2 ml 96-Well-Sammelplatte.
  3. Stellen Sie die 500 pg / ml IS-Arbeitslösung (50 μL) in jede Vertiefung vor, außer bei doppelter Blindprobe gut. Füge 0,01% HCOOH (50 μl) zu der doppelten Blindprobe gut hinzu.
  4. Füge LC-MS / MS Wasser mit 0,1% HCOOH (250 μL) hinzu.
  5. Mischen Sie die obige Mischung mit einer 8-Kanal-Pipette dreimal.
  6. Abdeckung der Platte bis zum SPE-Laden.
  7. Legen Sie eine MCX 96-well Extraktion Platte und ein Sammelbehälter auf einem positiven Druck Prozessor.
  8. Bedingung der Extraktionsplatte mit fließendem MeOH (200 μL) durch das Sorptionsmittel.
  9. Äquilibrieren durch Fließen von Wasser mit 2% HCOOH (200 μL) durch das Sorptionsmittel.
  10. Laden Sie das gesamte Volumen jeder der vorgemischten Proben sorgfältig auf die vorkonditionierte Extraktionsplatte mit einer 8-Kanal-Pipette.
  11. Setzen Sie einen niedrigen positiven Druck ( z. B. 3 psi) auf den positiven Druckprozessor, um zu ermöglichen, dass die Mischung durchströmtOust das Sorptionsmittel langsam, stellen Sie den Druck, wenn nötig.
  12. Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Wasser mit 2% HCOOH (200 & mgr; l) durch das Sorptionsmittel.
  13. Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Methanol (200 & mgr; l) durch das Sorptionsmittel.
  14. Waschen Sie die Vertiefungen durch Fließen von Wasser (200 & mgr; l) durch das Sorptionsmittel.
  15. Trocknen Sie die Vertiefungen vollständig mit einer hohen positiven Druckeinstellung ( z. B. 40 psi) auf dem positiven Druckprozessor.
  16. Ersetzen Sie das Reservoir durch eine saubere 2 mL 96-Well-Sammelplatte.
  17. 25 mM NH 4 OAc bei pH 9 (50 μL) auftragen, um den zurückgehaltenen Analyten und IS aus der Extraktionsplatte zu eluieren.
  18. LC-MS Wasser mit 5% HCOOH (50 μL) pipettieren, um das Eluat zu neutralisieren.
  19. Mit der 8-Kanal-Pipette dreimal mischen und zur LC-MS / MS-Station zur Analyse einreichen.

4. LC-MS / MS-Analyse

  1. Messen Sie 2.000 mL LC-MS-Wasser mit einem Messzylinder genau und überführen Sie ihn in eine 2-l-Flasche.
  2. PIpette 200 μl reines HCOOH in die obige Flasche, die LC-MS Wasser enthält.
  3. Gründlich mischen und als mobile Phase A (MA) etikettieren. Include Initialen, Vorbereitungsdatum und Ablaufdatum.
  4. Nehmen Sie eine 2-l-Flasche LC-MS Methanol und Etikett als mobile Phase B (MB) mit Startdatum und Verfallsdatum.
  5. Stellen Sie die Temperatur des Auto-Samplers auf 4 ° C ein.
  6. Legen Sie die Sammelplatte mit vorbereiteten Proben in den Autosampler.
  7. Legen Sie eine PFP-Säule (150 mm x 2,1 mm id, 3 μm) und Schutzsäule in den Ofen.
  8. Stellen Sie die Ofentemperatur auf 30 ° C ein.
  9. Äquilibrieren Sie 10 min unter Verwendung des Erfassungsverfahrens mit der LC-Gradientenelution, wie in Tabelle 1 gezeigt .
Zeit (min) Modul Veranstaltungen Parameter
0 Pumps Pumpe B konz. 5
0,5 Pumps Pumpe B konz. 20
1 Pumps Pumpe B konz. 50
3 Pumps Pumpe B konz. 80
4 Pumps Pumpe B konz. 90
4.01 Pumps Pumpe B konz. 95
5.5 Pumps Pumpe B konz. 95
5.6 Pumps Pumpe B konz. 5
7 Regler Halt

Tabelle 1: Flüssigchromatographie-Gradienten-Elutionsbedingungen

  1. Erstellen Sie eine Batch-Liste mitStandards, QC und Urinproben.
  2. Starten Sie die Charge durch Injektion der vorbereiteten Proben (12 μL).

5. Peak Identification, Integration und Datenprozess

  1. Steuerung der Datenerfassung und -verarbeitung mit der Software.
  2. Identifizieren und integrieren 3-NT- und IS-Peaks für alle Proben.
  3. Stellen Sie eine Standardkurve mit einem Bereich von 10-2.500 pg / mL für die 3-NT-Quantifizierung durch lineare Regression des Peakflächenverhältnisses von 3-NT und IS gegenüber der nominalen 3-NT-Konzentration mit einem Gewichtungsfaktor von 1 / x fest.
  4. Quantifizieren Sie alle Proben mit der Standardkurve.
  5. Bestimmen Sie, ob die QC-Proben in den festgelegten Bereich fallen.
  6. Umwandlung der detektierten Konzentrationen von Urinproben in endgültige Ergebnisse in der Einheit von nM oder nmol / mmol Cr.

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Results

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Fig. 1 veranschaulicht, daß 3-NT vollständig chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosin-Analoga unter der optimierten LC-Bedingung getrennt ist, was die Co-Elutions-Interferenzen aufgrund dieser stark übermäßigen Verbindungen eliminiert und folglich den Grad der Assay-Selektivität erhöht. Darüber hinaus ermöglicht die Gradientenelution mit 0,01% HCOOH als Additiv in MA und Methanol bei einer Durchflussrate von 0,45 mL / min eine schnelle Elu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wesentliche Schwankungen der bisher in der Literatur berichteten Konzentrationen für das endogene freie 3-NT in menschlichen Urinproben zeigen methodische Probleme, die mit den verfügbaren Assays 8 , 9 , 10 , 11 verbunden sind . Eine genaue Bestimmung des niedrigen Basalniveaus von 3-NT im menschlichen Urin bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe, die besondere Vorkehrungen für die Probenvorbereitu...

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Disclosures

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Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenkonflikt haben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren würden Scott Howard und Abigail Marinack für die allgemeine Unterstützung und Koordination dieser Arbeit anerkennen.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3-Nitro-L-TyrosinSigmaN7389-5g
3-Nitro-L-Tyrosin-13C9Sigma652296-5.0mg
Gold UrinGolden West BiologicalsMSG 5000-1L
Oasis MCX 96-well & Mikro; ElutionsplatteWaters186001830BA
2 mL 96 Well-SammelplattePhenomenex   AH0-7194
96 positiver ProzessorWasser 
LC-MS Ultra CHROMASOLV Methanol   Sigma14262-2L
LC-MS Ultra CHROMASOLV WasserSigma14263-2L
Ameisensäure für die MassenspektrometrieSigma94318-50ML-F
AmmoniumhydroxidlösungSigma338818-1L
Ultra PFP PropylsäulenRestek9179362
5500 Triple QuadAB Sciex /Kontaktieren Sie den Hersteller für weitere Details
UFLC-XRShimadzu /Kontaktieren Sie den Hersteller für weitere Informationen
Integra 400 Plus Roche/Kreatinin Jaff&eakut im Urin; Gen 2 Methode
LCMS-zertifiziert 12 x 32 mm Fläschchen mit SchraubhalsWasser600000751CV
LCGC-zertifiziert 12 x 32 mm Fläschchen mit Schraubhals und vollständiger RückgewinnungWasser186000384C
5 mL TransportröhrchenPhenixTT-3205
50 mL ZentrifugenröhrchenKristallinen 23-2263
15 mL Zentrifugenröhrchenkristallgen 23-2266
eLine elektronische PipetteSartorius730391
Mikrofuge-Zentrifuge Beckman CoulterA46474
OHAUS Auswucht   Kennedy Scales, Inc.735
Vortex-Mischer Bernstead ThermolyneM16715
Massenspektrometer 186005521

References

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3 Nitrotyrosine DetectionSolid Phase ExtractionLC MS MS AnalysisHuman Urine SamplesOxidative Stress BiomarkerMiniaturized SPE MethodAmmonium Acetate ElutionPFP Column ChromatographyMultiple Reaction MonitoringLower Limit Quantitation

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