Die Bestimmung der optimalen inhibitorische Frequenz für Krebszellen mit Tumor Behandlung Fields (TTFields)

Zusammenfassung

Tumor Behandlung Fields (TTFields) sind eine wirksame anti-Tumor-Behandlungsmodalität über die kontinuierliche, nichtinvasive Anwendung von geringer Intensität geliefert, Zwischenfrequenz, elektrische Wechselfelder. TTFields Anwendung auf Zelllinien unter Verwendung einer in vitro TTFields Systemanwendung ermöglicht die Bestimmung der optimalen Frequenz , die in Zellzählungen zur höchsten Reduktion führt.

Zusammenfassung

Tumor Behandlung Fields (TTFields) ist eine wirksame Behandlungsmethode über die kontinuierliche, nichtinvasive Anwendung von geringer Intensität geliefert (1-3 V / cm), elektrische Wechselfelder in dem Frequenzbereich von einigen hundert kHz. Die Studie der TTFields in Gewebekultur in vitro - Anwendungssystem der TTFields durchgeführt, die für die Anwendung von elektrischen Feldern mit unterschiedlichen Frequenzen und Intensitäten auf keramische Petrischalen mit einer hohen Dielektrizitätskonstante (Ɛ> 5000) ermöglicht. Kanzerösen Zelllinien ausplattiert auf Deckgläser an der Unterseite der Keramikpetrischalen werden auf TTFields in zwei orthogonalen Richtungen bei verschiedenen Frequenzen zugezogen Behandlungsergebnis Tests, wie Zellzählungen und klonogenen Assays zu erleichtern. Die Ergebnisse in diesem Bericht zeigen, dass die optimale Frequenz der TTFields in Bezug auf beide Zellzählungen und klonogenen Assays 200 kHz für beide Eierstock- und Gliomzellen ist.

Einleitung

Tumor Behandlung Fields (TTFields) ist eine anti-mitotische Modalität für die Behandlung von Glioblastoma multiforme und möglicherweise anderen Krebsarten. Die Felder werden durch die kontinuierliche Anwendung von geringer Intensität (1-3 V / cm), Zwischenfrequenz (100-500 kHz), elektrische Wechselfelder in dem Bereich des Tumors , ^{1, 2} geliefert werden . TTFields Anwendung in vitro und in vivo gezeigt wurde in mehreren Tiertumormodellen ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7} sowohl das Wachstum von verschiedenen Krebszelllinien und die Progression der Tumoren zu hemmen. Pilot klinische Studien und größere randomisierten Studien bei Patienten mit soliden Tumoren, einschließlich Glioblastom und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, hat demonstdie Sicherheit und Wirksamkeit von kontinuierlicher TTFields Anwendung ^{8, 9, 10} bewertet. Die Wirksamkeit der TTFields wurde gefunden zu sein: (1) frequenzabhängig ist , mit spezifischen optimalen Frequenzen auf die höchste Verringerung der Zellzahlen von Zelllinien aus unterschiedlichen Ursprüngen führenden ^{1, 2, 4, 5, 6, 7;} (2) die elektrische Feldstärke abhängig, mit einem minimalen Schwellenwert für die Aktivität bei etwa 1 V / cm und stärker höheren Intensitäten ^{1, 2, 7, 11;} (3) verbessert , wenn die Behandlungsdauer länger war ^5; und (4) höher ist, als 2-Wege-TTFields wurde senkrecht zu jeder OTH angewandtIm Vergleich zu elektrischen Feldern aus einer einzigen Richtung ¹ . Basierend auf den obigen Befunden können TTFields auf Patienten für lange Zeitdauern angewendet werden, wobei 2 Sätze von Wandlerarrays verwendet werden, die auf der Haut der Patienten lokalisiert sind, um die elektrischen Feldintensitäten im Tumorbett ^{12 , 13 zu} maximieren.

Das Studium der Effekte von TTFields auf Krebszellen in vitro bietet derzeit die einzige Möglichkeit, die optimale Häufigkeit zu bestimmen, um auf einen bestimmten Tumortyp anzuwenden. Die Prüfung auf die optimale Frequenz erfordert ein Gerät, das die Anwendung unterschiedlicher Frequenzen im Bereich von 100-500 kHz und bei Intensitäten von bis zu 3 V / cm Wurzel mittlerem Quadrat (RMS) zur Zellkultur ermöglicht. Da die TTFields-Anwendung Wärme erzeugt, erfordert das Applikationssystem die Fähigkeit, übermäßige Hitze zu zerstreuen, während die Kontrolle über die Temperatur beibehalten wird.

Mehrere Geräte were im Laufe der Jahre entwickelte für TTFields Anwendung auf Zellkulturen ^{1, 2, 5, 14, 15, 16} zu ermöglichen. In allen diesen Vorrichtungen sind die verwendeten Elektroden wurden isoliert , um die Einschränkungen bei der Verwendung von leitfähigen Elektroden, wie Elektronenaustausch an der Elektrodenoberfläche und die Freisetzung von toxischen Metallionen in das Medium ¹ beteiligt zu vermeiden. Der Hauptunterschied zwischen den verschiedenen Systemen TTFields Anwendung getestet ist die Art der Elektrodenisolation verwendet, wobei entweder Elektroden aus Metalldrähten isoliert mit einem dünnen Film aus einem Isolator ^{2, 14, 15, 16} oder mit einem hohen Dielektrizitätskonstante Material (zB aus, Bleimagnesiumniobat-Blei-Titanate (PMN-PT)) ^6. Während die isolierte Drahtelektrode eine relativ einfache und kostengünstige Lösung für TTFields Anwendung bietet, werden sie durch die Hochspannungs oft begrenzt erforderlich effektive elektrische Feldstärken über der 1 V / cm Schwelle und durch die Oberfläche für die Zell Plattieren zur Verfügung zu erreichen, als der Abstand zwischen den Elektroden ist relativ klein. Systeme auf Basis von Elektroden mit einem hohen Dielektrizitätskonstante Material erfordern eine spezielle Konstruktion und Fertigung Fähigkeiten isoliert, aber sie nicht zu hohen Spannung benötigen und eine größere Fläche für das Zellwachstum zwischen den Elektroden bieten.

Die TTFields in vitro - Anwendungssystem in dieser Arbeit verwendet , gehört zu der letzteren Klasse von Systemen, wobei die Kerneinheit eine Petrischale ist (TTFields dish, siehe Abbildung 1) , die aus hohem Dielektrizitätskonstante Keramik (dh PMN-PT). Zwei Paare von Elektroden sind senkrecht auf dem äußeren wal gedrucktLs einer TTFields Schale, um die Anwendung von elektrischen Feldern aus 2 Richtungen zu ermöglichen. Die Elektroden sind mit einem sinusförmigen Wellenformgenerator und einem Verstärker verbunden, die eine TTFields-Applikation im Frequenzbereich von 50-500 kHz ermöglichen. Um die übermäßige Hitze zu zerstreuen, werden die TTFields-Geschirr in einem gekühlten Inkubator gehalten, wobei die mittlere Temperaturregelung unter ständiger Überwachung der Schalentemperatur und der Einstellung der vom System angelegten Spannung erfolgt. In der Praxis würde die Einstellung des Inkubators auf eine niedrigere Temperatur zu höheren elektrischen Feldstärken führen, da das System die Spannung erhöht, bis die Zieltemperatur innerhalb der Schale erreicht ist. Der Unterschied zwischen der Temperatur innerhalb der Schale und der Inkubatortemperatur kann je nach Temperaturgradienten zu einer gewissen Verdampfung führen; Daher muss das Kulturmedium alle 24 h ausgetauscht werden, um angemessene Wachstumsbedingungen zu erhalten.

Das Protokoll untenBeschreibt das experimentelle Verfahren zur Optimierung der Anwendung von TTFields-Frequenzen auf Krebszellen, so dass eine maximale Reduktion der Zellzahl und eine Verringerung des Potentials der überlebenden Zellen zur Bildung von Kolonien erreicht werden.

Protokoll

1. TTFields In - vitro - Auftragssystem - Grundplatte und Dish Wartung

1. Spülen Geschirr und Küchenabdeckungen unter Leitungswasser ausgeführt wird. Anschließend Spülen mit entionisiertem Wasser und der Luft trocknet Gesicht nach unten.
2. Wenn ein chemotherapeutisches Mittel / Arzneimittel werden in einem früheren Experiment Schalen gegeben worden ist, füllt jede Schale mit einer 5% Licht Detergenzlösung und über Nacht belassen.
   1. Spülen Sie das Geschirr gründlich unter fließendem Leitungswasser alle Spuren von Reinigungsmittel im Inneren der Schale zu vermeiden. Spülen des Geschirrs und Geschirr bedeckt mit deionisiertem Wasser und der Luft trocknen Gesicht nach unten.
3. Legen Sie die sauberen und trockenen Gerichte mit ihren Abdeckungen in Sterilisationstaschen. Siegel und legen Sie die Beutel in einem Autoklaven, wobei die Gerichte dem Gesicht nach unten. Autoklav für 30 Minuten bei nicht höher als 121 ° C.
4. Stellen Sie den Autoklaven auf Trockenprogramm, teilweise um die Autoklaven Tür öffnen, und trocknen, das Geschirr für 30 min.
5. Wischen die Grundplatte mit einem Tuch leicht mit 70% igem Ethanol befeuchtet.

2. Versuchsaufbau

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Geräte und Materialien sind in der Materialliste beschrieben. Alle Schritte unten sollten in einem laminaren Strömungsschrank durchgeführt werden, während die sterilen Bedingungen beibehalten werden.

1. Bereiten Sie saubere und sterile TTFields Geschirr und Abdeckungen, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Wischen Sie die Basisplatte mit einem Tuch leicht angefeuchtet mit 70% Ethanol.
2. Installieren Sie die TTFields-Schalen mit den Abdeckungen auf die Grundplatte, indem Sie sie vorsichtig auf die Schale drücken und im Uhrzeigersinn um ca. 5 mm drehen, bis der Rand der Schale auf die drei Stifte auf der Grundplatte einrastet. Legen Sie ein steriles 22-mm-Deckglas (behandelter Kunststoff oder Glas) auf die Unterseite jeder Schale.
3. Bereiten Sie die Zellsuspension in komplettem Wachstumsmedium vor (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium für U-87 MG und F98, RPMI für A2780 und OVCAR-3, ergänzt wie beschrieben in Materialliste).
   ANMERKUNG: Die cell Konzentrationen hängen von den Zelltypen und Versuchsdauer, 80% -90% konfluente Zellwachstum sollte nicht bis zum Ende des Experiments überschritten werden.
   ACHTUNG: Menschliche Zelllinien können eine biologische Gefahr darstellen und sollen mit den entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen behandelt werden.
4. Platzieren 200 ul Zellsuspension (in der Regel 5.000-20.000 Zellen in 200 & mgr; L für ein 72-h-Experiment, abhängig von der Verdopplungszeit) als ein Tropfen in der Mitte jeden Deckglases und die Abdeckung mit dem Geschirr Deckeln.
5. In einem CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C inkubieren , bis die Zellen anhaften; eine Inkubation über Nacht ist in dieser Phase möglich.
6. Aspirieren die Flüssigkeiten aus dem Drop eine 200- oder 1000-ul-Pipette.
7. Pipette vorsichtig 2 ml kompletten Wachstumsmedium jedes Gericht zu füllen. Verwenden eine sterile Pipettenspitze tippen und sanft auf den Deckkanten gelegentlich unter dem Schieber gefangen, die Luftblasen zu.
8. Decken Sie die Gerichte mit ihren Deckeln und legen Sie sie insIdee einen CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C bis zum Beginn der TTFields-Behandlung.

3. TTFields Anwendung

1. Übertragen Sie die Grundplatten mit den beigefügten TTFields-Schalen in einen gekühlten CO ₂ -Inkubator.
   ANMERKUNG : In vitro TTFields Anwendung erzeugt Wärme; Daher ist ein gekühlter Inkubator erforderlich, um die Erwärmung der Speisen zu kompensieren. Höhere TTFields-Intensitäten erzeugen mehr Wärme und benötigen niedrigere Inkubator-Umgebungstemperaturen (siehe Tabelle 1 ). Klinisch relevante TTFields-Intensitäten werden erreicht, wenn die Inkubatortemperatur für TTFields-Applikation im Bereich von 18-30 ° C liegt.
2. Verbinden Sie die Flachkabel-Buchse mit der Grundplatte. Schalten Sie den TTFields-Generator ein.
3. Starten Sie die TTFields In vitro Applikation System Software und wählen Sie die Experiment Einstellungen.
   1. Definiere ein neues Experiment. Geben Sie den Namen der exp eineriment und das Experiment Besitzer in der Software-Benutzeroberfläche auf dem Computerbildschirm. Justieren der Frequenz und der Solltemperatur für jedes Gericht oder Grundplatte.
4. Starten Sie die TTFields Anwendung mit der Software.
5. Stellen Sie sicher, dass alle Gerichte richtig angeschlossen sind und hellblau auf dem Monitor erscheinen. Wenn ein Gericht mit einem roten Rahmen eingekreist ist (was bedeutet, dass es nicht richtig angeschlossen ist), drücken Sie sie vorsichtig nach unten und drehen sich langsam hin und her, bis die Kontakte wieder hergestellt werden und die Schale erscheint hellblau.
6. Lassen Sie die TTFields in System - vitro - Anwendung ausgeführt wird für bis zu 24 h.
7. Wenn das Experiment seinen Endpunkt erreicht hat, stoppen Sie das Experiment von der Software auf dem END EXPERIMENT-Button klicken und fortfahren 5. Wenn nicht, klicken Sie auf PAUSE Experiment zu treten.
8. Trennen des Flachkabelstecker von der Grundplatte. Entfernen Sie die Grundplatte mit den Gerichten aus dem Inkubator in eine Laminarflowbox.
9. Ersetzen des Mediums in allen dishes alle 24 h und gibt die Basisplatte mit dem Kühlinkubator. Verbinden der Grundplatte mit dem Generator, das Flachkabel verwenden. Weiter das Experiment auf die Schaltfläche WEITER anklicken.

4. Kontrollproben

Hinweis: Wachsen Kontrollzellen unter ähnlichen Bedingungen zu TTFields behandelten Zellen, ohne TTFields Anwendung.

1. Plattenkontrollproben mit der gleichen Suspension und auf einer ähnlichen Oberfläche verwendet zum Plattieren TTFields behandelten Proben.
2. Platzieren Kontrollschalen in einem CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C.
3. Ersetzen das Medium, in dem Geschirr alle 24 h die TTFields behandelter dish Medium Bedingungen anzupassen.

5. Experiment End

1. Nach einem Klick auf END EXPERIMENT, warten, bis die Software alle Datensätze aus dem System abgerufen werden und die Aufzeichnungen auf den Computer zu speichern.
2. Verwenden Sie die Schaltfläche Berichte, die Temperatur, Strom und Widerstand log f Meinungiles jede Basisplatte, um zu überprüfen, dass alle Schalen wurden nach dem Versuchsplan behandelt.
   HINWEIS: Alle Berichte und Protokolle auf dem Computer nach dem Ende des Experiments werden gespeichert und können jederzeit überprüft werden.
3. Schalten Sie den TTFields Generator ausgeschaltet.
4. Trennt das Flachkabel von der Grundplatte entfernen und aus dem Inkubator.
5. Zu entfernen, um eine Keramikschale, nach unten drücken und drehen die Schale gegen den Uhrzeigersinn von der Grundplatte zu entriegeln.
6. Nehmen Sie das Geschirr in einem Laminarflowbox und aseptisch die Deckgläser entfernen. Übertragen sie Petrischalen mit frischem Medium oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) für die weitere Prüfung und Bewertung steril.

6. Auswertung der Wirkung von TTFields

HINWEIS: TTFields' Effekte können auf verschiedene Weise bestimmt werden. Verwenden einer oder mehrerer der folgenden Methoden zu behandelnden Zellen zu unbehandelten Kontrollzellen zu vergleichen:

1. Anzahl der Zellen
   1. Entfernen Sie das Medium / PBS aus jeder Deckglas-haltigen Schale.
   2. Fügen Sie 0,5 ml von 0,25% Trypsin / EDTA zu jeder Schale hinzu und inkubieren Sie für bis zu 10 min ( dh bis die Zellen beginnen, sich von der Deckglasoberfläche zu lösen) bei 37 ° C in einem CO ₂ -Inkubator.
   3. Füge 0,5 ml des kompletten Wachstumsmediums hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen durch sanftes Pipettieren auf und ab zu suspendieren.
   4. Zählen Sie die Zellen mit einer beliebigen Standard-Zellzähltechnik, die kompatibel ist mit der Zählung von niedrigen Zellkonzentrationen ( dh etwa 20.000 Zellen / ml).
2. Clonogener Assay
   1. Eine ähnliche Anzahl von Zellen (100-500 Zellen pro Schale) aus jeder Schale auf neue, sterile Petrischalen oder 6-Well-Platten mit 2 ml frischem, vollständigem Wachstumsmedium auftragen.
   2. Inkubieren in einem CO ₂ -Inkubator bei 37 ° C für 1-3 Wochen (abhängig von den Eigenschaften jeder Zelllinie), bis Kolonien aus ~ 50 Zellen gebildet werden. Bewerte die ZelleAnzahl pro Kolonie durch Lichtmikroskopie.
   3. Entfernen des Mediums und Spülen mit PBS.
   4. Entfernen Sie die PBS und eiskalten Methanol (1 ml) hinzu. Inkubieren bei 20 ° C für 10 min oder länger.
   5. Entfernen Sie das Methanol.
   6. Hinzufügen Kristallviolett-Lösung (0,1% w / v in 25% v / v Methanol in Wasser) versetzt und 20 min inkubieren.
      ACHTUNG: Kristallviolett ist ein potenzielles Karzinogen; Handschuhe tragen, während sie mit Kristallviolett arbeiten.
   7. Entfernen Sie das Kristallviolett, wäscht 3-mal mit entionisiertem Wasser und an der Luft trocknen.
   8. Zählen der Kolonien in jeder Schale ausgebildet ist.

Ergebnisse

Ergebnisse nach TTFields Anwendung, wenn unterschiedliche Frequenzen Abtastung kann basierend auf verschiedenen Assays, wie beispielsweise Zellzahl, kolorimetrische Assays, klonogenen Assays und Untersuchungen über die Veränderungen in der Anzahl der eindringenden Zellen unter Verwendung einer Boyden-Kammer platziert in einer speziellen Hoch Wand TTFields quantifizierbar Zellkulturschale. Eine sorgfältige experimentelle Planung basierend auf vorgegebenen Zellverdopplungszeiten werden die Zellen ermöglichen, die maximale Anzahl von mitotischen Ereignissen während der Behandlungsdauer zu erreichen, so dass die Behandlungsergebnisse zu maximieren.

Figur 2 zeigt eine typische Frequenzabtastung Ergebnis für eine durchschnittliche Zellzählung ( das heißt, die Anzahl der Zellen) und klonogenen Assay von A2780 (dh menschlichen Eierstockkrebszellen; 2A) ⁷ und F-98 (dh, Ratte - Gliom - Zellen;"> Abbildung 2B) ¹ mit zwei direktionalen TTFields (Frequenzbereich: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm und Inkubatortemperatur: 18 ° C). Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Reduktion der Zellzahlen bei allen angelegten Frequenzen , Mit der maximalen Reduktion bei 200 kHz für alle getesteten Zelllinien (Einweg-ANOVA mit Mehrfachvergleich) Die optimale Frequenz, die zu einer höchsten Reduktion des klonogenen Potentials führte, war für A2780- und F98-Zellen gleich ( Abb. 2B und C ) Der Pearson-Korrelationskoeffizient zwischen der Zellzahl und dem klonogenen Effekt bei jeder Frequenz betrug 0,967 (p = 0,002) und 0,755 (p = 0,083) für A2780 bzw. F98.

Fig. 3 zeigt ein Frequenz-Scan-Ergebnis für die durchschnittliche Zellzahl für OVCAR-3 ( dh menschliche Eierstockkrebszellen, Fig. 3A ) und U-87 MG (dh menschliche Gliomzellen; 3B) Zellen , die mit zwei Richtungen der TTFields bei unterschiedlichen Intensitäten behandelt (RMS: 1,7, 1,3 und 1,0 V / cm, jeweils , und Inkubator Temperatur: 18 ° C, 24 ° C und 28 ° C bezeichnet). Die Ergebnisse zeigen, daß, während es immer noch eine signifikante Reduktion der OVCAR-3-Zellen-Zählung nach der Behandlung mit 1,3-V / cm TTFields (Inkubatortemperatur: 24 ° C) ist, ist die Wirkung relativ gering ist im Vergleich zu den Ergebnissen erhalten werden, wenn die Zellen behandelt wurden mit 1,7 V / cm (Inkubator Temperatur: 18 ° C). U-87-MG-Zellen mit 1,0-V / cm TTFields (Inkubatortemperatur: 28 ° C) behandelten auch eine ähnliche Tendenz bei der Reduktion der Zellzahl wie zeigen, wenn sie mit 1,7 V / cm behandelt, aber der Effekt war nicht signifikant bei niedrigeren Intensitäten .

figurE 1 TTFields Geschirr wurden auf eine Grundplatte montiert und mit dem flachen TTFields Steuerkabel verbunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2 Frequency Scans zur Bestimmung der optimalen TTFields-Hemmfrequenz für (A) A2780 und (B) F98 Zellen. Die Zellen wurden für 72 h mit TTFields mit unterschiedlichen Frequenzen (1,7 V / cm und 100-500 kHz) behandelt. Die Wirkung der TTFields-Behandlung wurde unter Verwendung von Zellzahl und clonogenen Assays geschätzt. Der Pfeil zeigt die optimale Frequenz an. Die Ergebnisse stellen Mittelwerte ± SD dar, die auf mindestens 6 Wiederholungen für jede getestete Frequenz basieren. ( C ) Repräsentative Bilder der klonogenen s ffnung auf Überleben von A2780-Zellen nach TTFields Behandlung bei verschiedenen Frequenzen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Frequenz - Scans für die Bestimmung der optimalen Frequenz für inhibitorische TTFields (A) OVCAR-3 und (B) U-87 - MG - Zellen. (:;: 1,0 und 1,7 V / cm U-87 MG 1,3 und 1,7 V / cm OVCAR-3-Zellen) wurden für 72 h mit TTFields unterschiedlichen Frequenzen (100-500 kHz) und Intensitäten behandelt. Die Wirkung der TTFields Behandlung wurde unter Verwendung von Zellzahlen geschätzt. Der Pfeil zeigt die optimale Frequenz. Die Ergebnisse stellen Mittelwert ± SD, basierend auf mindestens 6 Wiederholungen in jeder Frequenz getestet.pg“target =‚_ blank‘> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Inkubator Umgebungstemperatur	Erwartete TTFields Intensitäten
(° C)	(V / cm RMS)
18	1.62
19	1,55
20	1,48
21	1,41
22	1,33
23	1,26
24	1.19
25	1.12
26	1.04
27	0,97
28	0,9
29	0.83
30	0,76

Tabelle 1 Incubator Umgebungstemperatur und der erwarteten TTFields Intensitäten innerhalb des TTFields Schale.

Diskussion

TTFields sind eine aufkommende Anti-Tumor-Modalität, die auf der kontinuierlichen Anwendung von richtig abgestimmten elektrischen Wechselfeldern ^{1 , 2 , 8 , 9 , 10 , 17} basiert. Die Maximierung der Anti-Tumor-Wirksamkeit ist ein wünschenswertes Ergebnis für alle Behandlungsmodalitäten. So kann "Kämpfen" für jeden weiteren Prozentsatz der Krebszellwachstumshemmung einen signifikanten Einfluss auf das langfristige klinische Ergebnis für Patienten haben. Dies ist wegen der erforderlichen kontinuierlichen Natur der TTFields Anwendung und der daraus resultierenden kumulativen Effekt. Die Maximierung der TTFields-Applikation kann auf mehrere Arten erreicht werden: (1) Erhöhung der elektrischen Feldstärke ^{1 , 7} , (2) Verlängerung der Behandlungsdauer ⁵ , (3) Finden der effektivsten Kombinationenauf mit anderen Behandlungsmodalitäten ^{18, 19,} und (4) definiert , um die optimale Frequenz von ^{1, 2, 4, 6, 7.} Maximieren der elektrische Feldstärke an der Stelle des Tumors wird durch die Optimierung der Position der Arrays auf der Haut des Patienten erreicht wird; Dies erlaubt die Lieferung der maximalen Feldstärke an den von der individuellen Anatomie des Patienten basierend Tumor ^20. Eine Verlängerung der Behandlungsdauer beruht vor allem auf dem Patienten - Compliance mit der Behandlung (für mindestens 18 Stunden pro Tag) ^17. Das Finden der richtigen Kombination mit anderen Therapien und die optimale Frequenz Bestimmung stützt sich stark auf in - vitro - Ergebnisse, da keine validierten Marker für TTFields Behandlungsergebnisse derzeit verfügbar sind. In dieser Arbeit haben wir die experimentellen p skizziertenVerwendung des in vitro TTFields Anwendungssystem ERFäHRT erforderlich , um die optimale Frequenz für TTFields Krebszelllinien zu bestimmen. Die hier beschriebenen Methoden können potentiell die Kombination von anderen Krebsbehandlungsmethoden zu screenen , verwendet werden ( zum Beispiel chemotherapeutischen Mitteln oder Bestrahlung) mit TTFields und die optimale Frequenz für TTFields Verabreichung für jede spezifische kombinierte Behandlung zu bestimmen.

Im Einklang mit früheren Veröffentlichungen zeigen die hier gezeigten Ergebnisse , dass die optimale Frequenz für die Behandlung sowohl von Gliomzellen und Eierstockkrebszellen ist 200 kHz ^{1, 7.} In dieser Arbeit haben wir gezeigt, zum ersten Mal, dass die optimale TTFields Frequenz des klonogenen Potential zu reduzieren, ist mit der Frequenz zugeordnet ist, auf die maximale zytotoxische Wirkung führt. Die Verfahren , die in dieser Arbeit verwendet zur Quantifizierung der Auswirkungen von TTFields (dh zytotoxische und klonogenen) are nur zwei von vielen möglichen Standard-Endpunkt-Assays Behandlungsergebnisse zu bewerten. Zusätzliche Behandlungsergebnis Tests umfassen: (1) Fixieren, Färben und die Montage der Deckgläser, auf dem die Zellen über ein Mikroskop zur Visualisierung von intrazellulären Strukturen plattiert sind; (2) Durchführen von Assays für Protein und RNA-Extrakte, entweder aus den TTFields Speisen selbst oder nach dem Deckglas auf einen neuen Einwegschale übertragen; und (3) Trypsinisierung für die Durchflusszytometrie-Analyse gefärbte Zellen.

Eine sorgfältige experimentelle Planung werden die Behandlungsergebnisse nach der Lieferung von TTFields auswirken. Die wichtigsten Schritte sind sicherzustellen, dass die Zellproliferation während des Experiments nicht zu Überwucherung führt und unter Verwendung der geeignete elektrische Feldstärke, als Intensitäten, die zu hoch sind, wenn sie empfindliche Zelllinien angewandt wird in allzu wenig Zellen führen für die erforderlichen Tests zu bestimmen, die optimale Frequenz. Im Gegensatz dazu angewendet TTFields bei sehr niedrigen Intensitätenauf weniger empfindlichen Zelllinien werden in kleinen Wirkungen führen, die durch inhärente Variation maskiert werden kann. Die Behandlungsprotokolle sollten wertvolle Informationen über die Temperaturstabilität, elektrische Ströme und Widerstand für jeden und jedes Gericht während des gesamten Experiments untersucht werden. Ersetzen fehlerhafte Gerichte zu Behandlungsbeginn und ohne Daten von einem Gericht, das die erwünschten Behandlungsparameter nicht erfüllt haben wird Variabilität zwischen den Replikaten minimieren.

Zusammengefasst TTFields ist ein aufstrebender Krebsbehandlungsmethode , die bereits die Wirksamkeit und Sicherheit im klinischen Umfeld unter Beweis gestellt hat ^{8, 9, 10.} Testen TTFields in einer in - vitro - Einstellung unter Verwendung der hier beschriebenen Protokolle können zur Optimierung des TTFields Behandlungsparameters im klinischen Umfeld ermöglichen und kann unser Verständnis des zugrunde liegenden Wirkmechanismus erweitern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
inovitro System und Software	Novocure	ITG1000 und IBP1000	Jedes Gerät enthält 1 TTFields-Generator, 1 Bodenplatte, 8 TTFields-Schalen mit Deckel und 1 Flachbandkabel.
Sterilisationsbeutel	Westfield medical	24882
Kunststoff-Abdeckfolien	Thermo Scientific (NUNC)	174977	Vorbehandelte und sterilisierte
Glasabdeckfolien	Thermo Scientific (Menzel-Gä ser)	CB00220RA1	Ggf
Dulbecco sterilisieren' s modifizierter Eagle" s Medium	Biological Industries (Israel)	01-055-1A	Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
RPMI 1640	Gibco	21875-034	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Fötales Rinderserum (FBS)	Biological Industries (Israel)	04-007-1A	Warm in 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch
L-Glutamin 200 mM (100x)	Gibco	25030-029
Pen/Strep (10.000 U/mL Penicillin, 10.000 & Mikro; g/mL Streptomycin)	Gibco	15140-122
Natriumpyruvatlösung 100 mM	Biological Industries (Israel)	03-042-1B
Hepes-Puffer 1 M	Biological Industries (Israel)	03-025-1B
Insulinlösung aus der Bauchspeicheldrüse des Rinders	Sigma-Aldrich	10516-5ML
0,25% Trypsin/EDTA	Biological Industries (Israel)	03-050-1B	Warm in 37 &°; C Wasserbad vor Gebrauch
Methanol	Merck	1.06009.2511	Abkühlen auf -20 &Grad; C vor Gebrauch im Gefrierschrank
Kristallviolett	Sigma-Aldrich	120M1445	Gesundheitsschädlich. Bereiten Sie 0,1 % w/v kristallviolette Lösung in 25 % Methanol und 75 % Wasser vor.
Leichtes Reinigungsmittel	Alcononx	242985	5%ige Lösung in Wasser oder nach Herstelleranweisung herstellen.
PBS	Biological Industries (Israel)	02-023-1A	Ohne Calcium und Magnesium
A2780	ECACC	93112519	Grow in RPMI 1640 ergänzt mit FBS (10%), Stift/Streptokokken (100  U/ml / 100  &Mikro; g/ml), Natriumpyruvat (1  mM) und Hepes-Puffer (12  mM).
F98	ATCC	CRL-2397	Anbau in Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium, ergänzt mit FBS (10%), Stift/Streptokokken (100  U/ml / 100  &Mikro; g/ml), Natriumpyruvat (1  mM) und Glutamin (2  mM).
Ovcar-3	ATCC	HTB-161	Grow in RPMI 1640 ergänzt mit FBS (20%), Stift/Streptokokken (100  U/ml / 100  &Mikro; g/ml), Natriumpyruvat (1  mM), Hepes-Puffer (12  mM) und Insulin (10  &Mikro; g/mL).
U-87 MG	ATCC	HTB-14	Anbau in Dulbecco s modifizierter Eagle" s Medium, ergänzt mit FBS (10%), Stift/Streptokokken (100  U/ml / 100  &Mikro; g/mL), Natriumpyruvat (1 mM) und Glutamin (2  mM).
gekühlter CO2-Inkubator	CARON	7404-10-3
Laminar-Flow-Schrank	ADS Laminair	Bio12 und VSM12