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Methodenartikel

Sektion Mammary Gland Ganze Mounts für Läsion Identifizierung

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DOI:

10.3791/55796

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24. Juli 2017

 ,  ,  , 
1Curriculum in Toxicology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2National Toxicology Program Laboratory (NTPL), DNTP, National Institute of Environmental Health Sciences, 3Cellular and Molecular Pathology Branch, DNTP, National Institute of Environmental Health Sciences, 4Charles River Laboratories Inc.

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir entwickelten eine Methode zur erfolgreichen Entfernung, Verarbeitung, Sektion und Flecken, zur histopathologischen Auswertung, Mammagewebe, das ursprünglich auf Rutschen als ganze Reittiere fixiert worden war. Diese Methode kann die Sammlung und Auswertung von Brustdrüsen-Vollbehältern in Reproduktions- und Entwicklungsprüfungsstudien fördern.

Zusammenfassung

Die normale Brustdrüsenentwicklung kann durch die Exposition gegenüber Umweltgiftstoffen und pharmazeutischen Produkten, übermäßige Exposition gegenüber Hormonen und genetischen Veränderungen verändert werden. Mamma-Drüsen-Vollmontage sind eine kostengünstige Methode, um die Progression von morphologischen Veränderungen, die nach der Exposition auftreten können, zu erfassen. Allerdings, im späteren Leben, wenn Anomalien anfälliger zu entwickeln sind, kann alleiniges Vertrauen auf diese eine Methode nicht immer genug Informationen liefern, um eine korrekte Diagnose der Anomalie zu machen. Historisch gesehen wird bei chemischen Prüfrichtungsstudien eine einzelne Brustdrüse bei Nekropsie entfernt und als Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -befleckter Abschnitt hergestellt. Die Einbeziehung der kontralateralen Mamma-Ganzkörpersammlung und -analyse verringert die Wahrscheinlichkeit einer falsch-negativen Bewertung. Die Auswertung des ganzen Berges ist durch die Anwesenheit von ein oder zwei ganzen Brustdrüsen auf einer Folie begrenzt, und in einigen Fällen sind die Anomalien, die im ganzen Berg beobachtet werden, neinT gleichmäßig im H & E-Bereich vertreten. Das Ziel dieser Studie war es, ein Protokoll für die Umwandlung von Deckel-Mamma-Vollbefestigungen zu H & E-gefärbten Abschnitten zu entwickeln, so dass Läsionen, die sonst verpasst wurden oder schwer zu diagnostizieren sind, identifiziert werden können. Hier beschreiben wir eine Methode zur Herstellung eines hochwertigen, von Paraffin eingebetteten H & E-Abschnitts aus einer Brustdrüse, die zunächst als Ganzes hergestellt wurde. Im Vergleich zu einem Gewebe, das absichtlich auf H & E-Schnitt vorbereitet wurde, erfordert die gesamte Halterung eine zusätzliche Vorbereitung für die Gewebeentfernung und -verarbeitung. Allerdings wird diese Methode als preiswert angesehen, da es übliche Laborreagenzien und wenig zusätzliche Zeit erfordert. Infolgedessen kann diese Methode wertvolle Informationen darüber liefern, wie chemische und umweltbedingte Expositionen die normale Mamma-Entwicklung verändern, sowie Anzeigeänderungen, die aufgrund genetischer Veränderungen auftreten.

Einleitung

Das Mamma-Ganzes ist eine nützliche und preiswerte Methode, die in vielen Ratten- und Maus-Studien durchgeführt wird, um sowohl normale als auch chemisch induzierte, abnormale Entwicklung zu verstehen. Im Allgemeinen wird eine in verschiedenen Stadien während der Nagetierentwicklung gesammelte Brustdrüse ( dh Adoleszenz, Pubertät, Mittel- bis Spätschwangerschaft und Involutionsphase) morphologische Veränderungen in der Gewebe- und Zellarchitektur zeigen, die durch parokrine, endokrine und autokrine Faktoren beeinflusst werden 1 In der alternden Ratte werden die epithelialen und stromalen Teile der Drüse immer dichter, was die Messung morphologischer Parameter in einem ganzen Berg schwierig macht. So ist es üblich, eine Drüse zur histologischen Auswertung zu sammeln, um Veränderungen auf mikroskopischer Ebene zu identifizieren. Beide Verfahren sind besonders nützlich bei Studien mit chemischer Exposition ( dh Umwelt oder Pharma) oder zur Untersuchung der morphologischen Veränderungen, begleitet von genetischen VeränderungenAtions

Techniken und Fähigkeiten zur Verwendung der Brustdrüse bei der Risikobewertung entwickeln sich weiter. Während die Vollmontagevorbereitung routinemäßig und standardisiert ist, gehen die Modifikationen zum Schnitt weiter 2 , 3 . Viele Forschungsgruppen aus verschiedenen Bereichen ( das heißt, die Wissenschaft, die Regierung und die Industrie) haben koronale / Längsschnitte von Brustgeweben als ein bevorzugtes Verfahren angepasst, während einige Labors noch Querschnittschnitt durch die 4 Haut. Die letztere Methode führt zu einer unangemessenen Darstellung der Epidermis (Haut), anstatt des Gewebes von Interesse: das Brustdrüsenepithel 2 . Koronale oder Längsschnitte sind für die Charakterisierung des normalen Gewebes 5 nützlicher und verbessern den Nachweis von Anomalien und Läsionen aufgrund der erhöhten Oberfläche und der Anzahl der vorhandenen Strukturen erheblich. Insgesamt macht das das ganze moEine geeignete Methode für die vergleichende histopathologische Beurteilung der Brustdrüse 1 , 2 . Ob mit einer Maus oder eine Ratte, Abrufen und Erhaltung des 4. und 5. Inguinaldrüsen hoch für den Vergleich der gesamten empfohlen montieren zu einem kontralateralen H & E Abschnitt.

Bei der Verwendung in Kombination, die H & E Abschnitt und ganze Mount bieten eine genaue Darstellung der zellulären und morphologischen Veränderungen durch Umweltbelastung induziert. Dies trifft besonders bei bestimmten Nagetierstämmen zu, bei denen das Modell eine geringe Anfälligkeit für die Tumorbildung besitzt oder ein Tumor nicht grob sichtbar ist. Unter bestimmten Umständen kann das Erhalten des erforderlichen Gewebes nicht immer mit beiden Techniken ( dh unzureichende Gewebemenge, Ressourcen oder unerwartete experimentelle Ergebnisse) möglich sein. In unserem Fall wurden Anomalien in der Mamma ganze Berg beobachtet, während HistopathoLogische Befunde in der kontralateralen H & E-Drüse waren meist normal. Die überwältigende Diskrepanz zwischen den kontralateralen Drüsen führte uns dazu, ein wirtschaftliches und effizientes Verfahren zu entwickeln, um die Anomalien in den ganzen Bergen zu identifizieren. Unter Verwendung eines modifizierten Verarbeitungs- und Einbettungsverfahrens wurden qualitativ hochwertige H & E-gefärbte Abschnitte aus Paraffin-eingebetteten ganzen Montierungen hergestellt. Wir stellen uns vor, dass dieses Protokoll zu einem leistungsfähigen Erkennungsinstrument für chemische Expositionseffekte wird, die Inter-Lab-Vergleiche verbessern.

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Protokoll

Alle Tiernutzungen und -verfahren für diese Studie wurden vom NIEHS Laboratorium genehmigt

Pflege und Nutzung Ausschuss und durchgeführt in einer Vereinigung für die Bewertung und Akkreditierung von

Labor-Tierpflege-akkreditierte Einrichtung.

1. Mamma Vollständige Vorbereitung 2 , 3 , 6 , 7

  1. Entfernen Sie die Leisten-Brustdrüsen von einer Seite einer nicht-schwangeren CD-1-weiblichen Maus, wie in Referenz 3 beschrieben , und legen Sie sie auf eine elektrostatisch aufgeladene Folie.
  2. Decken Sie die Drüse mit Antihaft-Papier oder Film und legen Sie eine weitere Folie auf die Oberseite. Fügen Sie Druck ( dh Wassergewichte) auf die Folie, um die Drüse flach zu verbreiten, so dass die Drüse an der Folie zur Fixierung haften bleibt.
  3. Tauchen Sie die Folien in Fixiermittel ein ( z. B. 100% Ethanol, Chloroform und Eisessig im Verhältnis 6: 3: 1)Übernachtung bei Raumtemperatur.
  4. Die Drüsen aus dem Fixiermittel entfernen und in Ethanol für 15-30 min waschen. Nach der 30-minütigen Waschung wechseln Sie allmählich in Wasser, indem Sie 1/3 des Ethanols ausgießen und Wasser zugeben. Lassen Sie die Wäsche für ca. 5 min jedes Mal sitzen, und wiederholen Sie mit dem Zusatz von Wasser 3 mal.
  5. Fleck ( zB Karmin-Alaun-Lösung) für 12-24 h.
    HINWEIS: Dickere Gewebe benötigen längere Färbezeiten. Siehe Referenz 3 zum Färben von Details.
  6. Gießen Sie den Fleck nach der zugeteilten Zeit aus und spülen Sie die Rutschen in Wasser für 30 s. Dehydrieren der Gewebe durch Waschen der Objektträger in 70% Ethanol für 15 min, gefolgt von einer 15 min Waschung in 95% Ethanol und einer abschließenden Wäsche in 100% Ethanol für 20 min.
  7. Lösche das Fett aus den Geweben, indem du sie in Xylol für mindestens 24 Stunden oder länger, wenn das Gewebe dick ist, so dass alle opaken oder weißen Flächen entfernt werden.
  8. Entfernen Sie das Gewebe aus dem Xylol und fügen Sie schnell m hinzuTrägermedium zum Schieber, um Gewebetrennung zu vermeiden; Legen Sie ein Deckglas auf die Oberseite. Lassen Sie die Folie mindestens 48 Stunden lang trocknen.
  9. Bewerten Sie das gesamte Gewebe für Anomalien, wie in 2 beschrieben .
    HINWEIS: Wenn Läsionen in ganzen Montierungen erkannt werden und eine Sektion notwendig ist, um ihre Identität zu etablieren, sollten die folgenden Schritte befolgt werden.

2. Abbau der Mamma-Ganzer Mount von einer Glasrutsche

  1. Entfernen Sie das Deckglas und das Montagemedium, indem Sie den Mamma-Vollgleitschieber in ein mit Xylol über Nacht gefülltes Glasfärbeglas eintauchen.
    HINWEIS: Dickere Gewebe und Folien mit übermäßiger Montagelösung können zusätzliche Zeit für die Deckelentfernung benötigen.
  2. Nach dem anfänglichen Überleben einweichen, die Folien in frisches Xylol geben und 6 h einwirken lassen. Führen Sie ein letztes Einweichen in frischem Xylol über Nacht.
    HINWEIS: Das Deckglas wird nach dem letzten Einweichen leicht von der Rutsche fallen.
  3. Mit agGeliebte Hand, halten Sie die Folie und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass es in einem Stück entfernt wird.
    HINWEIS: Für den Fall, dass das Deckglas noch an der Glasrutsche befestigt ist, weiter einweichen, bis es mit geringem Aufwand entfernt werden kann.
  4. Sobald das Deckglas entfernt ist, halten Sie die Folie senkrecht zu einer Glas Petrischale mit Xylol, nehmen Sie sorgfältig eine scharfe, wegwerfbare Rasierklinge und schieben Sie die Klinge in einer einzigen Bewegung auf die Folie.
  5. Sobald das Gewebe entfernt ist, tauchen Sie schnell die Mamma-Pad in eine Xylol-gefüllte Glas Petrischale, um sicherzustellen, dass das Gewebe nicht an der Luft trocknet.
    HINWEIS: Sei vorsichtig mit diesem Schritt. Die gesamte Halterung ist dünn (≤ 1 mm) und zerbrechlich aus der Xylolverarbeitung. Alle Eindrücke oder Tränen können die Morphologie des Gewebes verändern und spätere Auswertungen komplizieren.

3. Gewebeverarbeitung

  1. Sobald das Gewebe in der Petrischale ist, muss es sorgfältig übertragen werdenZu einer etikettierten Histologiekassette. Ergreifen Sie den Rand des Fettkissens mit stumpfen Nasen, gezahnten Zangen, um Gewebeschäden zu minimieren.
    1. Mit einem Rasiermesser, schneiden Sie größere Gewebe (vor allem für Ratten) in der Hälfte und legen Sie sie in zwei separate etikettierte Kassetten, die die Gewebegröße unterbringen wird. Legen Sie das Gewebe nach rechts (verwenden Sie den Lymphknoten als Referenz). Stellen Sie sicher, dass das Gewebe ohne Lymphknoten in der gleichen, aufrechten Position gehalten wird, wenn es auf die Kassette übertragen wird.
  2. Legen Sie die Kassette bis zu 2 Stunden in einen Behälter aus Xylol, bevor Sie sie in den Gewebeprozessor legen.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, die Proben am selben Tag zu verarbeiten, an dem sie in die Kassette gelegt werden. Verlängertes Einweichen in Xylol wurde nicht geprüft.
  3. Laden Sie die maximale Anzahl der Kassetten von Hand in den Gewebeprozessor.
  4. Bevor Sie beginnen, programmieren Sie alle Reagenzien, die für diesen Prozess in die Reagenzliste des Prozessors verwendet werden. Um die Bewegung zu automatisierenVon einer Station zur nächsten, verwenden Sie die Menüoptionen und erstellen Sie ein neues Programm. Wenn alle Schritte abgeschlossen sind, wählen Sie 'OK', um fortzufahren.
    HINWEIS: Der Prozessor erlaubt die Überprüfung aller Stationsdetails vor dem Start.
    1. Automatisieren Sie den Prozessor, um die Kassetten in Xylol für 30 min bei 37 ° C einzuweichen, gefolgt von einem zweiten Einweichen in frischem Xylol unter den gleichen Bedingungen. Automatisieren Sie den Prozessor, um die Kassetten aus der Xylol-Lösung zu entfernen und übertragen Sie die Gewebe auf die nächste Station, die ein 1: 1 Xylol: geschmolzenes Paraffingemisch enthält, das auf 60 ° C für 30 min eingestellt wurde.
      HINWEIS: Der Prozessor überträgt dann die Kassetten in eine neue Kammer, die 1 h geschmolzenes Paraffin enthält. Nach 1 h werden die Proben automatisch in eine neue Kammer aus frischem geschmolzenem Paraffin überführt und für weitere 2 h verarbeitet. Beide Schritte werden bei 60 ° C durchgeführt.
    2. Der Prozessor überträgt dann die Kassetten an die Station, die geschmolzene Para enthältFfin für 1 h. Dann werden die Proben automatisch auf die endgültige Station von frischem geschmolzenem Paraffin übertragen und für weitere 2 h verarbeitet. Beide Schritte werden bei 60 ° C durchgeführt.

4. Einbetten des verarbeiteten Mammagewebes

  1. Legen Sie die Kassetten in den 58 ° C-Paraffin-Haltetank der Einbettstation, bis sie bereit sind, das Gewebe in die Form einzubetten.
  2. Entfernen Sie die Kassettenabdeckung, um die beste Formgröße für das Gewebe zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Form groß genug ist, um das Gewebe aufzunehmen, und lassen Sie genügend Platz, um eine gewebefreie Grenze von Paraffin um den Umfang zu haben.
  3. Füge 3-4 mm geschmolzenes Paraffin der Form hinzu und orientiere die Mamma-Vollmontage-Oberfläche, die angrenzt an den Boden des Glasschiebers und den Boden der Kassette, nach oben in der Form.
  4. Übertragen Sie die Form auf eine Kühlplatte und richten Sie das Gewebe nach Bedarf schnell ein, so dass es parallel zur Form ist. BOttom
    HINWEIS: Sobald das Paraffin aushärtet, wird das Gewebe an Ort und Stelle gebaut.
  5. Mit warmer Pinzette, legen Sie die beschriftete, untere Hälfte der Kassette auf die Oberseite der Form; Mit der Pinzette fest drücken.
  6. Füge zusätzliches geschmolzenes Paraffin der Form in einer kontinuierlichen Bewegung hinzu, um die gesamte Kassette zu bedecken. Bewegen Sie die Form von der warmen Platte zu einer kalten Platte, um die Aushärtung des Blocks zu vervollständigen.
  7. Entfernen Sie den Block aus der Form, wenn das Paraffin vollständig verfestigt, um Risse oder Luftblasen zu vermeiden.
    HINWEIS: Das Paraffin-eingebettete Gewebe bei Raumtemperatur aufbewahren, bis es fertig ist.

5. Schnitt des Paraffin-eingebetteten Mamma-Gewebes auf dem Mikrotom

  1. Vor dem Schneiden die Paraffinblöcke bei -20 ° C für 1 h inkubieren.
    ANMERKUNG: Es wird ein restliches Befestigungsmedium in dem Block aus dem ursprünglichen, abgedeckten, vollständig montierten Gewebe geben. Das Kühlen des Blocks verbessert die Blockierung und das Rippen.
  2. Bereiten Sie das Mikrofon vorRotom durch Einschalten des Wasserbades, mit frischem destilliertem Wasser, und Einstellung der Temperatur auf 42-45 ° C. Legen Sie eine frische, flache Klinge auf das Mikrotom und legen Sie sie auf 4 μm.
    HINWEIS: Die Abschnittsqualität wird mit Abschnitten, die dicker als 4 μm sind, aufgrund des Vorhandenseins des restlichen Befestigungsmediums im Gewebe reduziert.
  3. Setzen Sie den Block in das Mikrotom ein, wobei das Wachs der Klinge zugewandt ist und mit der vertikalen Ebene ausgerichtet ist. Dann befeuchten Sie einen Abschnitt von Gaze-Pad in kaltem Wasser und legen Sie es auf den Block für einige Minuten.
  4. Sektionieren Sie den Block, indem Sie das große Rad im Uhrzeigersinn drehen, in Kombination mit dem groben fortgeschrittenen Rad, bis eine volle Fläche oder ein repräsentativer Blockabschnitt erhalten wird.
    HINWEIS: Das Gewebe ist dünn, weil Xylol Clearing während der Voll-Mount-Prozess. Blockieren Sie den Block ordnungsgemäß mit der Klinge, um die Anzahl der Schnitte bei der Erlangung eines repräsentativen Abschnitts zu minimieren.
  5. Wähle das BandSchneiden Sie das Band sorgfältig in das warme (45 ° C) Wasserbad (vorbereitet), lassen Sie Gewebefalten abführen und sorgfältig einen Abschnitt auf eine saubere Glasrutsche schweben.
  6. Legen Sie die Objektträger aufrecht auf ein Trockengestell, um überschüssiges Wasser zu entfernen. Die Schläuche in einer leicht geöffneten Schiebebox über Nacht bei 37 ° C inkubieren.

6. Automatisierte und manuelle H & E-Färbung von Sektions-Mamma-Geweben

  1. Vor der Färbung werden die Objektträger bei Raumtemperatur gelagert.
  2. Für automatisierte Färbung wählen Sie H & E aus den Fleckoptionen im Hauptmenü. Deparaffinierung, Färbung und Dehydratation sind alle auf dem automatisierten Stainer abgeschlossen. Verwenden Sie das Montagemedium und ein Deckglas, um die Abschnitte zu montieren.
  3. Wenn man die Schieber manuell färbt, deparaffiniere man die Schnitte durch Eintauchen der Schieber in Xylol für 5 min. Überführung in frisches Xylol und Wiederholung für 5 min.
  4. Rehydrieren Sie die Dias durch Eintauchen von ThEm zweimal in 100% Ethanol für jeweils 3 min gefolgt von zwei Wiederholungen in frischem 95% igem Ethanol und zwei getrennten Waschungen in 1X Waschpuffer bei jeweils 5 min.
  5. Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser.
  6. Füge die Folien dem Hämatoxylin für 1-2 min hinzu. Entfernen Sie die Folien und spülen Sie sie mit laufendem Leitungswasser für 5 min.
    HINWEIS: Hämatoxylin vor jedem Gebrauch filtrieren.
  7. Legen Sie die Objektträger in 1% Eisessig für 30 s, um die Farbdifferenzierung zu fördern, und dann im laufenden Leitungswasser für 1 min ausspülen.
  8. Fügen Sie Folien zu 1X PBS für 30 s bis 1 min hinzu, um die Gewebeabschnitte zu blau, gefolgt von einem 5 min Spülen in Leitungswasser und dann in 95% Alkohol für 15 - 20 s.
  9. Gegenfärbung mit Eosinlösung für 30 s bis 1 min. Danach dehydrieren die Dias zweimal in frischem 95% igem Ethanol, gefolgt von zwei frischen Wiederholungen in 100% Ethanol. Führen Sie jede Wäsche für 5 min.
  10. Die Rutschen in Xylol, mit zwei Änderungen in Xylol für jeweils 5 min.
  11. DeckelDer Gewebeabschnitt mit Montagemedium und trockene Wohnung über Nacht bei Raumtemperatur.

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Ergebnisse

Diese Methode ist wirksam bei der Unterstützung von Diagnosen, die sonst verpasst worden sein könnten, wenn der ursprüngliche kontralaterale H & E-Abschnitt des Mamma-Pad keine histologischen Veränderungen zeigte. Allerdings ist das Ergebnis nur dann sinnvoll, wenn während der anfänglichen Vollmontagevorbereitung sowie bei der Vorbereitung des Gewebes für die histologische Auswertung geboten wird. Paraffin Einbettung wird Schutz bieten und wird dazu beitragen, das Gewebe für zukünfti...

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Diskussion

Die Brustdrüsen-Vollmontage ist ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die normale Mamma-Entwicklung und morphologische Veränderungen zu veranschaulichen, die auftreten können und bestehen nach der Exposition gegenüber Chemikalien, einschließlich endokriner Disruptoren. Wenn ein ganzer Berg und ein H & E-Abschnitt aus demselben Tier zusammen beurteilt werden, können sie einen genauen visuellen Schnappschuss von frühen Veränderungen liefern, die in einen krankeren Zustand übergehen können.

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine gegensätzlichen Interessen, um in Bezug auf die Forschung, die Autorenschaft und / oder die Veröffentlichung dieses Artikels zu erklären.

Danksagungen

Die Autoren möchten Pam Ovwigho, Tenette Jones und Natasha Clayton, NIEHS, für ihre technische Kompetenz und Unterstützung bei diesem Projekt anerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
XylolSigma-Aldrich214736
PermountThermo Fisher ScientificSP15-100Eindeckmedien zum Eindecken ganzer Passepartouts und E-Sektionen
Leica automatisierter ProzessorLeica BiosystemsModell # ST5020
HM 355S Automatisches MikrotomThermo Fisher Scientific 905200
ParaffinLeica BiosystemsEM-400
Superfrost plus ObjektträgerThermo Fisher Scientific4951PLUS-001elektrostatisch aufgeladen
Fisher Finest 24x60x1Thermo Fisher Scientific12-548-5PDeckgläser
Varistain Gemini ES Automatischer ObjektträgerfärberThermo Fisher ScientificA78000014
Sta-OnLeica Biosystems3803107flüssiger Klebstoff; wird im Wasserbad beim Trennen
verwendet Modifiziertes Harris Hämatoxylin 72711Richard-Allan Scientific (Teil von Thermo Scientific)72711
EosinLeica Biosystems3801600
LithiumcarbonatSkyTech LaboratoriesLCQ500
EisessigsäureThermo Fisher ScientificA38-500wird in Carnoys Fixiermittel
ChloroformMacron Fine Chemicals4440-04wird in Carnoys Fixiermittel
benötigt 100 % EthanolDie Warner Graham Company6505001050000in Carnoys Fixiermittel und Waschobjekten benötigt
95 % EthanolDie Warner Graham Company6505011137320190
Karmin-AlaunSigma-AldrichC1022-25G
Aluminium-Kaliumsulfat-Dodecahydrat, Sigma UltraSigma-AldrichA7210-500G
Automatisierungs-Waschpuffer, 20XBiocare MedicalTWB945
benötigt

Referenzen

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