Methodenartikel

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und

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DOI:

10.3791/55793

⸱

21. Juli 2017

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Zusammenfassung

Das Aufkommen von hochwertigen Mikrofokus-Strahllinien bei vielen Synchrotronanlagen ermöglichte die Routineanalyse von Kristallen kleiner als 10 μm in ihrer größten Dimension, die eine Herausforderung darstellte. Wir stellen zwei alternative Arbeitsabläufe für die Strukturbestimmung von Proteinmikrokristallen durch Röntgenkristallographie mit besonderem Fokus auf in vivo gewachsene Kristalle dar. Die Mikrokristalle werden entweder durch Ultraschallbehandlung aus Zellen extrahiert und durch Differentialzentrifugation gereinigt oder in Cellulo nach Zellsortierung durch Durchflusszytometrie von kristallhaltigen Zellen analysiert. Gegebenenfalls werden gereinigte Kristalle oder kristallhaltige Zellen in schweren Atomlösungen für die experimentelle Phasierung eingeweicht. Diese Proben werden dann auf Beugungsexperimente in ähnlicher Weise durch Aufbringen auf einen Mikromesh-Träger und Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff vorbereitet. Wir beschreiben und vergleichen serielle Beugungsexperimente von isolierten Mikrokristallen und Kristall-Enthaltende Zellen, die eine Mikrofokus-Synchrotron-Strahllinie verwenden, um Datensätze zu erzeugen, die für Phasing, Modellbau und Verfeinerung geeignet sind.

Diese Arbeitsabläufe werden beispielhaft mit Kristallen des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) Polyhedrins, das durch Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus produziert wird, veranschaulicht. In diesem Fall Studie, in der Cellulo- Analyse ist effizienter als die Analyse der gereinigten Kristalle und liefert eine Struktur in ~ 8 Tage von Expression zu Verfeinerung.

Einleitung

Die Verwendung der Röntgenkristallographie zur Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Makromoleküle hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen stetigen Fortschritt erfahren. Die zunehmende Aufnahme der Röntgenkristallographie durch nicht-erfahrene Forscher veranschaulicht die Demokratisierung dieses Ansatzes in vielen Bereichen der Biowissenschaften 1 .

Historisch gesehen wurden Kristalle mit Abmessungen unter ~ 10 μm als anspruchsvoll, wenn nicht unbrauchbar, für die Strukturbestimmung betrachtet. Die zunehmende Verfügbarkeit von dedizierten Mikrofokus-Strahllinien bei Synchrotronstrahlungsquellen weltweit und technologischen Fortschritten, wie die Entwicklung von Werkzeugen zur Manipulation von Mikrokristallen, hat viel von diesen Barrieren entfernt, die den breiten Einsatz der Röntgenmikrokristallographie vereiteln. Fortschritte in der seriellen Röntgenmikrokristallographie 2 , 3 und Mikroelektronenbeugung 4 haDass die Verwendung von Mikro- und Nanokristallen zur Strukturbestimmung nicht nur möglich ist, sondern auch manchmal der Verwendung von großen Kristallen 5 , 6 , 7 bevorzugt ist.

Diese Fortschritte wurden zuerst auf die Untersuchung von Peptiden 8 und natürlichen Kristallen angewendet, die von Insektenviren 9 , 10 produziert wurden . Sie werden nun für ein breites Spektrum biologischer Makromoleküle eingesetzt, darunter die schwierigsten Systeme wie Membranproteine ​​und Großkomplexe 11 . Um die Analyse dieser Mikrokristalle zu erleichtern, wurden sie in Meso , insbesondere Membranproteinen 12 und in Mikrofluidik-Chips 13, analysiert.

Die Verfügbarkeit dieser neuartigen Mikrokristallographie-Methoden hat die Möglichkeit der Verwendung inVivo-Kristallisation als neuer Weg für die Strukturbiologie 14 , 15 , 16, die eine Alternative zur klassischen in vitro- Kristallogenese bietet. Unglücklicherweise, auch wenn in vivo Kristalle produziert werden können, bleiben mehrere Hindernisse wie der Abbau oder Verlust von Liganden während der Reinigung aus Zellen, Schwierigkeiten bei der Manipulation und Visualisierung der Kristalle an der Synchrotron-Strahllinie und langwierigen Röntgenbeugungsexperimenten. Als Alternative wurden auch Kristalle direkt innerhalb der Zelle ohne Reinigungsschritt 17 , 18 , 19 analysiert. Eine vergleichende Analyse deutet darauf hin, dass solche in Cellulo- Ansätze effizienter sein können als die Analyse von gereinigten Kristallen und Ertragsdaten höherer Auflösung 20 .

Dieses Protokoll ist inNeigten dazu, Forschern neu zu helfen, die Protein-Mikrokristallographie neu zu machen. Es bietet Methoden zur Fokussierung auf Probenvorbereitung und Manipulation für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Es werden zwei Möglichkeiten vorgeschlagen, isolierte Kristalle für klassische Mikrokristallographie oder kristallhaltige Zellen zu verwenden, die nach Durchflusszytometrie für die Celluloanalyse sortiert sind ( Abbildung 1 ).

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Protokoll

Anmerkung: In vivo wurde die Kristallisation in vielen Organismen beschrieben, einschließlich in Bakterien, Hefen, Pflanzen, Insekten und Säugetieren (siehe Referenz 21 ). Die Kristallisation von rekombinanten Proteinen wurde auch im Labor unter Verwendung einer transienten Transfektion von Säugetierzellen und einer Baculovirusinfektion von Insektenzellen erreicht. Das folgende Protokoll wurde unter Verwendung des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) -Polyhedrin-Gens, das in einem rekombinanten Baculovirus unter dem Baculovirus-Polyhedrin-Promotor kloniert wurde, entwickelt, der gemäß den Anweisungen in Referenz 22 erzeugt wurde . Obwohl dieses Protokoll an andere Zelltypen angepasst werden kann ( zB Säugetierzellen), beschreiben wir hier die Verfahren für Insektenzellen. Das Protokoll geht davon aus, dass eine Überexpression des Proteins von Interesse bereits erreicht wurde. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus und seine Verwendung zur Expression des Proteins von Interesse sind avIn den Bezugszeichen 23 , 24 , 25 , 26 , 27

1. Identifizierung von kristallhaltigen Zellen

  1. Wenn Zellen in Monoschicht gezüchtet werden, kontrolliere sie direkt in den Kolben. Wenn Zellen in flüssiger Kultur gezüchtet werden, verwenden Sie das folgende Protokoll.
    1. Mit einer sterilen serologischen Pipette 500 μl Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Achten Sie darauf, dass die Sterilität der Hauptkultur beibehalten wird; Behandle die Zellen in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II und folge den standardmäßigen aseptischen Techniken.
    2. 5 μl Zellen aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf einen Glasschieber pipettieren.
    3. Setzen Sie sorgfältig ein Glasdeckel auf die Flüssigkeit und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Wenn die Folie nicht innerhalb von 15 min sichtbar gemacht werden kann, das Deckglas mit Vakuumfett abdichten, um Verdunstung zu vermeidenAtion
  2. Den Kolben oder die Folie mit einem umgekehrten Mikroskop abbilden. Falls vorhanden, verwenden Sie Phasenkontrast und / oder Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC). Beide Techniken erhöhen den Kontrast in transparenten Proben und betonen Linien und Kanten und erleichtern so die Identifizierung von In-vivo- Kristallen.
  3. Die Zellen sorgfältig untersuchen. Start bei 200facher Vergrößerung und Zoom bei maximaler Vergrößerung bei der Erkennung eines potentiellen Kristalls. Die Anwesenheit von Kristallen kann indirekt durch Veränderungen in der Zellmorphologie vorgeschlagen werden ( Abbildung 2 ). Schau nach scharfen Kanten und Änderungen der Brechung (bei Phasenkontrast oder DIC). Bekannte In-vivo- Kristalle nehmen unterschiedliche Formen an, einschließlich Stäbchen, Stapel von Nadeln, Würfeln, Pyramiden und Polyedern (siehe Abbildung 2 und Tabelle 1 für einige Beispiele).
    Anmerkung: Der Anteil der Zellen, die Kristalle enthalten, wird in jedem Fall unterschiedlich sein und kann vorkommenN zwischen den Vorbereitungen variieren, aber im Allgemeinen sollte man nicht erwarten, Kristalle in allen Zellen zu finden. Ähnlich ist auch die Anzahl der Kristalle pro Zelle variabel (siehe Tabelle 1 ), und mehr als ein Kristall kann in einer Zelle gefunden werden. Diese Faktoren müssen nach Möglichkeit optimiert werden, indem man die Vielfalt der Infektion anpasst, die Länge der Expression verändert und das Protein-Konstrukt variiert. Einerseits werden die Bedingungen der Proteinexpression und des Zellwachstums, die die Anzahl der kristallhaltigen Zellen maximieren, die Produktivität verbessern ( z. B. eine höhere Vielfalt der Infektion und eine späte Ernte der Zellkultur). Auf der anderen Seite erleichtern die Bedingungen, in denen Zellen einen Einkristall enthalten, die Datenerfassung ( z. B. eine geringe Infektionsmischung). Angesichts der Anreicherung, die durch die in Schritt 2.2 beschriebene Fließsortierung gebracht wird, empfehlen wir, auf größere Kristalle ( z. B. einen Einkristall pro Zelle) zuzugreifen, auch wenn der Anteil der kristallhaltigen Zellen gering ist.
  4. Wenn KristallS identifiziert werden, ihre Position aufzeichnen (bei der Abbildung der Monoschicht in einem Kolben) und schätzen den Prozentsatz der kristallhaltigen Zellen. Falls vorhanden, verwenden Sie ein Mikroskop, das mit einer Kamera ausgestattet ist, die in der Lage ist, Änderungen auf einer einzelnen Zellenebene zu verfolgen.
  5. Für Zellen in Suspension bestimmen Sie den Grad der Zelllebensfähigkeit nach dem in Referenz 28 beschriebenen Protokoll. Für Zellen, die in einer Monoschicht kultiviert wurden, schätzen Sie durch die visuelle Inspektion den ungefähren Grad der Konfluenz und die Menge der abgetrennten Zellen.
  6. Überwachen Sie das Kristallwachstum, das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit zweimal täglich.
  7. Ernten Sie die Zellen, sobald das Kristallwachstum aufhört zu stoppen. Für bemerkenswert robuste Kristalle wie virale Polyeder, verlängerte Inkubationszeiten (> 4 Tage) erhöhen die Anzahl der großen Kristalle. Für typische Proteinkristalle empfehlen wir jedoch, Zellen zu ernten, wenn die Lebensfähigkeit unter 80% sinkt, um Schäden durch Zelllyse zu vermeiden.
  8. Entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator und fahren Sie fortSchritt 2.2 so schnell wie möglich. Halten Sie die Zellen auf Eis während der folgenden Schritte, sofern nicht anders angegeben.

2. Probenreinigung

Anmerkung: Wir beschreiben zwei Analysemethoden der in vivo- Kristalle aus gereinigten Kristallen bzw. in Cellulo .

  1. Reinigung von Kristallen
    Anmerkung: Es sei denn, es gibt Hinweise darauf, dass die interessierenden Kristalle für niedrige Temperaturen empfindlich sind, auf Eis arbeiten und eiskalte Puffer verwenden, um Kristallabbau zu vermeiden.
    1. 50 ml infizierte Sf9-Zellen in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen pipettieren. Dies entspricht ~ 4 x 10 8 Zellen in einem typischen Experiment.
    2. Pelletzellen bei 450 xg für 10 min bei 4 ° C.
    3. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 40 ml gekühlter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, resuspendieren.
      Anmerkung: PBS wird als Ausgangspunkt für die Reinigung als Standard-Isotonpuffer mit dem Ziel von mim vorgeschlagenIcking die zelluläre Umgebung, wo die in vivo Kristalle wuchs. Es wurde für die meisten in vivo Kristalle verwendet, die in der Zellkultur bis heute 9 , 14 , 29 gewachsen sind. Alternativ wurde auch DMEM-Medium erfolgreich bei der Reinigung von in vivo- Kristallen aus Säugetierzellen 19 verwendet . Wenn Kristalle sichtbar an ihrer Übertragung in PBS leiden oder eine schlechte Beugung aufweisen, sollte dieser Parameter als potentielle Abbaubarkeit untersucht werden.
    4. Sonde das Resuspended Pellet für 30 s bei 10 mA mit einem Ultraschallgerät mit einer 19-mm-Sonde ausgestattet. Um das Erhitzen der Probe zu vermeiden, legen Sie es in ein mit Eis gefülltes Becherglas. Chemische oder mechanische Zellaufstörungen können als Alternativen verwendet werden, wenn Kristalle durch Beschallung beschädigt werden, wie in Schritt 2.1.7 beurteilt.
    5. Zentrifugieren bei 450 xg für 10 min bei 4 ° C. Nach der Zentrifugation sind 2 Schichten sichtbar:Eine obere Schicht von Zelltrümmern, die blassbraun ist, und ein unteres Pellet aus Polyhedrinkristallen, das weiß und kreidig ist.
    6. Verwerfen Sie den Überstand und entfernen Sie die obere Schicht durch vorsichtiges Pipettieren. Respendieren Sie das untere Pellet in 40 ml gekühltem PBS.
    7. Beurteilen Sie die Qualität der Proben durch Bildgebung mit einem Lichtmikroskop.
      1. 5 μl Zellen oder gereinigte Kristalle auf einen Glasrutsche pipettieren. Dies kann bei Raumtemperatur erfolgen.
      2. Setzen Sie sorgfältig ein Glasdeckel auf die Flüssigkeit und vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen.
      3. Bild die Folie mit einem invertierten Mikroskop bei 200facher Vergrößerung. Bild die Probe innerhalb von 15 min von der Vorbereitung auf die Folie Wenn die Folie nicht innerhalb von 15 min sichtbar gemacht werden kann, das Deckglas mit Vakuumfett abdichten, um Verdunstung zu vermeiden.
        HINWEIS: Im Fall von Polyedern erscheinen Kristalle als kräftige Würfel von ~ 1 - 10 μm pro Seite. Überprüfen Sie die Integrität der Kristalle auf der Suche nach Anzeichen von Verlust der Schärfe( ZB runde Kanten), Risse oder Auflösung. Überwachen Sie auch die Anwesenheit von Zelltrümmern, die als Klumpen und Gegenstände von unregelmäßiger Größe und Form erscheinen werden.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.5 bis 2.1.7, halbieren Sie das Volumen des PBS, das verwendet wird, um das Pellet in jedem Zyklus zu resuspendieren, bis die Kristalle frei von Trümmern sind. Das endgültige Pellet in 1 ml gekühltem PBS resuspendieren und die Kristalle in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Die gereinigten Kristalle bei 4 ° C aufbewahren.
    9. Schätzen Sie die Konzentration der Kristalle unter Verwendung eines Hämocytometers, wie vom Hersteller beschrieben. Zählkristalle wie zählt Zellen.

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Abbildung 3 : Gereinigte In-vivo- Mikrokristalle. Repräsentative Reinigung von Kristallen des BmCPV1-Polyhedrins aus Sf9-Insektenzellen, die ( a ) pelletierte Zelltrümmer und Schreie zeigenStals nach der Beschallung, und ( b ) Nahaufnahmen auf den Trümmer- und Kristallschichten. Die Trümmerschicht kann im Überstand sorgfältig resuspendiert und für eine schnellere Kristallreinigung verworfen werden. ( C ) Optisches Mikroskopbild von gereinigten Polyedern. Maßstab = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Isolierung von kristallhaltigen Zellen durch Durchflusszytometrie
    Anmerkung: Um die Definition von Toren in der Durchflusszytometrie zu erleichtern, empfiehlt es sich, eine Kontrollkultur parallel zu dem zu wachsen, der das interessierende Protein exprimiert. Dies kann durch Infektion eines Kolbens von Sf9-Zellen mit einem nicht-relevanten rekombinanten Baculovirus oder durch Vorbereitung von Mock-infizierten Zellen erfolgen. Die Sortierung und Abbildung der Proben erfolgt in der Regel bei Raumtemperatur.
    ACHTUNG: Propidiumjodid ist ein Verdacht auf krebserzeugend und sollte behandelt werdenmit Vorsicht.
    1. Pipet 4 ml infizierte Sf9-Zellen - die ~ 3 x 10 7 Zellen repräsentieren - in einer Röhre, die an die Durchflusszytometrieanalyse angepasst ist. Außerdem wird ein zweites Röhrchen mit einer äquivalenten Anzahl von Sf9-Zellen, die mit einem nicht-rekombinanten Baculovirus infiziert sind, hergestellt.
    2. Füge Propidiumjodid (PI) zu beiden Proben bei einer Endkonzentration von 1 μg / ml direkt vor der Durchflusszytometrie hinzu. Dieser Schritt ist notwendig, um tote Zellen, Zellklumpen und Trümmer zu identifizieren, die die Zellverteilung auf der Vorwärts- und Seitenstreuung verändern können. PI-Bestände von 1 mg / ml in Wasser vorbereiten und bei 4 ° C vor Licht geschützt lagern.
    3. Tragen Sie Zellen auf ein Standard-Durchflusszytometer an, das zur Zellsortierung nach Vorwärts- (FSC) und Seitenstreuung (SSC) fähig ist. Analysieren Sie mindestens 20.000 Ereignisse der Kontrolle ( dh nicht kristallhaltige) Probe. Nach dem Verwerfen von toten Zellen, Zellklumpen und Schutt aus der Analyse, generieren die FSC zu SSC-Plot.
    4. Analysiere mindestens 20.000 sogarTs der kristallhaltigen Probe. Vergleichen Sie den FSC mit dem SSC-Plot mit dem Spott. Suchen Sie nach dem Aussehen einer bestimmten Population, die kristallhaltigen Zellen entspricht. Typischerweise haben Zellen mit intrazellulären Kristallen eine höhere SSC aufgrund einer erhöhten morphologischen Komplexität. Der FSC kann auch zunehmen, wenn das Kristallwachstum eine Zunahme des Volumens der Zelle bewirkt. Definiere die Gates des Strömungssortierers, um Zellpopulationen zu isolieren, die den Flächen des Streudiagramms entsprechen, die sich von der Mocke unterscheiden. Bild die sortierten Proben durch Lichtmikroskopie, wie in Schritt 1 beschrieben, um zu bestätigen, welche Population mit kristallhaltigen Zellen assoziiert ist.
    5. Unter Verwendung der in Schritt 2.2.4 definierten Gates sortieren kristallhaltige Zellen in PBS oder in irgendeinem anderen isotonischen Puffer. Notieren Sie die Anzahl der kristallhaltigen Zellen sortiert sowie das endgültige Volumen, um nachfolgende Schritte zu erleichtern. Lagern Sie die sortierten Zellen auf Eis oder bei 4 ° C.
      Hinweis: In einer Stunde,> 300.000 Polyeder-conWerden auf einem Zellsortierer mit einer 100 mm Düse (138 kPa mit einer Frequenz von 39 kHz) sortiert. Diese Menge an Zellen reicht aus, um> 1000 Maschen zuzubereiten.
    6. Nach dem in Schritt 2.1.7 beschriebenen Protokoll werden die Zellen mit einem Lichtmikroskop abgebildet, um die Anreicherung in kristallhaltigen Zellen zu bestätigen. Die Probenvorbereitung für die Datenerfassung sollte so schnell wie möglich nach der Zellsortierung erfolgen, da sich Kristalle im Laufe der Zeit verschlechtern oder durch Zelllyse freisetzen können.

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Abbildung 4 : Zellsortierung. Repräsentative Durchflusszytometrie-Streudiagramme aus ( a ) nicht infizierten Zellen (Mock), die keine Kristalle enthalten, und ( b ) Sf9-Zellen, die durch ein rekombinantes Baculovirus, das für das BmCPV1-Polyhedrin überexprimiert ist, infiziert sind. Unterschiede im Streumuster zwischen den beiden Populationen alGeringe Gating der kristallhaltigen Zellpopulation (rotes Tor, hohe SSC-Werte). Jede Handlung repräsentiert 20.000 Sortierereignisse. SSC: Seitenlichtstreuung; FSC: Vorwärtslichtstreuung ( C ) Optisches Mikroskopbild einer repräsentativen Population der sortierten Zellen, die das Vorhandensein von intrazellulären Kristallen zeigt. Skala = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Probenvorbereitung für die Datenerfassung

Anmerkung: Wenn Zellen oder Kristalle für die experimentelle Phasingierung derivatisiert werden sollen, folgen Sie dem in Abschnitt 3.1 beschriebenen Protokoll. Ansonsten gehen Sie direkt zu den Abschnitten 3.2 für gereinigte Kristalle oder 3.3 für die Celluloanalyse .

  1. Derivatisierung von gereinigten oder in Cellulo- Mikrokristallen
    ACHTUNG: Vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) beachten.Die meisten Chemikalien, die für die experimentelle Phasierung verwendet werden, sind akut toxisch. Verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken, einschließlich der Verwendung einer chemischen Dunstabzugshaube und persönlicher Schutzausrüstung. Entsorgen Sie Abfallprodukte entsprechend Ihrer Institutionspolitik.
    Anmerkung: Die Art der schweren Atome, ihre Konzentration und Inkubationszeit sind auf einer indikativen Basis für Kristalle des BmCPV1-Polyhedrins angegeben. Diese Parameter müssen experimentell für jedes neue Ziel bestimmt werden. Die nachfolgende Färbung mit Trypanblau in Schritt 3.3.2 kann weggelassen werden, wenn die Zellen durch die für die Phasierung verwendete chemische Verbindung leicht gefärbt werden.
    1. Bereiten Sie gesättigte Lösungen der gewünschten schweren Atome (oder Lösungen anderer Chemikalien, die für die experimentelle Phasierung verwendet werden) vor. Typischerweise werden für jedes schwere Atom Volumina von weniger als 100 & mgr; l benötigt. Entfernen Sie ungelöste Salze und Schmutz durch Zentrifugation mit maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge für 5 min bei Raumtemperatur.
    2. Bereiten Sie Aliquots von ~ 50.000 Kristallen vorOder sortierten Zellen pro schwerer Atomverbindung. Wenn PBS nicht mit der für die Derivatisierung verwendeten Chemikalie kompatibel ist ( dh Niederschlagsformen und die Lösung trübe), pellet die Kristalle bei 4000 xg für 3 min bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge oder die Zellen bei 150 xg für 3 min Überstehen und die Kristalle oder Zellen in 20 μl eines geeigneten Puffers vorsichtig resuspendieren. Wiederholen Pelletieren und Resuspension, um sicherzustellen, dass keine Spuren von PBS bleiben. Stellen Sie das Endvolumen auf 20 μl für alle Aliquots ein.
    3. Füge 20 μl schwere Atomlösung oder andere chemische Verbindung der Wahl zu den Kristallen oder Zellen hinzu. Die optimale Konzentration des schweren Atoms hängt von einer Kombination von zellulären Parametern (Permeabilität, Off-Target-Proteine ​​...) und der Natur des Kristalls des Proteins von Interesse ab. Als Ausgangspunkt testen Sie 3 verschiedene Konzentrationen: volle Sättigung, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. Halten Sie die Proben bei 4 ° C für bis zu 3 Tage. Kristalle der PolyhEdrin sind sehr widerstandsfähig und dicht und erfordern lange tränken, um die schweren atome zu integrieren; Für andere Arten von Kristallen sollte die Inkubationszeit und die Konzentration der schweren Atome experimentell bestimmt werden. Zu kurze Inkubationszeiten erlauben nicht die Aufnahme von richtigen Mengen des schweren Atoms, während lange Inkubationszeiten die Integrität der Kristalle beeinträchtigen können, wodurch ihre Beugungsqualität verringert oder sogar aufgelöst wird. Als Ausgangspunkt versuchen Sie 3 verschiedene Inkubationszeiten für jede schwere Atomlösung ( z. B. 1 min, 1 h und über Nacht). Die erfolgreiche Derivatisierung wird durch Analyse der Beugungsdaten, wie in Abschnitt 5 kurz beschrieben, und Referenzen darin beurteilt.
    5. Den Überschuss der schweren Atomlösung durch Pelletieren der Kristalle bei 4000 xg für 3 min bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge oder die Zellen bei 150 xg für 3 min abwaschen, den Überstand entfernen und die Kristalle oder Zellen vorsichtig in 10 & mgr; l Puffer resuspendieren .
  2. Vorbereitung der Mikromesh-Unterstützung mit gereinigten Mikrokristallen
    ACHTUNG: Die Verwendung von flüssigem Stickstoff ist mit Gefahren wie Erstickung, Kaltverbrennungen, Feuer in sauerstoffangereicherter Atmosphäre und Explosion verbunden. Bitte konsultieren Sie das Risikomanagement und die sichere Arbeitspraxis Ihrer Institution.
    1. Basierend auf der in Schritt 2.1.9 berechneten Kristallkonzentration die Konzentration auf 10 7 Kristalle / ml durch Verdünnen der Probe einstellen; Oder durch Pelletieren der Kristalle bei 4000 xg für 3 min bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge, Einstellen des Endvolumens durch Entfernen des Überstandes und sanftes Resuspendieren der Kristalle.
    2. Wenn Proben im Voraus gefroren werden sollen, kühlen Sie den trockenen Absender oder den Dewar mit flüssigem Stickstoff ab. Bereiten Sie die Fläschchen oder Pucks nach Bedarf vor und kühlen Sie sie mit flüssigem Stickstoff ab.
    3. Das Kristallpellet resuspendieren und ein 0,5 & mgr; l Tröpfchen von Kristallen auf ein Mikromesh durch Pipettieren auftragen. Verwenden Sie 700 μm Maschen mit 25 μm QuadratLöcher als Ausgangspunkt. Der Bereich des Netzes ist nicht kritisch, aber ein größerer Bereich liefert mehr Kristalle pro Mesh und führt zu einer langsameren Verdampfung während der Vorbereitung. Die Größe der Löcher muss möglicherweise optimiert werden, um die Größe der Kristalle größer als 25 μm anzupassen. Bei systematischen Studien sind indizierte Maschen verfügbar, um einen methodischen Raster bei der Datenerfassung zu erleichtern.
    4. Entfernen Sie die meisten der überschüssigen Flüssigkeit durch Blotting mit einem Papier Docht. Die Kristalle sollten gleichmäßig auf dem Netz verteilt werden, ohne sich gegenseitig zu berühren. Wiederholen Sie Schritt 3.1.1. Zur Optimierung der Probenkonzentration Gehen Sie schnell vor und entfernen Sie nicht zu viel von der Flüssigkeit. In Abwesenheit von Kryoschutzmittel verdampft die Flüssigkeit schnell mit der Gefahr der Salzkristallbildung und / oder des Verlustes des Films.
    5. Kryoschutzmittel pipettieren: 0,5 μl einer Lösung von 50% Ethylenglykol in Wasser auf das Netz geben (die Zusammensetzung des Kryobuffers ist an die Probe anzupassen, Vorschläge zur Optimierung von cRyoschutzmittel findet sich in Referenz 30 ). Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch Blotting mit einem Papier Docht. Im Gegensatz zum vorherigen Schritt sollte hier der verbleibende Film des Lösungsmittels so dünn wie möglich sein, um Parallaxeffekte zu reduzieren, die den Prozess der Ausrichtung zwischen dem Kristall, dem Strahlengang und dem Goniometer komplizieren; Und um den durch die Streuung von Röntgenstrahlen durch Flüssigkeit im Strahlengang verursachten Hintergrund zu minimieren.
    6. Sofort Flash-cool die micromesh in flüssigem Stickstoff und Transfer zu einer Durchstechflasche oder Roboter Puck, dann zu einem trockenen Absender oder Dewar für die Lagerung.
  3. Herstellung von Mikromesh mit kristallhaltigen Zellen
    ACHTUNG: Die Verwendung von flüssigem Stickstoff ist mit Gefahren wie Erstickung, Kaltverbrennungen, Feuer in sauerstoffangereicherter Atmosphäre und Explosion verbunden. Bitte konsultieren Sie das Risikomanagement und die sichere Arbeitspraxis Ihrer Institution.
    1. Übertragen Sie die sortierten Zellen auf ein 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Basierend auf der Zelle cOunts, die durch den Zellsortierer aufgezeichnet wurden, die Konzentration auf 10 7 Zellen / ml durch Verdünnen der Probe mit PBS einstellen; Oder durch Pelletieren der Zellen bei 150 xg für 3 min bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge, Einstellen des Endvolumens durch Entfernen des Überstandes und sanftes Resuspendieren der Zellen.
    2. Mischen Sie die Zellen mit einem gleichen Volumen an Trypanblau-Lösung (0,4% G / V) auf eine Endkonzentration von 0,2% G / V.
    3. Wenn Proben im Voraus gefroren werden sollen, kühlen Sie den trockenen Absender oder den Dewar mit flüssigem Stickstoff ab. Bereiten Sie die Fläschchen oder Pucks nach Bedarf vor und kühlen Sie sie auch mit flüssigem Stickstoff ab.
    4. Die Zellen vorsichtig resuspendieren und 0,5 μl sortierte Zellen auf ein Mikromesh pipettieren.
    5. Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch Blotting mit einem Papier Docht. Die Zellen sollten gleichmäßig auf dem Netz verteilt werden, ohne sich gegenseitig zu berühren. Wenn nicht mit Kryoschutzmittel (Schritt 3.3.6), sollte der verbleibende Film des Lösungsmittels so dünn wie möglich sein, um Parallaxeffekte zu komplizieren, die komplizierenE der Prozess der Ausrichtung zwischen dem Kristall, dem Strahlengang und dem Goniometer; Und um den durch die Streuung von Röntgenstrahlen durch Flüssigkeit im Strahlengang verursachten Hintergrund zu minimieren.
    6. Gegebenenfalls Kryoschutzmittel in die Zellen geben: 0,5 μl 50% iges Ethylenglykol, 50% PBS-Lösung auf das Netz pipettieren. Die Zusammensetzung des Kryobuffers ist an die Probe anzupassen; Vorschläge zur Optimierung des Kryoschutzmittels finden sich in Referenz 30 . Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit durch Blotting mit einem Papier Docht, so dass nur ein dünner Film von Lösungsmittel.
      Anmerkung: Die Unterlassung des Kryoprotektionsschrittes änderte nicht die Qualität der Röntgenbeugung, wenn Kristalle des Polyhedrins in Cellulo analysiert wurden , während dieser Schritt für gereinigte Kristalle 20 erforderlich war. Dies gilt nur für die Inkubation der Zellen mit Kryoschutzlösung; Die Probe sollte noch bei 100K analysiert werden, um die Auswirkungen von Strahlenschäden an den Kristallen zu minimieren.
    7. ImmediAustauschen Sie das Mikromesh in flüssigem Stickstoff und transportieren Sie es in eine Durchstechflasche oder einen Roboter-Puck, dann auf einen trockenen Absender oder Lager-Dewar, je nach Bedarf.

4. Datenerhebung

Anmerkung: Die für die Datenerfassung verwendeten Parameter werden als Richtwert angegeben und sollten für jeden Kristalltyp und jede Synchrotronstrahllinie optimiert werden.

  1. Sammeln Sie Daten auf einer Mikrofokus-Kristallographie-Strahllinie (siehe Referenz 7 für eine Liste von Mikrofokus-Strahllinien und deren Eigenschaften). Wenn verfügbar, verwenden Sie einen kollimierten Strahl, der der Größe der Kristalle entspricht.
  2. Für die experimentelle Phasierung durch die Single-Waveength Anomalous Dispersion Methode (SAD), sammeln bei einer Energie maximieren das anomale Signal des schweren Atoms der Wahl. Für die Phaseneinstellung mit dem Multiple Isomorphous Replacement-Verfahren (MIR) sammeln Sie über der Energie einer geeigneten Absorptionskante für das schwere Atom der Wahl (erhältlich unter http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. Nach dem Beladen des Gitters auf das Goniometer beginnen Sie mit der Zentrierung des Micromesh mit dem Strahlengang mit der Face-on (konvexen Seite) und den Side-On-Orientierungen. Dann mit der mikromesh-Gesicht-auf, Feinabstimmung der Ausrichtung durch Ausrichtung der Mitte einer bestimmten horizontalen Spur der Mikromesh (z. B. mit dem zentralen beginnen). Dann sammeln Sie Daten auf dieser horizontalen Spur mit nur geringen Nachstellungen auf die Ausrichtung. Falls vorhanden, verwenden Sie die Zentrierung auf Rasterung bei niedriger Dosis Röntgenbeugung zur Feinabstimmung der Ausrichtung (siehe den lokalen Kontakt an der Synchrotron-Strahllinie).
    Anmerkung: Da eine begrenzte Anzahl von Daten auf Mikrokristallen aufgrund von Strahlungsschäden (typischerweise 10 bis 30 Bilder mit 1 ° Oszillation) gesammelt werden kann, muss der Kristall theoretisch nur mit dem Strahlengang für 10-30 ° ausgerichtet werden. Es ist jedoch kritisch, dass die Ausrichtung genau ist, da der Kristall leicht durch den Mikrostrahl verpasst werden kann (im Allgemeinen kollimiert zu einem DurchmesserEr von ~ 10 μm oder kleiner).
  4. Sammeln Sie die Beugungsdaten, bis die Beugung aufgrund von Strahlenschäden verloren geht. Für Kristalle des Polyedrins wird typischerweise eine Belichtungszeit von 10 sec für eine 1 ° -Oszillation für einen Fluss von etwa 3,6 x 10 11 Photonen / s bei 13 keV mit einem CCD-Detektor (Gesamtdosis <30 MGy) verwendet. Optimieren Sie diese Einstellungen in Abhängigkeit von der Strahllinie und der Natur des verwendeten Kristalls. Insbesondere werden niedrige Dosis- und Feinschneiden für Pixel-Röntgendetektoren empfohlen.
    Hinweis: Bei Verwendung der Cellulo- Strategie werden die mit Trypanblau gefärbten Zellen als blaue Punkte gegen den Hintergrund der Unterstützung erscheinen, wodurch sie einfacher auf den Strahl ausrichten können. Wenn der kollimierte Mikrostrahl etwa die gleiche Größe hat wie die Zellen (~ 10 μm), werden alle in einer Zelle enthaltenen Kristalle gleichzeitig beleuchtet. Bei Zellen, die mehrere Mikrokristalle enthalten, führt dies zur Beobachtung von multiplen Beugungsmustern, die schwer verarbeitbar sind. Jedoch diDie Fraktion von einem der Kristalle neigt oft dazu, das Beugungsmuster zu dominieren und wird vorzugsweise während der Datenverarbeitung indiziert. Für Strahllinien mit einem Röntgenstrahl deutlich kleiner, dass die Zelle, Rasterung bei sehr niedrigen Röntgenstrahlfluss (> 95% Dämpfung) verwendet werden sollte, um auf einem Einkristall vor der Datenerfassung zu zentrieren.
  5. Gehen Sie zum nächsten Kristall in der Fahrspur.
  6. Sobald alle Kristalle der Spur getestet wurden, fahren Sie auf die nächste Spur und wiederholen Sie das Ausrichtungsverfahren. Gehen Sie vor, bis genügend Daten gesammelt wurden oder alle Kristalle getestet wurden.
    1. Vergewissern Sie sich, dass die verarbeiteten Bahnen eindeutig identifiziert sind, so dass Kristalle nicht zweimal verpasst oder gedreht werden (ggf. Skizze zeichnen). Typischerweise wird Trypanblau gelb, nachdem die Zelle bestrahlt wurde, was als Marker verwendet werden kann.

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Abbildung 5 : Datenerfassungsstrategie von Stichproben auf Micromesh-Unterstützung. A ) Strategie der Datenerhebung per Spur; Die Ausrichtung erfolgt zu Beginn jeder Spur (Punkte) und die Daten werden auf der Spur gesammelt. ( B ) Nahaufnahme einer Trypan-blau-gefärbten, kristallhaltigen Zelle auf einem Netz, wie auf dem Mikrokristallographie-Strahllinsenschirm zu sehen. ( C ) Nahaufnahme eines gereinigten Polyeders auf einem Netz, wie auf dem Mikrokristallographie-Strahllinsenschirm zu sehen ist. Die Maschenquadrate sind 25 μm x 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Datenverarbeitung

HINWEIS: Hier erwähnen wir nur kurz die Schritte der Datenverarbeitung, die für die serielle Mikrokristallographie spezifisch sind, wo Daten aus mehreren Kristallen zusammengeführt werden. Viele ausgezeichnete Artikel sindDie die Datenverarbeitung in der Tiefe 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 beschreibt und die Strukturbestimmung über den Rahmen dieses Protokolls hinausgeht.

  1. Wählen Sie den Kristall mit der besten Beugungsauflösung und Qualität als Referenz.
  2. Individuelles Bearbeiten jedes Kristalls unter Verwendung von Standard-Kristallographiepaketen wie HKL-2000 31 , Mosflm 32 oder XDS 33 . Um sicherzustellen, dass Strahlungsschäden die Qualität des Datensatzes nicht verschlechtern, markieren Sie sorgfältig das letzte Bild mit akzeptablen Strahlenschäden. Cut-off-Kriterien, die eine übermäßige Strahlenschädigung anzeigen, sind spezifisch für jeden Kristalltyp, die Verarbeitungspraxis und den Zweck des Experiments. Für die Phasierung der BmCPV1-Polyhedrinkristalle wurden die Daten nach dem Signal-to-n verworfenOise / <σ (I)> pro Bild unter 2 oder der R sym überschritten 50%, wie von HKL-2000 31 berichtet .
  3. Für jeden Kristall definieren Sie die Auflösung und die Anzahl der Frames und verarbeiten mit den richtigen Parametern, um die Integration von Daten mit wenig oder keinem Signal zu vermeiden.
  4. Skalieren und Zusammenführen von Daten von den besten Kristallen zu den Referenzkristallen unter Verwendung von Standardpaketen wie Scalepack in HKL-2000 31 , SCALA in CCP4 34 , 35 oder XSCALE in XDS 33 . Fügen Sie die Daten aus den verschiedenen Kristallen schrittweise hinzu, während Sie die globale Qualität des Datensatzes überwachen, idealerweise bis der Datensatz eine akzeptable Vollständigkeit (> 95%) erreicht. Ablehnen von Kristallen, die einen schlechten Isomorphismus mit dem besten / Referenzkristall darstellen, wie durch Unterschiede in den Elementarzellenparametern und dem armen R- Merge / Chi-Quadrat pro Bild nachgewiesen wird. Wenn zu viele gute Qualität DatensätzeNicht mit dem Referenzkristall (s) skalieren, verwenden Sie ein Programm wie BLEND 36 , das hierarchisches Clustering trägt, um die beste Kombination von Datensätzen zu definieren, um zu verschmelzen.
    Hinweis: In einigen Raumgruppen müssen alternative Indizierungsoptionen getestet werden, um dem Referenzkristall zu entsprechen.
  5. Gehen Sie zur experimentellen Phasierung, molekularen Austausch oder Verfeinerung mit Standard-Kristallographie-Pakete.

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Ergebnisse

Eine Übersicht über beide alternativen Methoden zur Strukturbestimmung mit in vivo Mikrokristallen wird dargestellt ( Abbildung 1 ). Polyeder kann leicht durch Beschallung und Zentrifugation gereinigt werden. Aufgrund ihrer Dichte bilden sie eine Schicht am Boden des Rohres unter einer Trennschicht, die durch Pipettieren entfernt werden kann ( Abbildung 3a und 3b ). Die Probe wird dann mehreren Runden d...

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Diskussion

Dieses Protokoll bietet zwei Ansätze zur Analyse von Mikrokristallen mit dem Ziel, die Analyse von sehr kleinen Kristallen zu erleichtern, die in der Vergangenheit übersehen worden wären.

Kritische Schritte zur Mikrokristallreinigung
Das dargestellte Protokoll wurde mit Bombyx mori CPV1 Polyhedrin optimiert, das in Sf9-Zellen als Modellsystem exprimiert wird. In vivo zeigen Mikrokristalle jedoch eine große Variabilität des mechanischen Widerstandes. ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren möchten Chan-Sien Lay für die Bereitstellung von Bildern von gereinigten Mikrokristallen, Daniel Eriksson und Tom Caradoc-Davies für die Unterstützung bei der MX2-Strahllinie des australischen Synchrotron und Kathryn Flanagan und Andrew Fryga aus der FlowCore-Anlage an der Monash University für ihre Unschätzbare Hilfe

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Sf9 ZellenLife Technologies
SF900-SFM InsektenmediumLife Technologies
1 L ZellkulturflascheThermofisher Scientific
Schüttelinkubator für InsektenzellkulturenEppendorf
50 mL konische RöhrchenFalcon
Zentrifuge mit Schwenkeimern für 50 mL RohreEppendorf
Sonicator ausgestattet mit einer 19 mm SondeSoniprep 150 
GlasobjektträgerHampton Research
HämazytometerSigma-Aldrich
PropidiumiodidThermofisher Scientific
BD Influx Zellsortierer BD Biosciences
Hampton Schwere AtomsiebeHampton Research
MikrozentrifugeEppendorf
MicromeshMitigen700/25 Maschen bieten eine größere Oberfläche. Indizierte Netze können für systematische Studien erworben werden.
PapierdochtMitigenDie Größe des Papierdochts kann für einen optimalen Durchfluss variiert werden. Dies hängt weitgehend von der Art der verwendeten Kristalle und des verwendeten Kryoprotektivums ab.
EthylenglykolSigma-Aldrich
TrypanblauLife Technologies
MX2 Mikrofokus-BeamlineAustralisches SynchrotronEine Liste der verfügbaren Mikrofokus-Beamlines finden Sie in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein
Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793– 1806,
doi:10.1071/CH14455.

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