Methodenartikel

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

7.8K Ansichten

DOI:

10.3791/55792

20. September 2017

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Mikrotubuli (MTs) sind dynamisch und fragile Strukturen, die schwierig zu Bild in Vivo, insbesondere in vertebrate Embryonen sind. Immunolabeling Methoden werden hier beschrieben, um verschiedene Populationen von MTs in den Entwicklungsländern Neuralrohr des Zebrafish Embryos zu analysieren. Während der Fokus auf Nervengewebe befindet, ist diese Methodik breit anwendbar auf andere Gewebe. Die Verfahren sind für früh zur Mitte-Somitogenesis-Embryonen (1 Somiten zu 12 Somiten), aber sie zu einer Reihe von anderen Stufen mit relativ geringfügigen Anpassungen sind optimiert. Das erste Protokoll stellt eine Methode zur Bewertung der räumlichen Verteilung der stabile und dynamische MTs und eine Quantitative Analyse dieser Populationen mit Bildverarbeitungs-Software. Dieser Ansatz ergänzt vorhandene Tools Bild Mikrotubuli Dynamik und Verteilung in Echtzeit, mit transgenen Linien oder transiente Expression tagged Konstrukte. Solche Werkzeuge sind in der Tat sehr nützlich, aber sie nicht ohne weiteres zwischen dynamischen und stabilen MTs unterscheiden. Die Möglichkeit, Bild und analysieren diese ausgeprägte Mikrotubuli Populationen hat wichtige Implikationen für Verständnis Mechanismen Zelle Polarisation und Morphogenese. Das zweite Protokoll beschreibt eine Technik, um im Entstehen begriffene MTs gezielt zu analysieren. Dies wird erreicht durch die Erfassung der de Novo Wachstumseigenschaften der MTs im Laufe der Zeit nach Mikrotubuli Depolymerisation mit dem Medikament Nocodazole und eine Erholungsphase nach Medikament auswaschen. Diese Technik noch nicht auf das Studium der MTs in den Zebrafish Embryos angewendet, sondern ist ein wertvoller Test zur Untersuchung der in Vivo -Funktion von Proteinen in die Mikrotubuli Montage verwickelt.

Einleitung

Mikrotubuli (MTs) sind Polymere von α und β-Tubulin, die in linearen Protofilaments zusammenbauen, von denen mehrere kombinieren, um eine hohle Röhre1,2bilden. MTs sind polarisierte Strukturen, mit schnell wachsenden plus enden und minus enden, die an die Centrosome oder andere Mikrotubuli-organizing Center (MTOC)3verankert sind langsamwüchsig. De novo MT-Bildung wird durch Keimbildung bei der γ-Tubulin-Ring-Komplex (γ-TURC), bietet eine Vorlage für MT Montage4eingeleitet. In einer bestimmten Zelle können zwei Populationen von MTs, die wiederum über unte....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Ethik-Anweisung: die Verfahren beschrieben folgen der University of Maryland Baltimore County Tierbetreuung Leitlinien.

1. Analyse des stabilen und dynamische MTs verwenden Immunolabeling (Protokoll 1)

  1. manuelle Dechorionation von Embryonen vor der Fixierung
    1. erhalten frisch Embryonen von überschüssigem Wasser gießt hervorgebracht und dann sammeln überzählige Embryonen in einem Kunststoff Petrischale (siehe Tabelle der Werkstoffe).
    2. Entfernen Sie jeglichen Schmutz aus dem System Wasser und Transfer Embryonen, ein neues Gericht mit Embryo Medium gefüllt (siehe Tabelle der ....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Analyse der stabile und dynamische MTs mit immunolabeling
In Protokoll Nr. 1ist die Verteilung der MT Sub-Populationen während der frühen (neuronale Kiel) und späten Neuralrohr (neuronale Stab) Entwicklungsstadien offenbart, mit Glu-Tubulin und Tyr-Tubulin als Marker für stabile und dynamische MTs, beziehungsweise. Dynamische MTs überwiegen in dem Hinterhirn Stadium der neuronalen Kiel (4-5 Somiten) (Abbildung 2A-D.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Derzeit gibt es viele Methoden für imaging-MT-Dynamik in der frühen Entwicklung der Zebrafisch, von live Imaging tagged Moleküle bis hin zu Immunolabeling der Gewebe11,12,13,14behoben. MTs in einer einzelnen Zelle in dynamischen oder stabile Staaten existieren können, zwar Epithelisierung ein Prozess in dem MTs schrittweise im Laufe der Zeit stabilisiert werden. Mit Hilfe von Markern für stabil.......

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Das konfokale Mikroskop wurde mit Mitteln von US National Science Foundation (NSF), Grant #DBI-0722569 gekauft. Die Forschung wurde durch die US nationale Institute der Gesundheit/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) Grant #GM085290 und US-Department of Defense (DOD) Grant #W81XWH-16-1-0466 verliehen an r.m. Brewster unterstützt. E. Vital wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu UMBC vom Howard Hughes Medical Institute durch die Pre-College und Undergraduate Science Education Program, #52008090 zu gewähren. S.p. Brown wurde unterstützt durch eine US of Education GAANN Fellowship, ein Meyerhoff Graduate Fellowship von NIH/NIGMS Grant #GM055036 un....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AgaroseWird zur Behandlung von Petridischen verwendet.   Bereiten Sie 1% Agarose
zu, indem Sie eine Lösung aus 1 Gramm Agarose pro 100 ml 1X Embryomedium in der Mikrowelle
bis zur Polymerisation.
KpipesSigmaP7643
NaClSigmaS7653
Tris-HClSigmaT3253-500G
KClSigmaP9333-500G
CaCl2· 2H2OSigmaC5080
NP-40American BioanalyticalsAB01424
EGTASigmaE3889-25G
MgCl2SigmaM2670-500G
Rinderserumalbumin (BSA)FisherBP1605
Triton-xAmerican BioanalyticalsAB02025
Anti-Fade-Montage mittelInvitrogenP10144
Maus anti-β-tubulinEntwicklungsstudien Hybridoma BankE71/200
Kaninchen anti-γ-tubulinGenetexGTX1132861/500
Kaninchen anti-α-tubulinGenetexGTX1087841/1000*
Kaninchen anti-detyrosiniertes-TubulinMilliporeAB32011/200-1/1000*  Titrieren Sie den Antikörper bei der ersten Verwendung einer neuen Charge.
Kaninchen Anti-Tyrosin-TubulinMilliporeABT1711/500
Maus Anti-ZentrinMillipore04-16241/1000
Ziege 488 Anti-KaninchenThermofisherA110081/500
Ziege 594 Anti-KaninchenThermofisherA110121/500
Ziege 594 Anti-MausThermofisherA110051/500
Ziege 488 Anti-MausThermofisherA110011/500
VibratomeVibratome1500
PinzetteWorld Precision Instruments555227F
100 mm PetrischaleZellbehandlung229693
35 mm PetrischaleZellbehandlung229638
50 ml FalkenröhrchenFisher14-432-22
Gewebtes Nylonnetz 70 μmAmazon.comB0043D1SZG 
MikropipetteGilsonF123602
GlaspipetteFisherNC-999363-9
Aquarium DichtmittelAmazon.com, von MarineLandSilikon Versiegelung 1 oz (Tube) 
RingständerFisher14-675BO
Microbore PTFE Schlauch, 0.022"IDCole-ParmerWU-06417-21
ModelliermasseAmazon.comSargent Art 22-4000Jede ungiftige Modelliermasse auf Wachs- oder Ölbasis reicht aus
KlemmeFisher02-215-466
60mlSpritze Fisher14-820-11
Embryomedium (E3)34,8g NaCl
1,6 g KCl
5,8 g CaCl2· 2H2O
9,78 g MgCl2· 6H2O

Um eine 60-fache Brühe herzustellen, lösen Sie die Zutaten in H2O auf ein Endvolumen von 2 l auf. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 ein. Autoklav. Um 1X Medium herzustellen, verdünnen Sie 16,5 mL des 60X Stoffes auf 1 L.
Blockierungslösung50 ml TBS-NP-40
2,5 ml normales Ziegenserum
1 g BSA
625 & micro; l Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7,6)155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0,1% NP-40
2x MAB (pH6,4)160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Kommerzielle 3D-BildverarbeitungssoftwarePerkinElmerVolocity (V 6.2)
Trockenblockheizung VWR12621-108Wird als Heizplatte zum Schmelzen von Agarose im Protokoll 1 verwendet.
PräpariermikroskopLeicaMZ12
KonfokalmikroskopLeicaSP5
Flacheinbettungsformemsdiasum.comBEEM 70904-01
Gemeinfreie BildverarbeitungssoftwareNIHImageJ (V 1.5)
* Der Erfolg variiert je nach Chargennummer

Referenzen

  1. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).
  2. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and de....

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Mikrotubuli Analysestabile Mikrotubulidynamische MikrotubuliNocodazol Auswaschungkonfokale BildgebungImageJ AnalyseTubulin Marker

Verwandte Artikel